传染病诊断标准及处理原则（国标）白喉诊断标准及处理原则GB 15997

白喉诊断及处理原则GB 15997—1995 前 言 白喉是由白喉杆菌引起的急性呼吸道传染病。其感染特征为咽、喉、鼻部等处粘膜充血，肿胀并有灰白色假膜形成，以及细菌外毒素引起的全身中毒症状，严重者常合并心肌炎和末梢神经麻痹。由于白喉菌苗(百白破三联制剂)的广泛应用，典型白喉逐渐减少，不典型白喉或轻型白喉日渐增多，尤其成人白喉的发病应引起关注。 本标准在制定过程中，参考了1989年卫生部制定的《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》，尽量结合我国流行病学，临床实践和各地情况，以便易于实施和应用。 本标准的附录A是标准的附录； 本标准的附录B、附录C都是提示的附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 本标准起草单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所、北京市地坛医院、首都儿科研究所。 本标准主要起草人：张荣珍、杨立信、王树山。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。 1 范围 本标准规定了白喉的诊断标准和处理原则。 本标准适用于各级、各类医疗、卫生、保健机构和人员对白喉病人的诊断、报告和处理。 2 诊断原则 应根据流行病学资料、临床现及咽拭子细菌学涂片结果做出临床诊断；确诊则需白喉杆菌培养阳性，且证明能产生毒素或检出白喉特异性抗体。 3 诊断标准 3.1 流行病学史 白喉流行地区，与确诊白喉病人有直接或间接接触史。 3.2 临床症状 发热、咽痛、鼻塞、声音嘶哑、犬吠样咳嗽。鼻、咽、喉部有不易剥落的灰白色假膜，剥时易出血。 3.3 实验室诊断 3.3.1 白喉棒状杆菌分离培养阳性并证明能产生外毒素，见附录A。 3.3.2 咽拭子直接涂片镜检可见革兰氏阳性棒状杆菌，并有异染颗粒。 3.3.3 病人双份血清特异性抗体四倍以上增长，见附录C。 3.4 病例分类 3.4.1 疑似病例 具有3.2者。 3.4.2 临床诊断病例 疑似病例加3.3.2，参考3.1。 3.4.3 确诊病例 疑似病例加3.3.1、3.3.3任何一条者。 4 防治原则 4.1 对病人的隔离 发现疑似或诊断病例，应立即隔离，隔离期至症状消失后，咽拭子两次细菌培养阴性为止，或症状消失后14d。 4.2 终末消毒 病人隔离后对病家以及病愈出院后，对其病室均应进行终末消毒。可用含氯消毒剂。 4.3 治疗原则 4.3.1 尽早，一次足量给予白喉抗毒素。抗生素首选青霉素杀灭病原菌，减少毒素的分泌。 4.3.2 采取对症治疗和防治并发症，特别是心肌炎的防治。 4.4 对易感者的应急措施 4.4.1 对病人周围未发病的易感人群，应采取应急接种白喉类毒素。 4.4.2 对体弱多病的易感儿则可在锡克氏试验(白喉毒素皮肤试验)阳性后肌注白喉抗毒素。 4.4.3 对密切接触者，应检疫7d。对细菌培养阳性的带菌者，应给予抗生素治疗。 4.5 白喉的免疫预防 在白喉流行地区，用白喉类毒素应急接种，对控制流行效果十分显著。按照我国现行的免疫程序，做好常规基础免疫和加强免疫，并保证接种质量，就能控制白喉的发生。 附录A (标准的附录) 白喉病原学诊断方法 A1 白喉杆菌的分离培养和鉴定 从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。 A2 标本的采集 A2.1 病人 以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试管内同时送检。 A2.2 带菌者或疑似病人 由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送检。 A3 鼻咽拭子接种吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基等作细菌培养观察鉴定 A3.1 菌型 革兰氏阳性细长杆菌呈棒状，排列不规则，常呈人字形、栅栏状。