星型胶质细胞参与三叉神经尾端亚核中枢敏化过程

星型胶质细胞参与三叉神经尾端亚核中枢敏化过程 星型胶质细胞参与三叉神经尾端亚核中枢 敏化过程 第37卷第1期 2011年3月 兰州大学(医学版) JournalofLanzhouUniversity(MedicalSciences) V.37No.1 Mar.2011 文章编号:1000—2812(2011)01—0011—05 星型胶质细胞参与三叉神经尾端 亚核中枢敏化过程 吴萌,沈海丽,汉华,汪泽皓,夏亚一,王志平.,韵向东,汪静 f1.兰州大学第二医院骨科研究所;2.兰州大学第二医院风湿科; 3.兰州大学第二医院b2Z,N~'b科,甘肃兰州730030) 摘要:目的观察化学性刺激刺激大鼠牙髓造成的炎性痛后,星彤胶质细胞及谷氨酰胺合成酶(GS1在 三又神经尾端亚核(Vc)内的表达变化.方法大鼠分为芥茉油组,石蜡油对照组和完全空白对照组.通 过制备大鼠炎性牙痛模型,应用免疫荧光双标记实验方法,观察Vc内星形胶质细胞特异性标记物一胶 质纤维酸性蛋白(GFAP)和GS的表达变化.结果芥末油所致的炎性牙痛大鼠,其Vc内GFAP和GS的 表达数量和荧光强度明显增强,共聚焦显微镜观察GFAP和GS有很高的共存率,这些指标同石蜡油对 照组和完全空白对照组之间比较差异有统计学意义f尸<0.05),而石蜡油对照组和完全空白对照组之 间比较,其Vc内GFAP和GS的表达数量,荧光强度和共存率差异无统计学意义. 结论Vc内的星形胶 质细胞被芥末油刺激牙髓造成的炎性刺激激活,且GS的活性增强,表明激活的星 形胶质细胞及GS的 活性增强可能在颌面部炎性痛中发挥重要的作用. 关键词:三叉神经尾端亚核;特异性标记物一胶质纤维酸性蛋白;谷氨酰胺合成酶; 免疫组织化学;大 鼠;疼痛 中图分类号:R745.1文献标识码:A Astrocyte'Sinvolutionincentralsensitizationin rattrigeminalcaudalsubnucleus WuMeng,SHENHai—li.,HANHua,WANGZe—hao,XIAYa—yi, WANGZhi—ping., YUNXiang—dong,WANGJing 《1.InstituteofOrthopaedicsSecondHospitalofLanzhouUniversity;2.DepartmentofRheumatology, SecondHospitalofLanzhouUniversity;3.DepartmentofUrologySecondHospitalofLanzhou UniversityLanzhou70~0030,China) Abstract:OeetiveTodetecttheexpressionofglialfibriliaryacidicprotein(GFAP)and astroglialenzymeglutaminesynthetase(GS)attrigeminalsubnucleuscaudalis(Vc)byapplication ofaninflammatoryirritantfallylis0thiocvanate,MO)totherats'toothpulp.MethodsAllrats weredividedintothreegroups,MOgroup,paraffinoilgroupandnaive.Theexpressionof GFAPandGSandtheirCO— existenceinVcweredetectedbyimmunofluorescencehistochemical double—stainingtechnique.ResultsThenumbersandopticaldensityvalueofGFAPorGS 收稿日期:2010—07—19 基金项目:国家自然科学基金f30800333) 作者简介:吴萌(1977一),男,甘肃兰州人,硕士,研究方向为骨关节疾病,e— mail:wumengO330@yahoo.com.cn. 汪静(1976一),女,甘肃兰州人,博士研究生,研究方向为痛感觉与痛调制, e—mail:wangjinglmail(~163.corn,通信联系人 12兰州大学(医学版)第37卷 immunoreactivitywereincreasedsignificantlybyapplicationofMOtotherats'toothpulp.The expressionofGFAPandGSCO—existedhighlyatVc,whichobservedbyconfocallaser— scanning microscope.ThesechangesmentionedabovebetweenMOgroup:paraffinoilgroupandnaive weresignificantlydifferentfP<0.o5).However,thereisnodifferencebetweenparaffinoilgroup