合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用

合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用 合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的 促成骨作用 复里2006May,33FudanUnivJ(3)MedSci'…309 合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质 干细胞的促成骨作用 徐杨施德源陈统一崔大敷 (复旦大学附属中山医院骨科上海200032;.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所上海200031) 【摘要】目的研究合成成骨生长肽(sOGP)对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的作用,并与经典的 成骨诱导剂地塞米松相对比.方法取大鼠股骨骨髓,贴壁法分离骨髓基质干细胞进行体外培养,加入不同浓 度的sOGP,观察细胞形态变化,细胞增殖率,细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测3种主要成骨标 志物(ALP,I型胶原,骨钙素)的表达,组织化学染色检测碱性磷酸酶,I型胶原的表达及钙质的沉积并进行图 像分析.结果sOGP对BMSCs增殖的影响随浓度不同呈现双向作用.sOGP和地塞米松在mRNA和蛋白水 平均能促进各成骨标志物的表达,定量分析结果显示,sOGP在10mol/L浓度组促成骨的作用最强,明显高于 对照组和地塞米松组.结论sOGP能明显促进大鼠BMSCs向成骨方向转化.这种促成骨能力与其浓度密切 相关,以10mol/L浓度下促成骨能力最强. 【关键词】成骨生长肽;骨髓基质干细胞;成骨 【中圈分类号】R961【文献标识码】A Syntheticosteogenicgrowthpeptidecanpromoteratbone marrowmesenchymalstemcellsintoosteogenesis xuYang,SHIDe—yuan,CHENTong—yi',CUIDa—fu ('DepartmentofOrthopaedics,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032;InstituteofBiochemistryandCell Biology,ShanghaiInstituteforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031.China) [Abstract]PurposeToinvestigatetheeffectofthesyntheticosteogenicgrowthpeptide(sOGP)onprolif— erationandelifferentiationoftheculturedbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)ofrats.Methods AfteraddingthreedifferentconcentrationsofsOGPtotheculturedBMSCs,wefirstobservedthemorpho— logicalchanges,measuredtheproliferationcurveswiththeMTTmethod,thendetectedtheosteogenesis markers(includingalkalinephosphatase,typeIcollagenandosteocalcin)atthelevelofbothmRNAandpro— teinwithbiochemicalmethods,semi— quantitiveRT-PCRandhistochemicalstainingwithimageanalysing, andfinallycomparedtheresultsoftheclassicosteogenicinducerDexmethsone.ResultssOGPatthecon— centrationgof10一 "tool/LslightlypromotedtheproliferationofBMSCs.whileattheconcentrationgof10' and10,mol/L,itshowedaslightsuppressioneffect.However,sOGPof10, mol/Lhadthegreatestabil— ityofpromotingosteogenesis.CondusionssOGPshowsabiphasiceffectbothontheproliferationanddif— ferentiationofBMSCsdependingonitsconcentration.sOGPcanpromotetheosteogenictransformationof BMSCstro,andthiseffectiSmostobviousattheconcentrationof10,mol/L. [Keywords]osteogenicgrowthpeptide;mesenchymalstemcells;osteogenesis 成骨生长肽(osteogenicgrowthpeptide, OGP)是以色列学者Bab等[1于1988年在研究骨 髓再生过程中出现全身骨量增加的现象时发现的一 种多肽.完整的OGP共含有14个氨基酸,序列已 测定,其中C端5肽为其功能活性基团.OGP的结 构高度保守,人类和啮齿类等哺乳动物体内OGP 的结构完全一致,具有相同的生物活性嘲.我科与 中科院上海生化所合作通过固相肽合成法人工合成 了成骨生长肽(sOGP)[33.本实验旨在研究sOGP 对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的促 成骨作用,并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比. 和方法 主要试剂和仪器sOGP(中科院上海生化所 310复旦(医学版)2006年5月,33(3) 合成),DMEM—LG培养液(Gibco,美国),标准胎牛 血清(Hyclone,美国),Trizol(北京鼎国),I3一甘油磷 酸钠,L厂抗坏血酸,地塞米松,胰蛋白酶,MTT(Sig— ma,美国),碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(I-海科 华),I型胶原抗体(兔抗大鼠和人)(Merck,德国), 逆转录酶MMLV(Fermentas,美国),TaqDNA聚 合酶(上海生工),GeneAmp9600PCR仪(美国), 酶标仪(Bio—Rad,美国),PANASONICMV—CP410 CCD摄像机,OLYMPUSBH2显微镜,IMS细胞图 像分析系统(上海申腾). 实验动物清洁级SD大鼠6只,8周龄,雌雄 各半,由本院实验动物中心提供. 大鼠骨髓基质干细胞的分离培养无菌条件下 切取双侧股骨,剪开两端干骺端,无菌PBS反复冲 洗髓腔,所得细胞按1X10/mL的密度接种于 50mL培养瓶中,在37?,5CO:,饱和湿度条件 下培养,培养液使用含10FBS的DMEM低糖培 养液,48h半量换液,72h全量换液,去除不贴壁的 细胞,以后每3天换液,待细胞生长至80,90 时传代,2代后传代于250mL培养瓶内扩增,取第 2—6代细胞实验. 实验分组共分5组.单纯矿化液组(A)(p一甘 油磷酸钠10mmol/L,L-抗坏血酸50mg/L),为空 白对照组.地塞米松组(B)(Dexl0mol/L+矿化 液)为阳性对照组.实验组为sOGP组(sOGP+矿 化液),根据sOGP的浓度分为3组:sOGP101 tool/L(C);sOGP10一'mol/L(D);sOGP10mol/ L(E). 细胞形态观察和生长曲线绘制倒置相差显微 镜逐日观察原代,传代及加药后各组细胞的生长情 况和形态特征.采用噻唑蓝比色法(MTT法)测量 细胞增殖率.取第二代细胞,以(1X10)/cm的密 度接种于96孔培养板,24h后实验组更换条件培 养液,除以上A—E组外,另加做常规培养组,均为每 3天换液.于第1—10天每天定时使用MTT法检 测存活细胞数,选择590nm波长,在酶联免疫检测 仪上测定各孔光吸收值,各组均为3复孔检测,根据 结果绘制各组细胞的生长曲线. 细胞内ALP含量检测12孔板按(1X10)/ cm的密度接种细胞,24h后实验组更换条件培养 基.分别在第2,5,8,11,14天取样,吸去孔中培养 液,无菌PBS冲洗3遍后,每孔加入600L1的 TritonX一100,轻轻振荡,并用枪头反复吹打,使细 胞自壁上解离,转移至无菌试管中,4?