灵芝多糖对前列腺素e2抑制小鼠脾细胞增殖及il1α, il2 mrna表达的拮抗作用

灵芝多糖对前列腺素e2抑制小鼠脾细胞增殖及il1α, il2 mrna表达的拮抗作用 灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增 殖及IL 1α, IL 2 mRNA表达的拮抗作 用         &nb sp;             作者:张群 雷林生 余传林 吴曙光  【摘要】  【目的】观察灵芝多糖,GLB,对前列腺素E2,PGE2,抑制小鼠脾细胞增殖及IL 1α、IL 2 mRNA表达的拮抗作用。【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型～四甲基偶氮唑盐,MTT,法细胞增殖程度～半定量逆转录聚合酶链反应,RT PCR,法检测IL 1α及IL 2 mRNA的表达水平。【 结果】PGE2连续作用48h后～脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用～当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P,0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L～并合用不同浓度的GLB,25、50、100、200mg/L,～当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2,20 μmol/L,的抑制作用(P,0.05);培养8h及12h后～PGE2,20 μmol/L,可抑制IL 1α及IL 2 mRNA的表达～GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用,P,0.05或P,0.01,。【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素 E2对小鼠脾细胞增殖及IL 1α和IL 2 mRNA表达的抑制作用。 【关键词】  灵芝多糖/药理学, 肿瘤/中药疗法, 肿瘤/免疫学, 细胞培养     灵芝,Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.),是灵芝菌科灵芝属真菌。文献报道,1-3,～灵芝多糖,GLB,是灵芝中主要的生物活性成分之一～其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂～其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌,4-5,或刺激巨噬细胞,6,分泌前列腺素E2(PGE2)～后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。藉此～肿瘤得以逃避免疫系统的攻击～在体内无限生长。本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL 1α和IL 2 mRNA表达的影响～探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。现报道如下。     1  材料与方法     1.1  动物  C57BL/6j及 BALB/c小鼠,SPF级,～8，10周龄～雌雄兼用～购自南方医科大学实验动物中心～合格证号分别为:2005A044和2005A046。     1.2  药品与试剂  RPMI 1640培养基,GIBCO公司产品,,新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司产品,,HEPES,MDBio, Inc分装,,四甲基偶氮唑盐,MTT,、焦碳酸二乙酯,DEPC,、前列腺素E2,PGE2,均为Sigma产品,RNAoutTM,深圳市华氏生物技术有限公司产品,,傻瓜逆转录,RT,反应体系,AccuPower RT PreMix～ 内含逆转录酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制剂、缓冲剂等,, 傻瓜聚合酶链反应,PCR,体系,PCR PreMix～内含Tag DNA聚合酶、dNTPs、PCR增强剂、缓冲剂、上样染料及稳定剂,均购自赛百盛公司,Oligo d T 18(TaKaRa 产品),琼脂糖,Biowest Agarose, 上海YITO生物器材企业有限公司分销,,溴化乙锭(EB, 上海博彩生物工程公司产品),GLB参照文献方法,7,提取～为多糖组分～呈浅棕色～易溶于水～分子量7 000，9 000D。其他化学试剂均为分析纯。     1.3  仪器  311型CO2培养箱,美国Forma Scientific 公司,,AB 120型电子 分析天平,美国Denver Instrument公司,,连续波长酶标仪,Bio RAD公司,,CS 15R台式低温高速离心机,Bechman公司,,PTC 100TMPCR循环仪,美国MJ Research. Inc.公司,,Power PAL3000电泳仪,Bio RAD公司,,凝胶成像分析系统(法国Ets VILBER LOURMAT公司,。     1.4  方法     1.4.1  混合淋巴细胞培养  参照文献,8,进行。     1.4.2  MTT法检测细胞增殖程度  参照文献,8,进行。结果用570nm处的光密度(D570)值表示。     1.4.3  总RNA提取  根据试剂盒说明书所提供的按比例缩小进行操作。于96孔板中～每孔加RNAoutTM试剂40μ,～每组收集10孔裂解液于0.5m,Eppendorf管中～提取总RNA。     1.4.4  逆转录反应  DEPC处理水配制的Oligo dT18 (10 nmol/L)与DEPC处理水 配制的总,,, ,0.1 mg/L,按体积比1?1混合于Eppendorf管中～70?孵育5min～,?冷却,min。吸取上述混合液20μL加入AccuPower RT PreMix 管中～振荡混匀～加石蜡油15μL～1000r/min离心3s～臵PCR循环仪中反应。反应参数如下:42?、60min～94?、5min。     1.4.5  PCR扩增   PCR引物采用在线软件Primer 3进行设计。