银杏叶提取物EGb761对MPP+诱导的人脑神经瘤母细胞SH―SY5Y细胞损伤的影响[权威资料]

银杏叶提取物EGb761对MPP+诱导的人脑神经瘤母细胞SH―SY5Y细胞损伤的影响[权威资料] 银杏叶提取物EGb761对MPP+诱导的人脑神经瘤母 细胞SH―SY5Y细胞损伤的影响 摘要:目的 观察银杏叶提取物EGb761对 人脑神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞损伤的影响，探讨其作用机 制。 采用细胞培养方法，建立SH-SY5Y细胞1-甲基-4- 苯基吡啶离子(MPP+)损伤帕金森病体外模型。实验分为对 照组、模型组和中药低、中、高剂量组，各给药组给予相应 剂量药物。MTT法测定细胞存活率，AnnexinV凋亡检测试剂 盒和流式细胞仪测定细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形 态;硝酸还原法检测SH-SY5Y细胞一氧化氮(NO)的含量。 结果 与对照组比较，模型组SH-SY5Y细胞存活率降低、细胞 凋亡率增加和NO含量升高(P<0.05);与模型组比较，中药 中、高剂量组SH-SY5Y细胞存活率增加、细胞凋亡率降低， NO含量降低(P<0.05)。结论 银杏叶提取物EGb761可以通 过抑制细胞内NO自由基的含量对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损 伤起到保护作用。 关键词:银杏叶提取物EGb761;SH-SY5Y细胞;帕金 森病;一氧化氮自由基 DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.018 R285.5 A 1005-5304(2016)07-0070-04 Effects of Extract of Ginkgo biloba Leaves EGb761 on MPP+-induced Injury in SH-SY5Y Cells XUE Li-hua， WU Xing-bin， LIAN Fo-yan， PAN Jian (Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China) Abstract: Objective To investigate the effects of extract of Ginkgo biloba leaves EGb761 on 1-methy- l 4-phenylpyridium (MPP+)-induced injury in human neuroblastoma SH-SY5Y cells; To discuss its mechanism of action. Methods Cell culture method was used and SH-SY5Y cell damage model was induced with different concentrations of MPP+ to build Parkinson’s disease model in vitro. The experiment was divided into control group， MPP+ model group， low-， medium-， and high-dose EGb761 groups. The survival rate was determined by MTT assay， and the apoptotic rate was detected by flow cytometry according to AnnexinV apoptosis detection kit. The cell morphology was observed by inverted microscope. NO content in SH-SY5Y cells was detected by Nitric acid reduction method. Results Compared with the control group， the survival rate of SH-SY5Y cells decreased and the apoptotic rate and NO content increased in the model group (P<0.05); Compared with the model group， the survival rate of SH-SY5Y cells increased and the apoptotic rate and NO content decreased in the low-， medium- and high-dose EGb761 groups (P<0.05). Conclusion EGb761 can protect MPP+-induced SH-SY5Y cell from damage by the inhibition of the content of NO free radical. Key words: extract of Ginkgo biloba leaves EGb761; SH-SY5Y cell; Parkinson’s disease; NO free radical 帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种表现 为功能性障碍的神经退行性疾病。