过夜,使细 胞充分裂解.根据试剂盒说明,依次加入R1液和 R2液,405nm波长测量吸光度,结果换算成国际单 位,各组均为3复孔检测. RT-PCR法检测成骨标志物以(1X10)/cm 的密度将细胞接种于6孔板中,24h后实验组更换 条件培养基,均为每3d换液.培养8d后收集细 胞,使用Trizol一步法抽提细胞内总RNA,紫外分 光光度计测量所抽提的RNA浓度和纯度(A:./ Az8o值在1.7—2.2之间),根据所测浓度取1g RNA,以Oligo(dT18)为引物,逆转录酶MMLV 42?进行逆转录反应,得到细胞cDNA,再以所得 的cDNA为进行PCR反应,检测3种成骨性标 志物:ALP,I型胶原和骨钙素(OC).所采用的引 物及产物大小见表1,PCR扩增条件为95?5min 预变性,95?30s一55?30s一72?30s,共30个 循环,循环完成后,72?10min结束反应.所得产 物2琼脂糖凝胶电泳,EB显色,显示结果. 表1引物序列 Tab1PrimersusedinR1l"-PCR 细胞爬片组织化学和免疫组织化学染色(1) 细胞爬片制作:取24mlTlX24mm盖玻片,5稀盐 酸处理过夜,无菌水反复冲洗后高压灭菌,放置于6 孔板中,以(1X10)/cm.的密度接种细胞,24h后 实验组更换条件培养基,分别在第2,5,8,11,14d 取出玻片,4多聚甲醛固定后染色.(2)ALP钙钴 法(Gomori法)染色:孵育液(28一甘油磷酸钠 10mL,2巴比妥钠10mL,2无水氯化钙10mL, 2硫酸镁2mL,重蒸水20mL,调整pH值至9.3 左右)37?孵育45min,冲洗后加入2硝酸钴孵育 …i川懦释?硫化钱』包iiz--r燥t封片 帆姓栋色(?I嫌缸症姒化包 『)?[10酏槭37c孵育』?nl'I:睬内糖性 确.ff跳后,lL常码血清I:…封.7(孵 行].hi1凡一机搴温孵肯21^.4【过使. 冲洗后._川人=帆(IIIT衄策台锄),宅温晰 i【_.Ij1,I;!包.仆复一*一木桑….l,j棕锔 包l4jV…1法钙包:JJ_]^5矾酸锨一f: 良『1光下孵育7_】l冲洗后5硫f?航酸钠 液I一爵2f1…1井型啦鲷?黑包 图像分析}×的心k情串(H镱×Ill萼韧 镜×251,.茸张?随{儿【出抒野.通过硅微 镜,''('1,搬悔机悔啭霹壤,?的雠图 cnM1,?将』的数悔.录州轼什世fr悔4)- . 删纳裂m什域晌皿I幂IIj像采 PiI啦丧小J圯桁蛭眦 统计学分析所得I臆I】si1绒_l软 什,采JTI-田集疗盖世衍统ll学计析组问数据乘 川f时仆进多lt转.,"._l为燕肆柏 统lf学矗业 细胞形态观察f控种曲什髓24h 邕渐崎《rl啭lit州J荞帆中柯k.浮细H世. I,出仆山进卦?胞.敬次换敞lrJ芷点障 细胞f『姓镌i:托.墟蜒落圳成k梭矸;.胞 恃轻夫突世较少心肝钏?岵心J呈生K肜 盎坐『匕{:l}_l常眦锌基什FriIlI匏宅他代【 f而jI;怎业化明.m胞增计谴废随传ft 次数埔…I而下降哑幔什培乔坫蚺菲后细恺怵 转』ij增-窿越g而渐J止g角肥.胞浆透侥鹰增 JiJI.ti:苦柏辐多粒4k翱m.浆IL:例【I地啭 壮协州【】『Jl'I{Il…1lI…】郇5H大左 仃不…班细胞聚靶)j}成的豉晰细胞纳节.结1一 心星渐僻础晰.遮光,]Ir]J剐副细胞地刖挑计 (rii).铀菏墙掉川i的趣IK,地种细l胞结的龇 耳增蜘 各组细胞生长曲线绘制J常规坫乔lf比 i凡矿化撒胞IK陛彩响(, lll5】地章水愀刚埘绷胞增仃{度的抑制作? ")(tl列胞增悄的膨I.度仃戈Iji _】f?T】{ilIl【,lIIll…jI浓幢舯细胞增 柚柯轻崆的抑制作.见lilltoolll.仲制作 川州.IJ'(1ItII?lI川刈lH胞增贿9llj 轻J的仳进作陈丁s(1(,I'If】nml.组州地 塞水松组遗到增殖平台I田时的饱和管度略纠' 条告组的饱l将度近似【圈2 I...................................................一 目i打[^"H:fl培养后形成的细胞 钙结节{倒置显微错2II『J×】 I,1…lI枷Lrf…II…rr4'ml ''?I?n,eIIdmi~'l'?l,2tFtl×l c,Iml l )GP1n'… 揣l 图2生长曲线较 AI.P含量测定各组均出现AI,I的表进. 仔作砬II?Jiilj崔化的规律.纳住?犬选刮峰值. "后丑色所F恃组l比较扦组均行州显锌 【PllfJj)地辈术忪冉【)(?