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使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E

2017-09-19 5页 doc 17KB 48阅读

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使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E 使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免 疫球蛋白E 科学发展 使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E含量 董益阳 (中国检验检疫科学研究院北京100123) f摘要】目的:基于非均相免疫分析原理,在纳米尺度空间内实现对人体免疫球蛋白E的定量测定.方法:在高分子微球表面使用生物素一亲和素 功能化技术包被抗人体免疫球蛋白E抗体,俘获测试样品中的人体免疫球蛋白E,通过自动化的微流体操纵技术和高灵敏度的检测手段检测人体血液里 的免疫球蛋白含量结果:纳尺度空间微流体免疫检...
使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E
使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E 使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免 疫球蛋白E 科学发展 使用纳尺度空间微流体免疫法检测人体免疫球蛋白E含量 董益阳 (中国检验检疫科学研究院北京100123) f摘要】目的:基于非均相免疫原理,在纳米尺度空间内实现对人体免疫球蛋白E的定量测定.方法:在高分子微球表面使用生物素一亲和素 功能化技术包被抗人体免疫球蛋白E抗体,俘获测试样品中的人体免疫球蛋白E,通过自动化的微流体操纵技术和高灵敏度的检测手段检测人体血液里 的免疫球蛋白含量结果:纳尺度空间微流体免疫检测法测定人体免疫球蛋白E,具有简单,快速,灵敏,特异,稳定以及自动化程度高等优点.结论:纳尺度 空间微免疫分析法具有常规检测手段所不具备的高效传质和快速侦测以及现场便携能力,故应用前景优良,研究意义重大. 【关键词】纳尺度空间微流体人体免疫球蛋白E 注:本项目受质检公益性行业科研专项经费资助(编号201010017). 一 ,研究背景 纳尺度空间微免疫技术是在二十世纪九十年代的微流体和经典免疫 化学技术的基础上发展起来的,其技术核心是基于二维微米尺度上的芯片 结构和生物相容性良好的高分子微球,将常规的免疫实验与测定过程转载 到玻璃微芯片上以实现集微量样品进样,反应,分离及检测于一体的微全 分析系统.由于纳尺度空间微免疫分析法不须进行结合标记物与自由标记 物的分离,加样,洗涤步骤即可自动化进行,因而操作简便,快速,人员稍微 接受培训就可独立操作,也不用大型分析测试仪器,故非常适合现场检测 之用. 现代很多产品质量安全事件,如食品和化妆品以及一些消费品里有毒 有害物质的滥用或非法添加,会对人体健康构成各类即发或迟发性损害, 从而导致人体血液内重要的生物标志物——人体免疫球蛋白E(hIgE)的 含量显着升高,目前国际上较为流行的blgE检测方法有放射性过敏原吸 附测试(easT)[I]和CAP系列测试法[2][3]等,但因涉及放射性核素和价 格昂贵的检测试剂,故难以方便的实现现场快速检测,本研究选择人体免 疫球蛋白E生物标志物为研究对象,使用简便的纳尺度空间微免疫检测手 段,建立人体免疫球蛋白E的高端检测方法,努力为我国相关产品质量安 全和民生健康保障提供前沿检测技术储备. 二,实验材料与仪器 高分子微球(Diameter5um),生物素,亲和素,牛血清蛋白,亲和纯化 抗人免疫球蛋白E抗体,过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白抗体,TMB微孔 板过氧化酶底物溶液以及0.5M的PBS缓冲液,均为化研株式会社产品,用 前置2,8.C冰箱冷藏. 人体总IgE标准品,BETHYL公司生产,4.C冰箱保存;测试血样10毫 升,一20~C冻存,用前复融. 试验用水为超纯水,其他化学试剂均为分析纯试剂. 