临床上主要有静止性震颤? 肌肉僵直和运动迟缓等表现症状。PD是由多巴胺能神经元死 亡引起的，其机制在于黑质多巴胺能神经元变性中存在的细 胞凋亡现象[1]。随着人口老龄 基金项目:甘肃省科技项目(145RJZA143) 通讯作者:潘剑，E-mail:ldeypj@163.com 化的速度加快，PD等神经退行性疾病在老年人中的发病率逐渐升高。据研究显示，全球每年大约有400万新增患者[2]。PD治疗仍缺乏有效的药物，目前临床治疗PD的药物主要为胆碱脂酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂，该类药物虽能改善PD患者的认知和记忆功能，但无法有效地控制PD患者的病理进展。因此，寻找一种能够延缓或逆转PD的病理进展的药物，仍然是当前PD研究的难点。近年来，随着国内外学者对PD机制研究的不断深入，发现中药具有延缓PD进展的作用[3-4]。由于中医药在防治PD等老年性疾病方面有丰富的实践经验且毒性相对较小，逐渐受到研究者们的关注。研究显示，银杏叶提取物具有抑制细胞凋亡和保护神经细胞损伤等生理作用[5]。本实验采用细胞培养方法，建立SH-SY5Y细胞1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤PD体外模型，观察银杏叶提取物EGb761对SH-SY5Y细胞损伤的影响，探讨其作用机制。 1 材料和方法 1.1 细胞株 SH-SY5Y细胞株，中国科学院上海细胞库。 1.2 药物 EGb761(含24%黄酮糖苷和6%银杏苦内酯-白果内酯的银杏叶提取物)，40 mg/粒，法国博福-益普生制药工业公司，批号H03736。 1.3 主要试剂与仪器 胰蛋白酶，南京森贝伽生物科技有限公司; MPP+、MTT、DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，Sigma公司;磷酸盐缓冲液(PBS)?双抗(青?链霉素)，南京维森特生物技术有限公司;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，北京宝赛生物技术有限公司;一氧化氮(NO)试剂盒，上海谷研实业有限公司。Diaphot倒置显微镜、高速离心机(德国Hettich公司)，流式细胞仪(FACSCalibuar，BD)，CO2培养箱(美国Shellab公司)，超净工作台(新加坡ESCO公司)。 1.4 SH-SY5Y细胞培养 将SH-SY5Y细胞接种于培养瓶中，细胞密度为1.2×104个/cm2。采用DMEM培养基(10%FBS，青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL)，置于37 ??5% CO2细胞培养箱中连续培养。 1.5 分组、造模及给药 采用MPP+诱导细胞建立SH-SY5Y神经细胞损伤模型。实验分为对照组、模型组和中药低、中、高剂量组。对照组为无血清DMEM培养基(不含10%FBS)，模型组为含有1 mmol /L MPP+的无血清培养基，中药低、中、高剂量组分别含有2.5、5、10 g/L EGb761及10%FBS的DMEM培养基。 1.6 MTT法检测细胞存活率 用0.25%胰酶将细胞稀释为5×106个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔加200 μL悬液，置于培养箱中培养。细胞贴壁后，置于培养箱中常规培养。每组设4个复孔，实验重复4次。培养48 h后弃去培养基，每孔加20 μL浓度为0.5 g/L的MTT，继续孵育4 h。弃去培养基，加200 μL DMSO，震荡1 min，于酶标仪波长570 nm处检测各孔吸光度(OD)值，取其平均值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=实验组OD值?对照组OD值×100%。 1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 用PBS清洗细胞2次，用不含EDTA 0.25%胰酶消化SH-SY5Y细胞，收集对数期生长期细胞。用PBS洗涤细胞2次，2000 r/min离心3 min，调整细胞密度为3×104个/mL。各组细胞孵育24 h后，加入500 μL Binding Buffer?5 μL AnnexinV-FITC及5 μL碘化丙啶混匀，室温避光反应10 min，于室温下避光反应10 min，进行观察和检测分析。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数?(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。 1.8 硝酸还原法测定一氧化氮含量 分别取形态学观察实验中5个实验组的细胞，反复冻融3次使细胞破裂，收集培养液100 μL，按试剂盒说明书进行操作，分别测得各组OD值，计算NO含量? 