HPLC-ELSD法测定阿胶补血口服液中黄芪甲苷含量
【摘要】 目的 建立阿胶补血口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。方法 采用HPLC-ELSD
法,色谱柱:Betasil C18 (4.6 mm×200 mm,5 μm),流动相:甲醇-水(74?26),流速:1.0 mL/min;
柱温:30 ?;ELSD参数:漂移管温度90 ?,气体流量2.0 L/min。结果 黄芪甲苷在0.43,
2.15 μg之间呈良好线性关,回归方程为:Y=1.536 37X+0.921 58, r=0.999 9(n=6);平均加样
回收率97.98%,RSD=1.03%。结论 本方法准确、可靠、重复性好,可作为阿胶补血口服液的
质量控制方法。
【关键词】 HPLC-ELSD;阿胶补血口服液;黄芪甲苷;含量测定
Determination of Astragaloside ? in Ejiao Buxue Koufuye by HPLC-ELSD LIU
Tong-xiang, SHANG Bao-chang, CHEN Fu-jun, et al1.The Laboratory of Cellular Biochemistry, Beijing University of TCM, Beijing 100029, China;2.Henan Four-Directions Medicine Products Co.Ltd., Zhoukou 466001, China Abstract:Objective To establish a method for the determination of Astragaloside ? in Ejiao Buxue Koufuye. Methods HPLC-ELSD was used to determine directly Astragaloside IV in Ejiao Buxue Koufuye on Betasil C18 column, using CH3OH-H2O (74?26) as a mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The temperature of drift tube for ELSD was 90 ? and the flow rate of N2 was 2.0 L/min. Results The linear range of Astragaloside ? was 0.43,2.15 μg, Y=1.536 37X+0.921 58, r=0.999 9 (n=6), the average recovery of the added sample was 98.5% and RSD=0.98%. Conclusion The method is accurate and reliable with a good reproducibility. It can be used for the quality control of Ejiao Buxue
Koufuye. Key words:HPLC-ELSD;Ejiao Buxue Koufuye;Astragaloside ?;determination
阿胶补血口服液为中药复方制剂,由黄芪、阿胶、熟地黄、党参、枸杞子、白术组成,具有滋
阴补血、补中益气、健脾润肺之功,用于久病体虚、血亏目眩、虚痨咳嗽等症[1]。黄芪为方
中主药,现代药理研究
明,黄芪具有增强免疫、抗疲劳、促进代谢等功用,而黄芪的活性成分
主要为皂苷类,黄芪甲苷又是其主要活性成分之一。本试验采用高效液相色谱-蒸发光散射检
测器(HPLC-ELSD)法,对阿胶补血口服液中黄芪甲苷的含量进行了研究,建立了方中黄芪甲
苷的HPLC-ELSD含量测定方法。
1 仪器与试药
DIONEX高效液相色谱仪,ASI-100自动进样器,Altech 2000ES型ELSD检测
器,Chromeleon色谱工作站;十万分之一电子天平。黄芪甲苷对照品(批号0781-200109,购自
中国药品生物制品检定所);阿胶补血口服液(批号050501、050502、050503,河南省四方药
业有限公司生产)。甲醇为色谱纯;水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 Betasil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);流动
相为甲醇-水(74?26);流量:1.0 mL/min;柱温:30 ?;ELSD漂移管温度90 ?,气体流量
2.0 L/min。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液20 μL注入高效液相色谱仪,
按上述色谱条件测定,记录色谱图,理论塔板数以黄芪甲苷计不低于3 000,黄芪甲苷色谱峰与
相邻峰的分离度不低于1.5,阴性对照溶液在黄芪甲苷峰位置处无干扰峰,黄芪甲苷与样品中
其他组分色谱峰可完全分离(见图1)。2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品10.75 mg,置5 mL量瓶中,加甲醇溶解后稀释至刻度(黄芪甲苷对照品浓度2.15 mg/mL),摇匀,精密量取1 mL,于5 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度,作为对照品溶液(黄芪甲苷对照品浓度0.43 mg/mL)。
2.3 供试品溶液的制备
精密吸取本品10 mL,用正丁醇萃取3次,每次10 mL,合并正丁醇液,加入氨试液2次,每次20 mL,弃去氨试液层,合并正丁醇液层,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至5 mL,作为供试品溶液。取缺黄芪阴性样品,同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定,以进样量的常用对数为横坐标,峰面积的常用对数为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=1.536 37X+0.921 58,r=0.999 9(n=6)。结果显示,黄芪甲苷在0.43,2.15 μg之间呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取黄芪甲苷对照品溶液30 μL,注入液相色谱仪,连续进样5次,测定黄芪甲苷的吸收峰面积,RSD=1.37%(n=5)。
2.6 稳定性试验
精密吸取供试品溶液20 μL,在0、1、2、5、24 h分别注入液相色谱仪,测定黄芪甲苷峰面积,RSD=1.067%(n=5),表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重现性试验
取同一批样品(批号050501),重复测定5次,结果平均含量为0.02953 mg/mL,RSD=0.13%。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的样品(批号050501,0.029 53 mg/mL),量取6份,每份10 mL,分为3组,每组2份,分别精密加入浓度为0.430 mg/mL的黄芪甲苷对照品0.8、1.0、1.2 mL,按上述方法测定其含量,并计算加样回收率,平均回收率为97.98%,RSD=1.03%。结果见表1。 表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 样品测定
分别精密吸取对照品溶液2、5 μL,供试品溶液20 μL,注入液相色谱仪,测定,并以外标两点法对数方程计算含量,结果见表2。表2 样品测定结果(略)
3 讨论
黄芪甲苷含量测定一般采用薄层扫描法[2]、高效液相色谱 -蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)[3]、高效液相色谱-紫外检测器法[4-5]、HPLC-示差折光检测法[6],还有用柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器进行测定[7]。黄芪甲苷无特征紫外吸收,仅在200 nm处有弱的末端吸收,需采用紫外末端波长检测,对溶剂
较高,测试成本昂贵;且在其它皂苷类成分的存在时,干扰严重,分离度下降,重现性差,很难利用HPLC-UV联用测定黄芪甲苷含量。采用蒸发光散射检测器检测,则克服了上述不利因素,具有专属性强、灵敏度高、不受杂质成分干扰等优点。因此,本实验采用HPLC-ELSD的方法,测定方中黄芪甲苷的含量。
方法学考察结果表明,HPLC-ELSD联用测定黄芪甲苷含量重现性好,回收率高,方法准确可靠,可用于阿胶补血口服液的质量控制。
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