『】均能叫盟似世^I}】 I!l~J丧.儿Ji姒(;PI?mull组AI.I】的表达 水,I'最高{罔{J 一,H】i4 ,ll】 目3细胞内^lI'台量洲定 r0j(!ellularALI'detecti~m RT-I,cR备组均能榆删到种成日标志物的 …』tN^袁.rfi地摩水松纽qI)(rIIlliI",】L 表J主水,『垃高.矿化液组和)(rP川…J,纽 州较f罔4) 一0^一 一 一,一 目4逆转录台酶链反&结果 Vig4RI—l'【Rrvsull~ ,II-iIiiLJiIcI1.I,iI『,【Lh】|! J,II【I.lIniI【.r,J【ll. 细胞爬片组织化学染色图像分析AlI讹包 和f腔染色i此密噬驯1,几结采用L 衙租值址仃统i?_而包坩忸1_?圯僖均很 重竖?V…t"包站采川牛面0此蝌 仇的乘租【】Ht指散'蛙址打筑I;:仆惭件州 AI_J竹表达均仃定的川J_!'_件斡托f】 选剥峰帆.韩必仃阡f【川H二鞍际I[】【.I IllI---,1纽帕AII.』.,刈I【H州没柯州h牛讳 仆-J再小均打啊显(fJllll.地磐术松州 和【】【1II"…t1[的矗逃'较他州 高()I腔瓜包I脞J帅表达也卉 窟Ilitl舰伴,约^,【_旃HI【到峰缸精t囱 所l降丧1上水眦5雀水协"(I? _ll_J【1.封【埽冉【】l,P『Il…c】I,组的表J啦 转计』_I{}【略低f一)…K浊色,ji齐? 有-质沉秘,井随行IIr问世RI(1l~增肌H??山ll 地塞米栅州和【J(,l】I?…?1I蚍最高.cnJ】IP l1)【J_"【纽与引肌细叫差异(7)许 包-粜 日6I型腔原免疫组化染色目像分析 "I?,Ifllinden…l?lhlsth…staining ^B 囤H各组染色结 1)ilnr?lstainin~…lh.,rlht,Brl川m【20II× T"iJ,iv,.I'.._?jI『ii…TiiI,】i H";c,【l,,'【JJ【】_c,c?.I'Ii 川? 徐杨,等.合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用313 讨论 随着近年来生物医学的进展,各种促成骨因子 的发现使得缩短骨折愈合的自然过程,治疗骨质疏 松等与骨量减少相关的疾病出现了新的希望.既往 的研究显示,OGP对多种体外培养细胞都均有促有 丝分裂的作用(MC3T3E1成骨细胞,NIH3T3成纤 维细胞等),而体内实验显示它可以促进动物模型骨 折愈合的过程,并能够明显提高骨质疏松动物的全 身骨量,从而显示其具有促进成骨的作用_2'j. 骨髓基质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的 一 小群非造血系细胞,起源于中胚层.目前认为它 属于成体干细胞,具有很强的增殖和自我更新能力, 并具有多向分化潜能【8'.BMSCs被认为可能是骨 修复过程中成骨祖细胞的主要来源.因此我们推 测上述OGP的促成骨作用很有可能是通过其对 BMSCs的作用来实现的. 在体外,BMSCs未发现有自动分化的现象,其 分化需要适宜的培养条件或诱导剂,在本实验中,我 们也发现大鼠BMSCs在常规培养条件下可以稳定 传代15代以上,而保持稳定的生物学特征,但其增 殖速度随传代次数增加而降低.BMSCs向哪个方 向分化是由周围微环境所调控的.ALP是成骨细 胞分化成熟早期的标志性酶之一,在成骨过程中 ALP可以水解磷酸酯,为羟基磷灰石的沉积提供必 要的磷酸,它可以标志成骨分化的开始,其活性高低 一 定程度上可以反映出细胞的成骨分化能力.I型 胶原是成骨细胞分泌的细胞外基质的主要成分,也 是重要的成骨标志物之一.骨钙素(OC)是成骨细 胞特异性合成和分泌的一种非胶原蛋白,在钙离子 存在的条件下,可与羟基磷灰石结合并稳定其构象, 被认为是向成骨细胞分化的最具特征性的标志物. 本实验在mRNA和蛋白水平均检测到了ALP,I 型胶原,骨钙素等成骨标志物的表达,显示在加入 sOGP培养后,BMSCs发生了向成骨方向的转化. 目前经典的体外诱导BMSCs向成骨方向转化 的是地塞米松+j3一甘油磷酸钠+L一抗坏血酸. 其中I3一甘油磷酸钠可以为成骨细胞的分化和增殖提 供磷原子,L一抗坏血酸则是胶原合成所必须的,而地 塞米松则具有诱导BMSCs向成骨方向转化的作 用,但地塞米松除了能促进BMSCs向成骨方向转 化外,还能促进其向成脂肪方向转化_1",这被认为 很可能是激素导致骨质疏松的生理基础.