研究使用自制纳尺度空间微免疫分析仪,重量约为1OKg,三维尺度为 长250x宽200x高220mm,内置玻璃芯片和检测模块,芯片内部的微流道 二维尺寸分别为200m和400um,有效分离空间约为800纳升(不计微 球体积). 三,实验步骤 3.1纳尺度空间的实现 利用计算机辅助设计和光刻以及等离子体键合等技术,选择紫外透过 率良好和表面粗糙度较低的玻璃材料,在微米尺度进行玻璃芯片的加工制 作,提供反应所需的纳尺度空间. 3.2抗体的固定化和交联 利用生物素一亲和素的特异性结合作用,在高分子微球表面固定上抗 人免疫球蛋白E抗体,使用0.5%牛血清蛋白进行封闭以减少非特异性吸 附,为纳尺度空间的微免疫检测提供稳定可靠的反应载体. 3.3纳尺度空间微免疫检测方法的建立 以0.5M的P/3S缓冲液为载体溶液,导入】D微升的包被有抗人免疫球 蛋白E抗体的高分子微球,然后利用利用微免疫分析仪的自动进样装置导 入1O微升标准比例稀释液或测试血清,停留5分钟待反应完全后导入过 氧化酶标记的抗人免疫球蛋白抗体,再导入TMB微孔板过氧化酶底物溶液 发色,然后使用玻璃芯片上的检测单元进行标准曲线测定并完成测试血清 定量. 四,实验结论 使用纳尺度空间微免疫分析仪,按实验室标准操作规程和上述实验条 件分别测试hlgE标准比例稀释样品和测试血清样品,根据四参数逻辑拟 合法拟合浓度响应值得出标准曲线,具体结果如下图和下表所示. 图;人体免疫球蛋白E纳 表:人傩免疫球蛋白E纳尺度空间微流俸免疫检测法测试数据 x(Std.Conc.inng/mi)7.8l15.631.2562.51252505OO X:Logxl0.8931.1931.495L796l2.0972.3g82.6g9 Y=Log((ry..),(yI一y))l_l_912—1.743—1.674.一1.153l一0.887—0.8o5-0.4船 此标准曲线对应的回归方程为Y=O.84X一2.74(相关系数:r=O. 9826),平试三次实际样品,得出测试血样中IgE含量=291. 2ng/mL. 经典的hlgE分析法一般至少需要数小时的测试时间和数百微升的样 品量,而纳尺度空间微流体免疫检测法每一次分析时间可控制在半小时以 内,消耗样品的量也仅为10微升. 五,结语 纳尺度空间微免疫分析是将常规的免疫反应局域化于极端显微空间, 通过在分子水平大幅提高扩散和传质等重要过程的速度,不仅可显着提高 检测的灵敏度,也可大大降低试剂和试样的消耗.同经典的hIgE检测方法 比较,纳尺度空间微免疫分析法具有高效价廉和灵敏特异等显着优点,因 此,在质量监督检验和临床诊断等研究领域具有优良的应用前景.? 参考文献 [1]李志,乔海灵.青霉素类药物的化学结构与其交叉过敏反应[J].中国 抗生素杂志,2010,35(4):296299. [2]王瑞琦,张宏誉.CAP系统检测过敏原特异性IGE抗体的方法学评价 [J].临床检验杂志,2007,25(2):109—110. [3j王瑞琦,尹佳.ImmunoChP250TM检测过敏原特异性IgE抗体的方法 评价[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2007,l(I):67—70. 1258.9—1458.2ppm,Ca为1.6—1.8%),三宝屯(高点中心,F为794.8— 15185.7ppm,Ca为3.8—5.1%)等处异常强度大,清晰度好,F,ca异常套 合程度高,异常规模与矿床规模一致.大多数萤石矿点处均具有明显的F 和ca异常,且F异常与萤石矿点的套合程度较高,应作为主要的找矿标 志,而F和ca异常套合处易出现中一大型矿床.本次研究发现以F异常下 限500ppm和CaO异常下限2.5%圈定的区域与萤石矿点套合较好. 3.5其它标志 露头,古采坑,转石,机械分散晕亦应是寻找萤石矿的良好标志.值得 提出的是,萤石矿床发育地区的地下水常常矿化度高,合F最大于lmg/ —258 L,形成水化学F离予高含量点,而无矿地区的地下水和地表水中不合F或 含量极微.因此,水化学异常应是寻找萤石矿的重要线索.? 参考文献 [1]邵济安,牟保磊,张履桥.华北东部中生代构造格局转换过程中的深部 作用与浅部响应[J].地质论评,2000,46(11:32—40. [2]邵济安,牟保磊,何国琦,等.华北北部在古亚洲域与古太平洋域构造叠 加过程中的地质作用[J].中国科学D辑,1997,27(5):390—394. [3]辽宁省地质矿产局.辽宁省区域地质志[M].北京:地质出版社, 1989.2325.
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