庞氏染色可见异染颗粒。 A3.2 培养及生化特性 白喉杆菌在血平板上形成灰白色、圆形光滑菌落，有溶血环。在亚碲酸钾血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，边缘带灰色。在尿素卵黄双糖培养基上，经37℃12～48h培养后可做初步鉴定。白喉杆菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇，一般不分解蔗糖。不产生吲哚，能还原硝酸盐，酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不分解尿素。重型白喉杆菌能分解淀粉、糖原和糊精，迟缓分解蔗糖。依据形态、培养、生化特性可将白喉杆菌分为轻、中、重三型。 A4 毒力试验 白喉是由白喉杆菌引起的急性传染病，其致病因素为外毒素。抗原性强，毒性剧烈。白喉杆菌不是所有菌株都有毒力，只有那些携带β－棒状杆菌噬菌体的菌株才能产生外毒素。毒力试验可测定白喉杆菌产生外毒素的能力，常用的方法有两种。 A4.1 艾立克(Elek)氏平板毒力试验 将Elek培养基加热熔化，冷却至50℃左右，加入正常无菌(兔或牛)血清2mL，混匀后用无菌镊子取预先制好的白喉抗毒素(每毫升含5000～10000u)，干燥滤纸条贴于平板中央表面，置37C孵箱内约0.5h，烘干表面水分，时间不宜过长，以免影响结果。 将试验菌株划线接种于平板上成一直线，使其与抗毒素滤纸成直角相交。同一平板可同时接种4～5个标本。同时要用已知有毒菌株作阳性对照。于37℃培养48～72h，如发育良好即可观察结果。阳性者于距纸条稍远处沿接种线开始有絮状沉淀弧出现。若干72h仍未出现沉淀弧者可作阴性报告。 A4.2 豚鼠皮内接种毒力试验 将待试菌株接种吕氏血清斜面，于37℃培养16～18h，加肉汤1mL，刮下菌苔，使成悬液，吸取此菌液0.5mL，加入3.5mL肉汤中，混匀后即可应用。同时要用已知有毒菌株作对照。 选体重250g左右豚鼠两只，一只在试验前24h腹腔注射白喉抗毒素1000u，作为对照动物；另一只不注射抗毒素，作为试验动物。接种前先将动物腹部向上，固定在架上。以温水洗净腹部后剃毛。剃毛后再用无菌生理盐水擦洗一次待干，用1mL注射器吸取菌液，准确注射0.1mL于皮内，可同时接种6～8株菌。注射后4h，给试验动物注射抗毒素4000u，以免因毒株毒力太强而致死。 注射后经24、48、72h，各观察皮内反应一次。对照动物无论接种有毒或无毒菌株，均应无局部反应；试验动物在注射有毒株的部位，于24h呈红肿，48h在红肿部位边缘有化脓性病变，72h可见硬块，出现灰黑色坏死斑，无毒的菌株则无病变。动物毒力试验也可应用家兔及小鸡作试验动物。 附录B (提示的附录) 白喉毒素试验(锡克氏试验) 白喉毒素试验可用于测定机体对白喉的易感性及判断白喉预防接种后是否产生免疫力。 B1 方法 在两前臂掌侧上1/3处，左臂皮内注射白喉毒索液0.1mL，右臂皮内注射对照液0.1mL。 B2 反应的观察与判断 阴性反应：两臂注射处无任何反应为阴性反应。两臂注射处稍有红色硬块，颜色较浅，界线不清，红色消退快，不留痕迹，在24～36h最为显著，48～72h基本消退，为假阳性。阴性和假阳性反应表示对白喉有免疫力，但感染量大时仍可得病。 阳性反应：注射对照液处呈阳性反应或假阴性反应(48～72h基本消退)，而注射试验液处呈现红色团块，界线分明，直径达1cm以上，通常于注射后24～48h开始出现，72～96h最明显，7d以后逐渐消退，遗留一个褐色斑，数周至数月后可以退净。阳性反应表示对白喉无免疫力。 附录C (提示的附录) 血清学诊断方法 C1 间接血凝法测定白喉抗体 C1.1 原理 间接血凝法是利用红血球作为载体，并经过一定处理后，使蛋白质抗原吸附于红血球表面，此种血球称为致敏血球。然后用致敏血球来测定相应的微量抗体。当特异抗体存在时，发生抗原抗体结合，血球就出现凝集，为阳性反应。 C1.2 材料 C1.2.1 抗原 作致敏血球用。白喉类毒素含量为20～30Lf/mL以上。 C1.2.2 标准抗毒素 每毫升含10个国际单位，用以测定致敏血球效价，用前须进行56℃，30min灭活。 