RP-HPLC法测定钙佳锌口服液中维生素D2含量

RP-HPLC法测定钙佳锌口服液中维生素D2含量 [摘要] 目的:建立RP-HPLC测定钙佳锌口服液中维生素D2含量的方法。方法:采用 Agilent-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱;流动相:甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液(95?5); 波长:265 nm;流速:1.0 ml/min,柱温:30?。结果:维生素D2在0.010 1,0.404 0 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1.000 0),平均回收率为99.70%,RSD=3.11%(n=9)。结 论:本方法具有快速、简便、准确、检验成本低的优点,可用于钙佳锌口服液中维生素D2的质 量控制。 [关键词] 钙佳锌口服液;维生素D2;含量测定;反相高效液相色谱法 [中图分类号] R927.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)05(a)-059-03 Content determination of vitamin D2 in Gaijiaxin Oral Liquid by RP-HPLC FAN Shide, LIAO Xiaojun, QIU Zhengxia, ZHANG Yan, LI Ping, JIANG Qiaomei (Sichuan Sunnyhope Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 611130, China) [Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of vitamin D2 in Gaijiaxin Oral Liquid by RP-HPLC. Methods: The Agilent-C18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column was used. The mobile phases consisted of methanol and 0.02 mol/L-ammonium acetate (95?5), the flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was at 265 nm, the column temperature at 30?. Results: The linear ranges of vitamin D2 was at 0.010 1-0.404 0 μg (r=1.000 0), the average recovery was 99.70% with a RSD of 3.11% (n=9). Conclusion: The method is simple, accurate, low-cost and can be for determination of the contents of vitamin D2 in Gaijiaxin Oral Liquid. [Key words] Gaijiaxin Oral Liquid; Vitamin D2; Determination; RP-HPLC 钙佳锌口服液是以葡萄糖酸钙、乳酸钙、乳酸锌、维生素D2为主要原料,加入乳酸、安 赛蜜、甜橙油、苯甲酸钠辅料制成的保健食品,具有补钙的保健功能。其中的维生素D2具有 促进人体对钙的吸收功能,其含量少,遇光或空气容易变质,热稳定性差。钙佳锌口服液现有质 量中维生素D2的含量测定方法按GB/T 5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉 维生素A、 D、E的测定》规定的检测方法,采用正相HPLC法测定[1],该方法具有分析成本高、供试品溶 液制备过程繁琐的不利因素,并可能在配制供试品溶液过程中因温度过高导致维生素D2的损 失,使其测定值较实际含量值低。此外,使用该方法所得HPLC色谱图中维生素D2的保留时间 差异较大,或无法检测出维生素D2。采用《中国药典》2005年版二部中维生素D2原料的含量 测定方法检测本制剂中维生素D2含量亦同样存在上述问[2]。近年来文献报道的有关维生 素D2含量测定方法[3-8],用于本品中维生素D2的测定时分离效果仍不理想,无法满足本品制 剂质量控制的需要。本文对钙佳锌口服液中维生素D2的含量测定方法进行了研究,提出对本 品原质量标准中维生素D2的含量测定方法(GB/T 5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉 维生 素A、D、E的测定》)进行改进,使用RP-HPLC法测定本品溶液中维生素D2的含量。 1 仪器与试药 1200高效液相色谱仪和色谱工作站(美国Agilent);pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪 器有限公司)。维生素D2对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100155-200505);钙佳锌口 服液(四川升和制药有限公司,批号:090603、090604、090605、090701、090702、090703); 甲醇为色谱纯;水为超纯水;其余试剂为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱;流动相:甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液(95?5);检测波长:265 nm;柱温:30?;流速:1.0 ml/min;进样量:20 μl;理论板数以维生素D2峰计算应不低于1 500,维生素D2峰与其他杂质峰均能得到良好分离,分离度符合要求(R>2.0)。 