产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

南  阳 理  工  学  院 本科生毕业论文 学    院： 生化学院          专    业： 生物工程          学    生： 范振前            指导教师： 李入林            完成日期  2009 年 6 月 南阳理工学院本科生毕业论文 产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化 Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization 总    计：  18 页     格：  4  个 插    图 ： 6  幅 南阳理工学院本科生毕业论文 产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化 Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization 总    计：  18 页 表    格：  5  个 插    图 ： 5  幅 学 院（系）：            生化学院              专      业：          生物工程              学 生 姓 名：          范振前                学      号：          15407017              指 导 教 师（职称）：  李入林（副教授）    评 阅 教 师：                                      完 成 日 期：            2009-05-30              南阳理工学院 Nanyang Institute of Technology 产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化 生物工程专业 范振前 [摘 要] 本课以产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌为出发菌株，研究其摇瓶分批发酵的最优液体发酵培养基，通过单因素实验确定发酵培养基中最佳碳、氮源分别为蔗糖和蛋白胨，其浓度分别为3%和6%。利用旋转回归法研究枯草芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶的2个重要因素：蔗糖、蛋白胨对α-淀粉酶活力的影响，并拟合出回归方程。经回归分析表明，蔗糖、蛋白胨的含量及其配比对α-淀粉酶活力有显著影响。 由响应面优化实验设计得出最优液体发酵培养基组成为：蔗糖3%、蛋白胨6%、磷酸氢二钾0.8%、硫酸铵0.4%、无水氯化钙0.2%。条件：pH值7.0，温度37℃；此条件下α-淀粉酶活性显著提高并可达到391.66u/L。 [关键词] 枯草芽孢杆菌  SAS 优化  α-淀粉酶 Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization Biological Engineering Major　FAN  Zhen-qian Abstract: subject to the production of α-amylase from Bacillus subtilis strain for the study of its shake-flask batch fermentation liquid of the optimal fermentation medium, Single factor experiments to determine the best fermentation medium carbon and nitrogen sources were sucrose and peptone, and its concentration was 3% and 6%. Study on the use of rotational regression fermentation of Bacillus subtilis α-amylase production of two important factors: sucrose, peptone of α-amylase activity, and fitting a regression equation. By regression analysis showed that sucrose, peptone content and the ratio of α-amylase activity has a significant influence. From the experiment of response surface optimization design include the optimum composition of the liquid fermentation medium: sucrose 3%, 6% peptone, 2 potassium hydrogen phosphate 0.8%, 0.4% ammonium sulfate, anhydrous calcium chloride 0.2%. Conditions: pH value of 7.0, temperature 37 ℃; these conditions α-amylase activity significantly increased and reached 391.66u / L. Key words: Bacillus subtilis  SAS optimization  α-amylase 目  录 1 引言    1 1.1 枯草芽孢杆菌简介及应用    1 1.1.1 枯草芽孢杆菌简介    1 1.2.2 枯草芽孢杆菌应用    1 1.2 α-淀粉酶简介及应用    2 1.2.1 α-淀粉酶简介    2 1.2.2 α-淀粉酶在工业上的应用    3 1.3 课题背景    4 1.4 国内外研究现状及发展动态    4 1.5 本课题的研究方法及目的    5 1.5.1 本课题研究方法    5 1.5.2 研究目的    5 2 研究内容    6 2.1 材料与方法    6 2.1.1 菌种    6 2.1.2 培养基    6 2.1.3 主要试剂    6 2.1.4 主要仪器    6 2.1.5 分析测定方法    7 2.2 结果与分析    8 2.2.1 菌种对数生长期的确定    8 2.2.2 菌种最佳发酵周期的确定    9 2.2.3 单因素实验结果    10 2.2.4 预备试验设计及结果    11 2.2.5 响应面法实验设计结果    12 2.2.6 数据分析    12 2.2.7 采用岭脊分析寻求蔗糖与蛋白胨的最佳配比    13 2.2.8 验证试验    14 3 结 论    15 参考文献    16 致谢    17 附录    18 1 引言 1.1 枯草芽孢杆菌简介及应用 1.1.1 枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌（Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae) 的模式菌株[2]，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。 1.2.2 枯草芽孢杆菌应用[3] 枯草杆菌(B acillus Subtilis) 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。 1　枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。 2　枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平， 现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。 3　枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料 枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。 4　枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。 5　枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用 研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。 6　枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等) ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等) ，后分解为更小分子的有机物 ，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD ，使水体中氨基氮(NH3-N) 、亚硝基氮(NO2-N) 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。越来越多研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。 1.2 α-淀粉酶简介及应用 1.2.1 α-淀粉酶简介 α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。其国际酶学分类编号为EC.3.2.1.1。作用于淀粉时可从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称之为α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子的内部随机切开α-1，4 糖苷键，起液化作用的一类酶。 1.2.2 α-淀粉酶在工业上的应用 α-淀粉酶在淀粉加工、食品、医药、发酵及酿造、制糖和纺织等工业上应用广泛，它是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一，工厂上都以微生物发酵法为主进行大规模生产。目前，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产α-淀酶，对于人类的生产、生活具有十分重大的现实意义。 1　面包焙烤工业，作为保鲜剂 酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。最近几十年，麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业。这些酶用于面包工业，可以使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软。