C1.2.3 血球 健康绵羊血球(血球保存液保存)。 C1.2.4 试验溶液配制 C1.2.4.1 0.15mol/L磷酸盐和食盐溶液配制 C1.2.4.1.1 0.15mol/L Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终) Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O(M.W＝358.16) 53.72g 蒸馏水至 1000mL C1.2.4.1.2 0.15mol/LKH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终) KH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)(M.W＝136.09)　　　　　　　　　　　 20.41g 蒸馏水至 1000mL C1.2.4.1.3 0.15mol/LNaCl NaC1(M.W＝58.45) 8.77g 蒸馏水至 1000mL C1.2.4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S) 0.15mol/LNa(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)　 　　　　　　　　　　　286mL 0.15mol/LKH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)　　　　　　　　　　　　　 90mL 0.15mol/LNaCl 376mL 配后测pH值，灭菌后备用。 C1.2.4.3 pH6.4磷酸盐缓冲液(P.B.S) 0.15mol/LNa(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终) 　　　　　　　　　　　　 100mL 0.15mol/LKH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)　　　　　　　　　　　　　 210mL 0.15mol/LNaCl 310mL 配后测pH值，灭菌后备用。 C1.2.4.4 pH8.2磷酸盐缓冲液(P.B.S) 0.15mol/LNa(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)　　　　　　　　　　　　　97mL 0.15mol/LKH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)　　　　　　　　　　　　　 3mL 配后测pH值，灭菌后备用。 C1.2.4.5 戊二醛稀释液 pH8.2磷酸盐缓冲液(P.B.S) 100mL 0.15mol/LNaCl 900mL 蒸馏水 500mL 灭菌后放冷库备用。 C1.2.4.6 1％戊二醛溶液 25％戊二醛溶液 4mL 戊二醛稀释液 96mL C1.2.4.7 1％鞣酸溶液 鞣酸 1g 蒸馏水加至 100mL 4℃避光保存可用一周，用前以生理盐水稀释至1∶20000。 C1.2.4.8 血球保存液 葡萄糖 2.05g 枸橼酸钠 0.8g NaCl 0.42g 蒸馏水加至 100mL 测pH，需用10％枸橼酸校正至pH6.15，于0.7kPa消毒20min。 C1.3 致敏血球制备 C1.3.1 血球采集与处理 选择健康绵羊静脉采血，注入血球保存液中(血球与保存液比例为1∶1)，摇匀放冷库(2～8℃)48h，离心弃上清，用生理盐水洗涤血球三次，每次离心(2000～2500r/min)20～25min，弃上清得压积血球。 C1.3.2 血球醛化 取上述压积血球1份，加入24份冷却的1％戊二醛溶液中，放2～6℃，固定时间大于等于30min，每5～6min摇动一次，离心(2000r/min，10min)弃上清，用生理盐水洗五次，再用蒸馏水洗五次，最后用生理盐水配成10％血球悬液，加入1∶10000硫柳汞防腐，放2～8℃冷库备用。 