2.2 溶液的制备 2.2.1对照品溶液的制备精密称取维生素D2对照品适量,置棕色量瓶中,加乙醇溶解制成20 μg/ml的溶液,并充氮气保护,作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量,置棕色量瓶中,加乙醇稀释制成1 μg/ml的溶液,并充氮气保护,作为对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备精密量取钙佳锌口服液25 ml,置分液漏斗中,加入饱和NaCl溶液25 ml,分别以50 ml乙醚萃取3次,合并乙醚层,以5 g无水硫酸钠干燥除尽乙醚层中的水,过滤,以10 ml乙醚洗涤无水硫酸钠2次,合并乙醚至棕色圆底烧瓶中,置旋转蒸发仪在30?水浴中蒸干除尽乙醚,残渣用少量乙醇溶解,转移至5 ml棕色量瓶中,用乙醇洗涤滤器,定容,并充氮气保护,即得供试品溶液。 2.2.3 空白辅料溶液的制备取不含维生素D2的全处方其他成分的辅料制备溶液,按“2.2.2”项下方法制备空白辅料溶液,即得维生素D2的空白辅料溶液。 2.3 干扰试验 分别吸取维生素D2对照品、供试品、空白辅料溶液、溶剂乙醇各20 μl,进样。结果明空白辅料溶液和溶剂乙醇不干扰维生素D2的含量测定,见图1。 图 1 HPLC色谱图 (A.空白辅料溶液;B.对照品;C.供试品;D.乙醇) Fig.1 HPLC chromatography (A.Blank excipient solution; B.Reference substance; C.Sample; D.Ethanol solution) 2.4线性范围考察 分别精密吸取维生素D2对照品贮备液适量,置棕色量瓶中,以乙醇稀释并定容制得0.505、1.01、2.02、3.03、6.06、10.10、20.20 μg/ml的系列维生素D2对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各20 μl,进样,记录峰面积积分值。以维生素D2含量为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,回归方程:A=65.369C-0.410 3(r=1.000 0)。维生素D2在0.010 1,0.404 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。 2.5精密度试验 精密吸取20 μl的维生素D2对照品溶液(浓度:1 μg/ml),连续进样6次。峰面积的RSD=0.18%(n=6),结果表明仪器精密度良好。 2.6 稳定性试验 因本品中维生素D2对光、热、氧均不稳定,故考察样品溶液的稳定性情况。将“2.2.2”项下供试品溶液室温放置0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 h后,分别进样20 μl,峰面积的RSD=0.42%(n=7),结果表明室温放置8 h内样品基本稳定。 2.7 重复性试验 取同一批样品,按“2.2.2”项下方法制备6份供试品,分别测定色谱峰面积,平均含量占标示量的百分率为100.3%,RSD=1.60%(n=6)。结果表明本法重复性良好。 2.8 回收率试验 按口服液处方量称取空白辅料,并按标示量的80%、100%及120%加入维生素D2对照品贮备液,混匀后,按“2.2.2”项下方法制备溶液,按上述色谱方法测定维生素D2含量,其平均回收率为99.7%,RSD=3.11%,测定值接近真实值,方法准确可靠,见表1。 表 1 回收率试验 Tab.1 Recovery test 2.9 样品含量测定 取6批钙佳锌口服液样品,分别按“2.2.2”项下方法制成样品溶液,分别精密吸取对照品溶液、样品溶液,各20 μl,进样,记录色谱峰面积,外标法计算维生素D2含量,见表2。 表 2 样品含量测定(%,n=6) Tab.2 Content determination of samples (%,n=6) 3 讨论 维生素D(vitamin D)为固醇类衍生物,是一种脂溶性维生素,主要包括维生素D2和维生素D3。主要功能是调节体内钙、磷代谢,维持血钙和血磷的水平,从而维持牙齿和骨骼的正常生长就发育。儿童缺乏维生素D易发生佝偻病。因此,在婴幼儿配方食品中大多添加维生素D。近年来国内外学者对维生素D的作用进行了广泛的研究,周文娣等[9]综述了近年来维生素D受体及维生素D作用进展,表明维生素D可预防骨质疏松症、心脏病、1型糖尿病、自身免疫性疾病和一些肿瘤等。因此,维生素D在临床中的应用将更加广泛。但过多服用维生素D将引起急性中毒,长期摄入过多的维生素D(5 000 IU),将引起高血钙和高尿钙。特征为食欲减退,过度口渴、恶心、呕吐、烦躁、体弱、便泌、腹泻交替出现,严重者将因肾钙化、心脏和大动脉钙化而死亡。因此准确控制婴幼儿配方食品中维生素D的含量尤为重要,以便为临床提供可靠的用量参考。 维生素D2原料为无色针状结晶或白色结晶性粉末,无臭、无味,不溶于水,易溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮,遇光或空气容易变质,热稳定性差。在各种制剂中维生素D的含量均比较低,建立制剂中维生素D含量测定方法时其提取与分离是关键技术,应充分考虑维生素D2的理化性质,防止维生素D2在提取过程中因氧气、光、热的影响而降解,尽量避免测定结果低于实际值。该方法中供试品溶液与对照品溶液的制备充分考虑了维生素D2的理化性质,采用乙醚萃取样品中的维生素D2,3次后萃取完全,而后用无水硫酸钠除去乙醚层中少量的水,置旋转蒸发仪在低于30?水浴中快速除去乙醚。该制备方法避免了氧气、光、热的影响,并缩短了样品溶液制备过程中的受热时间,有利于样品稳定。该含量测定方法快速、简便、准确、检验成本低,明显优于本品原质量标准中维生素D2含量测定方法(GB/T 5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉 维生素A、D、E的测定》),可用于钙佳锌口服液中维生素D2的质量控制。 [参考文献] [1]中华人民共和国国家质检总局.婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定GB/T 5413.9-1997 中华人民共和国国家标准[S].北京:中华人民共和国国家标准出版社,1997. 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