小鼠IL 1α:上游引物 5’ GCATCCTCACAGCAGGATTT 3’～下游引物 5’ GAATCCAGGGGAAACACTGA 3’～PCR扩增产物为354bp。小鼠IL 2:上游引物5’ AAGCTCTACAGCGGAAGCAC 3’～下游引物5’ TCATCGAATTGGCACTCAAA 3’～PCR扩增产物为348bp。小鼠β actin:上游引物 5’ CCAGAGCAAGAGAGGTATCC 3’～下游引物 5’ GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA 3’～PCR扩增产物为216bp。经预实验发现IL 1α和IL 2 mRNA的表达丰度约为β actin的1/5左右～为了使被检测基因的扩增速率与β actin的扩增速率基本一致～均处于指数扩增 1范围从而防止平台效应～在进行β actin基因扩增时～将逆转录第1链cDNA 产物稀释5倍～其他条件与被检测基因相同～操作如下:在PCR PreMix 管中加入消毒双蒸水8μL,  被检测基因mRNA逆转录产物2 μL或内参β actin mRNA逆转录产物经5倍稀释后2 μL～相应的上、下游引物各5μL(15pmol)～振荡混匀～加石蜡油15μL～1000r/min 离心3s～臵PCR循环仪中反应。反应参数如下: 94?预变性2.5min, 然后进入以下28个循环:94?变性45s～57?退火1min～72?延伸1.5min。循环完毕～72?延伸5min。     1.4.6  半定量分析  取被检测基因和β actin RT PCR扩增产物上样于20g/L琼脂糖凝胶,含溴化乙锭0.5g/L,梳孔中～采用0.5倍Tris 硼酸电泳缓冲液～在3V/cm电压条件下电泳50min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中～在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度(I)值。结果表示为:p=,I检测基因/,Iβ actin×5,,×100%。     1.5  统计学方法  采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。混合淋巴细胞培养反应数据的显著性差异采用独立样本t 检验,PCR半定量数据采用配对样本t 检验。     2  结果     2.1  PGE2对混合淋巴细胞培养反应,MLR,抑制作用的造模浓度  将C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞按体积比1?1混合作为MLR模型～PGE2连续作用48h后～小鼠脾细胞增殖受到不同程度的抑制作用～浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P,0.01)。根据表1结果～选择PGE2抑制模型的造模浓度为20 μmol/L。     2.2  GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用  在MLR中～固定PGE2的浓度为20 μmol/L～再加入不同浓度的GLB,200、100、50、25 mg/L,～观察GLB对PGE2的拮抗作用。培养48h后～当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用(P,0.05)～但不能恢复至正常水平～结果见表2。     2.3   GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 1α mRNA表达的拮抗作用  培养8h后～GLB,200  mg/L,可明显促进IL 1α mRNA的表达～而PGE2,20 μmol/L,抑制IL 1α mRNA的表达。两者合用～GLB为100、200 mg/L的浓度时均可部分对抗PGE2对IL 1α mRNA表达的抑制作用～结果见图1、表3。     2.4  GLB对PGE2抑制MLR中 脾细胞IL 2 mRNA表达的拮抗作用  培养12h后～ GLB,200 mg/L,同样可以促进IL 2 mRNA的表达～而PGE2,20μmol/L,产生抑制作用～结果两者合用～GLB,100、200mg/L,也可部分对抗PGE2对IL 2 mRNA表达的抑制作用～结果见图2、表4。表1  PGE2对MLR中小鼠脾细胞增殖的抑制作用统计方法:t检验,?P,0.01～与阴性对照组比较 表2  GLB拮抗PGE2对MLR中脾细胞增殖的抑制作用统计方法:t检验,?P,0.01,与阴性对照组比较, ?P,0.05～与PGE2组比较表3  GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 1αmRNA表达的拮抗作用统计方法:t检验,?P,0.05～?P,0.01～与阴性对照组比较,?P,0.05～?P,0.01～与PGE2组比较表4  GLB对PGE2抑制MLR中脾细胞IL 2 mRNA表达的拮抗作用统计方法:t检验,?P,0.05～?P,0.01～与阴性对照组比较,?P,0.05～与PGE2组比较 3  讨论     肿瘤发生发展的机制十分复杂～其中有些肿瘤能释放出一些可溶性免疫抑制因子～降低宿主免疫力～从而逃避免疫系统的监视。PGE2是众多免疫抑制因子中最重要的一种～合成PGE2的限速酶是环氧化酶 2(COX 2), 许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有COX 2基因的扩增及其蛋白的高表达, 如结直肠腺瘤和腺癌、胃肠上皮化生和胃癌、食管癌、慢性肝炎和肝细胞肿瘤、胰腺癌、口腔黏膜白斑和头颈部肿瘤、腺瘤样不典型增生和非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、光化性角化病和皮肤癌、胶质瘤等,9-10,。有些肿瘤除了本身合成和释放PGE2以外～还刺激宿主巨噬细胞产生PGE2,6,。可见～产生PGE2抑制宿主的免疫功能～从而逃避免疫系统的攻击是众多肿瘤得以无限生长的重要机理之一。PGE2对免疫系统的抑制作用广泛而深重～如抑制白介素1,IL 1,,11,和白介素2,IL 2,,12,的产生等。在特异性免疫反应中～巨噬细胞在呈递抗原的同时～合成和释放IL 1～IL 1再作用于T辅助细胞产生IL 2～后者产生广泛的免疫调节作用～包括促进前体细胞毒T细胞的活化～并分化为具有杀伤活性的效应细胞毒T细胞(Tc)～Tc在肿瘤免疫中发挥重要作用。     