既往研究 显示,即使在最有利于促成骨的浓度下,仍有大约 30%的细胞转化为成脂肪细胞,这使其实际应用存 在潜在的风险. BMSCs由于取材容易,易于体外培养和诱导, 是目前最有前途成为组织种子细胞来源的细 胞__1一.在本实验中发现sOGP具有促进BMSCs 向成骨方向转化的作用,其中在10mol/L浓度下 其促成骨的作用比地塞米松还要强,这使得sOGP 可以在骨组织工程体外诱导BMSCs成骨方面发挥 作用. 目前从骨髓中分离BMSCs的方法有3种:贴 壁法,密度梯度离心法,流式细胞仪分选法,但这三 种方法均不能得到纯化的MSCs,其中混有少量的 单核/巨噬系细胞,内皮细胞等.而目前尚未发现 BMSCs具有特征性的表面抗原,尚无直接方法可对 BMSCs进行鉴定.目前的鉴定方法都是通过在培 养过程中诱导出现分化表型,然后逆推得知是否为 MSCs.一般认为BMSCs具有异质性,即并非均一 的细胞群,其中可能包含处于不同分化阶段的细 胞.这种细胞的不均一性就使得实验中严格对 照和定量分析显得更加必要.事实上在本实验中显 示单纯矿化液条件下,部分细胞就自动发生向成骨 方向的转化,并能进入以钙质沉积为标志的成熟阶 段,只是数量较少,而地塞米松和sOGP则能明显促 进这一进程.其中sOGP的促成骨能力和其浓度密 切相关,以10mol/L的浓度下促成骨的作用最 强,同时在此浓度下其对细胞增殖的抑制作用也最 强,而sOGP10mol/L在各实验组中促增殖的作 用最强,但成骨标志物的表达与对照组无明显差异 甚至更低,这显示出细胞增殖和分化的对立统一,也 提示在利用s()GP的促成骨作用时需要明确其最适 浓度. 本实验显示sOGP对ALP的表达,细胞外基质 的形成和钙质的沉积等方面均有明显的促进作用, 这可能并不是由于sOGP对此成骨的三个阶段都有 促进作用而更可能是由于细胞向成骨方向定向后而 引起的一系列后果,这也提示sOGP对BMSCs的 促成骨的作用发生在比较上游的水平].ALP染 色和I型胶原染色阳性面积明显增大则提示存在成 314复旦(医学版)2006年5月,33(3) 骨性表达的细胞数明显增多,这提示sOGP的这种 促成骨作用更可能是由于向成骨方向转化的细胞数 量增加而不是细胞的功能增强.而这又可能存在两 种可能的机制:一是促进未分化状态的基质干细胞 向成骨方向转化,也就是骨诱导作用,二是促进已经 向成骨方向定向的细胞(如ALP阳性细胞)的增殖, 具体还有待进一步的实验研究证实. 参考文献 [1]BabI,GazitD,ChorevM,eta1.HistoneH4一relatedosteo— geniegrowthpeptide(OGP):Anovelcirculatingstimulatorof osteoblasticactivity[J].EMBOJ,1992,11(5):1867 [2]BabI,ChorevM.Osteogenicgrowthpeptide:fromconcept todrugdesign[J].Biopolymers(PeptideScience),2002, 66:33 [3]LiuZH,ShaoYC,ChenHH,eta1.Synthesisofosteogenic growthpeptideanditssynergeticeffectwithgranulocytecol- onystimulatingfactor[J].ShengWuHuaXueYuShengWu WuLiXueBao(Shanghai),2003,35(2):177 [4]费琴明,陈统一,崔大敷,等.人工合成成骨生长肽促进兔胫 骨骨折愈合的实验研究[J].中华骨科杂志,2002,22(3):165 ,…,…,…,一 (上接第308页) [3]NomuraF,KoyamaA,IshijimaM,eta1.Serumlevelsoffive [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] [1i] tumormarkersforlungcancerinpatientswithchronicrenal failure[J].OncologyReports,1998,5(2):389 SumuraM,YokogiH,BeppuM,eta1.Diagnosticvalueof serumprostate-specificantigeninhemodialysispatients[J]. 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