1.9 细胞形态学观察 取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶调整细胞浓度为3×104个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，置于培养箱中常规培养?细胞贴壁后，继续培养48 h，置于倒置显微镜下观察细胞形态。 1.10 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以―x?s表示，组间比较采用方差分析及LSD-t检验?P<0.05表示差异有统计学意义? 2 结果 2.1 EGb761对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响 与对照组比较，模型组SH-SY5Y细胞存活率下降(P<0.05);与模型组比较，中药中、高剂量组SH-SY5Y细胞存活率升高(P<0.05)。结果见表1。 2.2 EGb761对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响 与对照组比较，模型组SH-SY5Y细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较，中药中、高剂量组SH-SY5Y细胞凋亡率降低(P<0.05)。结果见表2。 2.3 EGb761对MPP+诱导SH-SY5Y细胞一氧化氮含量的影响 与对照组比较，模型组SH-SY5Y细胞NO含量升高(P<0.05);与模型组比较，中药中、高剂量组SH-SY5Y细胞NO含量降低(P<0.05)。结果见表3。 2.4 EGb761对MPP+诱导SH-SY5Y细胞形态的影响 对照组SH-SY5Y细胞多呈梭形或椭圆形，细胞表面有少量细长突起，细胞状态增殖良好;模型组SH-SY5Y细胞皱缩成圆形或椭圆形，边界模糊，细胞形态差异较大，有较明显的凋亡特征;中药各剂量组细胞亦有少数细胞凋亡的现象 发生，但是明显少于模型组，细胞皱缩现象减少，细胞数量较模型组明显增多，细胞生长较均匀，外形规则，正常突起较多。结果见图1。 3 讨论 人神经瘤母细胞SH-SY5Y衍生于人的神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，是一种重要的具有多巴胺能特性的神经瘤细胞，是研究神经元凋亡的最常用细胞模型。MPP+可选择性诱导黑质多巴胺神经元缺失，通过使线粒体能量缺失，降低细胞膜电位、损伤线粒体呼吸链，从而导致过氧化产物和自由基增加，引起细胞的凋亡[6-7]，是公认的能诱导神经元凋亡的细胞毒素。实验常用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞来模拟PD体外模型[8-9]?因此，本实验采用MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡作为PD体外模型? 银杏叶提取物EGb761含有多种活性成分，如黄酮类?萜内酯类?酚酸类化合物等。黄酮类与糖苷结合具有清除氧自由基，对抗兴奋性神经递质的释放、拮抗血小板活化因子等药理活性[10-11]，并能降低MPP+诱导的细胞毒性，起到保护神经细胞的作用[12-13]。 本实验结果显示，1 mmol/L MPP+使SH-SY5Y细胞存活率下降至43.66%，5、10 g/L EGb761均能提高SH-SY5Y细胞存活率。2.5、5、10 g/L EGb761分别与MPP+同时处理细胞后，细胞凋亡率由模型组的89.32%分别降至73.61%、33.68%、15.76%。 细胞凋亡是在病理和生理条件下细胞的一种主动死亡过程，主要包括细胞皱缩变圆，与相邻细胞分离，细胞浆和染色质浓缩，导致细胞膜内陷，细胞分离成多个凋亡小体。近年来，随着人们对于细胞凋亡机制的不断深入研究，发现有很多物质诸如小分子化合物NO参与了凋亡的过程。NO是一种自由基，也是体内重要的信使分子，可以通过多种途径影响细胞的凋亡。细胞在病理状态下，一氧化氮合酶得到活化，产生大量的NO，NO通过诱导针对肿瘤细胞及周围细胞的细胞毒效应促进细胞凋亡。NO发挥促进凋亡的机制可能为: ?NO通过细胞内的氧化还原电位，促进细胞色素C的释放， 活化细胞凋亡信号通路。?通过抗氧自由基活性，减少脂质 过氧化产物的生成，从而保护细胞膜的完整性。?保护线粒 体结构功能的完整性，防止细胞凋亡的发生?本实验结果显 示，细胞经1 mmol /L MPP+处理后NO含量升高，当加入不同 剂量EGb761后，SH-SY5Y细胞NO含量降低。本研究使用倒置 显微镜观察各组细胞形态，对照组细胞生长状态良好，模型 组细胞显示出明显的凋亡特征，实验组经不同浓度EGb761处 理后，中药各剂量组细胞亦有细胞凋亡的现象发生，但是明 显少于模型组。 综上所述，EGb761能够显著降低MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡，从而起到保护细胞损伤的作用，推测其机制可能 与抑制细胞内NO自由基的含量有关。 参考文献: [1] CAMPDELACREU J. 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