C1.3.3 血球致敏 10％醛化血球悬液，白类用pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S)稀释至2.5％后进行鞣酸处理。 a)鞣酸处理 2.5％血球一份加1∶10000的鞣酸一份，混匀后放45℃或37℃水浴30min(每5～6min摇一次)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S)洗涤三次(2000～2500r/min，5～6min)，最后用pH6.4磷酸盐缓冲液(P.B.S)配成2.5％鞣化血球悬液。 b)致敏 2.5％鞣化血球一份加精制白喉类毒素一份(25Lf/mL)加pH6.4磷酸盐缓冲液(P.B.S)三份置45℃或37℃水浴30min(须经常摇动)，离心弃上清，用0.5％兔血清生理盐水洗涤二次，再用0.5％兔血清生理盐水配成2.5％血球悬液。 C1.3.4 对照血球制备 2.5％鞣化血球一份加4份pH6.4磷酸盐缓冲液(P.B.S)置45℃或37℃水浴30min(须经常摇动)，离心弃上清，用0.5％兔血清生理盐水洗涤血球二次，再用兔血清生理盐水配成2.5％对照血球悬液。 C1.4 效价滴定 C1.4.1 致敏血球、敏感度的测定 将标准白喉抗毒素用0.5％兔血清生理盐水先行稀释使每毫升含1个单位，然后再以倍比法进行一系列稀释，自1∶2～1∶4096，每个稀释度取一滴(0.025mL)加入血凝板孔中，再加入致敏血球一滴(0.025mL)，摇匀放37℃2h，取出判读结果或放冰箱，次晨判读结果，以“＋＋”为凝集试验终点。白喉类毒素致敏血球的敏感度不能低于0.003 906 IU/mL。同时作两种对照： a)不同稀释度抗血清加鞣化血球，以检查抗血清有无非特异性凝集； b)0.5％兔血清生理盐水加致敏血球以检查血球有否自凝作用。以上两种对照皆为阴性试验才能成立，否则应重试。 C1.4.2 待检血清处理 a)经56℃30min灭活。 b)醛化血球吸收。吸收方法：待检血清1份加50％醛化血球2份，放37℃ 1～2h，离心沉淀，吸取上清即为1∶2稀释的血清样品。 C1.4.3 待检血清滴定 先在血凝板中每孔加入0.5％兔血清生理盐水一滴(0.025mL)，再将待检血清用微量滴管滴入第一孔中(0.025mL)，使与0.5％兔血清生理盐水混合，注意不要发生气泡，混匀血清后，每孔均取0.025mL，加入到第二孔中。混匀后自第二孔中吸出0.025mL到第三孔中，如此类推，最后一孔取出0.025mL弃掉。或用0.025mL的稀释棒自第2孔开始作系列稀释。用微量滴管吸取0.025mL0.5％致敏血球加到每个孔中，加时滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后摇匀，放37℃ 2h取出，放2～10℃冰箱内次日晨判读结果，以“＋＋”为凝集试验终点。每份待检血清可做三个稀释度抗血清加鞣酸血球的对照，稀释方法如前所述(即1∶2，1∶4，1∶8)，以排除血清中非特异凝集。 C1.4.4 结果计算 待检血清单位＝待检血清终点稀释度×标准血清终点稀释度所含单位数。例如标准白喉抗毒素(10 IU/mL)终点稀释度为1∶2048，含有0.004 8 IU/mL，而待检血清终点稀释度为1∶8，于是其单位为0.038 IU/mL。 C1.4.5 结果判定标准 a)凝集的红血球均匀地铺在孔底形成一薄层为“＋＋＋＋”； b)凝集的红血球基本同a)，只是在此薄层的底部有一很弱红圈为“＋＋＋”； c)凝集的红血球在孔底形成的薄层，同时中间可见一松散的红圈为“＋＋”； d)凝集的红血球在孔底形成一圆圈，周围可见少量的红血球比对照圆圈稍大为“＋”； e)血球在孔底形成紧密的圆圈成圆点为“－”。影响血凝试验的准确性与敏感度因素很多，如用具的清洁，材料的标准化，操作的细致等。 C2 酶联免疫吸附试验检测白喉毒素抗体 C2.1 原理 利用包被在固相载体上白喉类毒素捕捉待检血清中相应抗毒素抗体，再用酶标记的抗人IgG抗体去掉反应(抗原－抗体－酶标记抗抗体)，利用底物使酶显色而测知是否存在抗体。 C2.2 材料 C2.2.1 抗原 精制白喉类毒素1110Lf/mL。 C2.2.2 结合物 羊抗人IgG酶标记抗体。 