混合淋巴细胞培养反应,MLR,是同种异型抗原诱发的特异性免疫反应模型～具有特异性免疫应答的一般特征～实验操作简单、方便～得到的结果具有较好的指导意义。本研究结果显示PGE2可抑制MLR中小鼠脾细胞的增殖～抑制IL 1α和IL 2 mRNA的表达～这些结果 与以往采用其他模型的研究结果相一致,11-12,～说明本研 究的模型是可靠的。     灵芝多糖的免疫增强作用和抗肿瘤 作用已得到广泛的研究和证实～但其抗肿瘤作用机制尚不十 分清楚。本研究发现GLB在100 mg/L以上时可部分对抗PGE2 ,20 μmol/L,对小鼠脾细胞增殖和IL 1α、IL 2 mRNA 表达的抑制作用(P,0.05)～提示灵芝多糖对产生PGE2的肿 瘤进行辅助治疗具有一定的临床意义～也提示灵芝多糖拮抗 PGE2的免疫抑制作用可能是其抗肿瘤作用的免疫学机制之 一。 【参考文献】   ,1,Li M C, Liang D S, Xu Z M, et al. Effects of Ganoderma(Ganoderma lucidum) polysaccharide on PKA activity o f murine peritoneal macrophages,J,. Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药), 2000, 31(5):353. ,2,Ning A H, Cao J, Huang M, et al. Observation on the immune index and inhibition function of ganoderma polysaccharides to mice tumor,J,. Cancer Research and Clinic (肿瘤研究与临床), 2004,16(3):147. ,3,Zhao S H～Yao W S～Pang X S～et al. Isolation～ purification～characterization and anti tumor activities of Ganoderma Lucidum polysaccharide,J,. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics(中国生 化药物杂志), 2003,24(4):173. ,4,Ye F, Wu J, Dunn T, et al. Inhibition of cyclooxygenase 2 activity in head and neck cancer cells by genistein,J,. Cancer Lett, 2004, 211(1): 39. ,5,Mitsuhashi M, Liu J, Cao S, et al. Regulation of interleukin 12 gene expression and its anti tumor activities by prostaglandin E2 derived from mammary carcinomas,J,. J Leukoc Biol, 2004, 76(2): 322. ,6,Trejo Y G, Bordenave R H, Beviacqua M, et al. In vitro secretion of cytokines and prostaglandin E2 by monocytes from lung cancer patients,J,. Respir Med, 2001, 95(4): 243. ,7,Li R Z, He Y Q. The relation between anti aging mechanism and the active constituents of Ganoderma lucidum: Study of the chemistry and structure activity relationship of ganoderma polysaccharides,J,. Journal of Beijing Medical University,北京医 科大学学报,, 1991,23(6):473. ,8,Sun L S, Lei L S, Fang F Z, et al. Inhibitory effects of koumine on splenocyte proliferation and humoral immune response in mice,J,. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica(中药药理与临床), 1999,15(6):10. ,9,Dannenberg A J, Altorki N K, Boyle J O, et al. Cyclo oxygenase 2: a pharmacological target for the prevention of cancer,J,. Lancet Oncol, 2001, 2(9): 544. ,10,Howe L R, Dannenberg A J. A role for cyclooxygenase 2 inhibitors in the prevention and treatment of cancer,J,. Semin Oncol, 2002,29(3 Suppl 11):111. ,11,Funaki N, Arii S,Adachi Y, et al. Effect of PGE2 on interleukin-1 and superoxide release from primary cultured human hepatic macrophages,J,. Life Sci, 1992,51(17):1339. ,12,Emond V, Fortier M A,Murphy B D, et al. Prostaglandin E2 regulates both interleukin-2 and granulocyte macrophage colony stimulating factor gene expression in bovine lymphocytes,J,. Biol Reprod,1998,58(1): 143.