C2.2.3 载体 1cm×4cm聚苯乙烯塑料管平底带盖。 C2.2.4 底物 邻苯二胺。 C2.2.5 参考血清 多份间接血凝法阳性高效价血清混合为阳性参考血清，多份阴性血清混合为阴性参考血清。 C2.2.6 被检血清 白喉暴发流行区的病人和健康者。 C2.2.7 测定仪 721型分光光度计。 C2.3 方法及步骤 C2.3.1 包被抗原量及被检血清最适稀释倍数的确定 用阳性及阴性参考血清与抗原作方阵式滴定，确定本试验包被抗原浓度为20μg/mL，被检血清最适起始稀释度为1∶40。 C2.3.2 参考血清标准曲线绘制 阳性及阴性参考血清均从1∶40开始至10240二倍法稀释，反应结果用721型分光光度计测光密度OD值，γ＝492nm。本试验取三次测定结果的均值，以血清稀释度为横坐标，相对应的OD值为纵坐标，画曲线；然后用相关回归法确定OD值与血清稀释倍数相对应的标准曲线。阳性血清最高OD值为0.6，最低为0.1。因阳性和阴性血清呈明显差别的界限OD值为0.3处，故确定OD值大于等于0.3为阳性，其所对应的血清稀释度为1∶2560，即为一个单位。每份被检血清稀释度为1∶40，效价从标准曲线查出。经测算，两系数的P值皆小于0.01。 C2.3.3 抗原包被 每管加已稀释好的抗原1.0mL，放4℃过夜，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液(P.B.S)－吐温20洗涤三次，两次之间静止3min。 C2.3.4 加被检血清1.0mL，置室温2h，再洗涤三次，方法同前。 C2.3.5 加结合物(1∶8000)1.0mL，室温2h，洗涤同前。 C2.3.6 加底物液(0.04％)1.0mL，室温下30min，加2mol/L硫酸0.015mL，如终止反应立即测OD值。 C3 固相放射免疫法测白喉抗体 C3.1 基本原理 固相放射免疫法(SPRIA)是应用双抗体法，以纯化的白喉类毒素吸附到固相载体上，加入特异性抗血清，载体上形成抗原－抗体复合物。然后再加入标有同位素的第二抗体，就形成抗原－抗体－抗抗体复合物，通过测定标记的第二抗体的放射性就可确定相应抗体的含量。 C3.2 材料和方法 C3.2.1 血清标本来源 人群白喉抗体水平检测对象，多为采集儿童血清标本。 C3.2.2 精制白喉类毒素进一步纯化，经Sephadex　G－200过滤，测其浓度。 C3.2.3 抗血清(标准品) C3.2.4 第二抗体及标化法 以马抗人IgG(经纯化)作为第二抗体，参照格林伍德(Gree Wood)和亨特(Hunter)的高比度标化法进行放射碘化标化获得的(上标始)125(上标终)I－马抗人IgG。 C3.2.5 固相载体 U型聚氯乙烯软塑料板。 C3.2.6 缓冲液及填充液 a)缓冲液：PBST，即含0.05％吐温20的0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲盐水。 b)稀释液：PBST－BSA，即在缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白。 c)填充液：PBS－BSA，即在稀释液中减去吐温20。 C3.3 操作方法 C3.3.1 包被抗原，用碳酸缓冲液(pH9.6)将精制白喉类毒素稀释成5μg/mL，加入聚氯乙烯板各孔 100μL，置4℃冰箱过夜。 C3.3.2 将抗原溶液甩净，用PBST洗5次，每1次静置1min左右，每孔加满填充液，将板放入湿盒内，37℃孵育1h，通过水泵将填充液吸净。 C3.3.3 每孔加入用PBST－BSA1∶20稀释的血清标本100μL(做双份)，37℃孵育2h，吸掉孔内液体，用PBST洗5次。 C3.3.4 每孔加入20万CPM(上标始)125(上标终)I标记的马抗人免疫球蛋白((上标始)125(上标终)I－IgG)100μL，37℃保温2h，吸掉液体后用PBST洗5次，吸净待干。 C3.3.5 用剪刀将聚氯乙烯软塑料板上的各孔剪下来，进行γ放射性测量，每孔计数1min。 C3.3.6 以不同稀释度的标准品所得结果在坐标纸上划出标准曲线，用每份标本双孔的平均值，在标准曲线上查出相应的抗毒素IU/mL。