andnaiveaboutnumbersandopticaldensityvalueofGFAPorGSandCO— existenceofGFAP andGSatVe.ConclusionAstrocytesandGSinVcareirritatedbyapplicationofMOtothe rats'toothpulp.TheresultofpresentexperimentindicatedthatastrocyteandGSmodulation mayplayanimportantroleinoralfacialinflammatorypain. Keywords:trigeminalsubnucleuscaudalis;glialfibriliaryacidicprotein;glutaminesynthetase; immunohistochemistry;rat;pain 近年对星形胶质细胞的研究表明,其细胞膜 上存在着许多离子通道,神经递质的受体,能够 产生和释放神经活性物质,并与神经元问存在着 广泛的信号交流【ll.活化的星形胶质细胞产生和 释放神经活性物质,通过突触,缝隙连接和细胞 间信号交流,在受体,离子通道,信使传递,基因 转录和翻译等多级水平全面影响和调节神经元的 兴奋性,导致疼痛中枢敏感化的发生[2】.谷氨酸 在中枢敏化过程中发挥着重要的作用.由于星形 胶质细胞的一个主要功能是生成谷氨酰胺,而谷 氨酰胺能最终代谢为谷氨酸,这个过程是通过谷 氨酸一谷氨酰胺循环途径实现的,该途径包括星形 胶质细胞重摄取突触间隙过多的谷氨酸,通过谷 氨酰胺合成酶(glutaminesynthetaseGS)生成谷氨 酰胺,并被星形胶质细胞释放到细胞间隙,神经 元通过A转运系统再摄取谷氨酰胺,进入神经元 胞浆内,在线粒体内代谢,重新生成谷氨酸,从而 补充神经元谷氨酸神经递质池[3]'进一步参与痛 信息的传递.这些研究表明星彤胶质细胞可能在 疼痛f如炎性痛,神经病理痛等)中扮演着重要的角 色.我们以往的电生理学实验研究发现星型胶质 细胞在化学刺激外周神经引起的三又神经尾端亚 核(trigeminalsubnucleuscaudalis,Vc)中枢敏感化 中起着重要的作用【,但该研究缺乏形态学的证 据.本研究拟观察Vc星形胶质细胞及谷氨酰胺合 为星型胶质 成酶在颌面部化学性刺激后的变化, 细胞及谷氨酰胺合成酶参与Vc中枢敏感化并进 一 步参与三叉神经痛提供形态学的依据. 1材料与方法 1.1仪器和试剂 恒冷箱冰冻切片机(德国Leica公司),激光共 聚焦显微镜(德国Leica公司),荧光显微镜(日本 Olympus公司);芥末油,小鼠抗胶质纤维酸性蛋 白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)多克隆抗 体,兔抗GS单克隆抗体(均为美国Sigma公司产 品). 1.2动物模型的制备 s—D大鼠,成年雄性,体重290~420g,由甘肃 省中医学院动物中心提供,动物合格证为:scxk (甘)20090006.大鼠随机分为芥茉油组,石蜡油对 照组和完全空白对照组.采用的动物模型为炎性 牙痛动物模型,造模方法参照Chiang等[】的方法, 制备动物模型过程简述如下:大鼠腹腔内注射聚 氨酯混合注射液(1g/kg)和氯醛糖(50mg/kg) 进行麻醉,暴露上颌右第一磨牙,用一低速牙钻去 除牙釉质,暴露牙髓,用浸透生理盐水的棉花球暂 时覆盖.建立急性化学刺激诱导的炎性牙痛模型, 移除浸有生理盐水的棉花球后,将一被芥末油浸 透的软纸小心地放入牙髓腔,并用一小团牙科水 泥封闭牙髓腔.石蜡油对照组操作同上,只是 用石蜡油代替芥末油.完全空白对照组为不经任 何处理的空白大鼠. 1.3制片 开 大鼠牙髓放人芥末油或石蜡油30min后, 胸,经左心室插管至升主动脉,先以10mmol/L磷 酸盐缓冲液fpH7.4)80,-~100mL冲去血液,再以 250mL含4%多聚甲醛和75%的饱和苦味酸的 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)快速冲洗,灌注固 定,而后250mL的灌注液缓慢滴注,持续1.5,-,2 h.灌注完毕迅速取脑干,于上述新鲜固定液中后 固定4,6h(4.C),然后将脑置人含30%蔗糖的0.1 mol/L磷酸缓冲液中(4.C)过夜.待脑组织在蔗糖 中沉底后,用恒冷箱切片机冠状切片,片厚20m, 每隔3张取1张,切片分4组收集于10mmol/L磷 酸盐缓冲液中待用. 第1期吴萌等:星型胶质细胞参与三叉神经尾端亚核中枢敏化过程13 1.4免疫荧光组织化学染色 任取芥茉油刺激牙髓组大鼠一套脑十切片, 在10mmol/L磷酸盐缓冲液中漂洗,10min/次,3 次后,进行GFAP和GS免疫荧光双重染色,主要 步骤如下:(1)置人小鼠抗GFAP抗血清(1:1000 稀释)和兔抗GS抗血清(1:2000稀释)混合液中,室 温孵育2h后,置入4.C冰箱中孵育48,72h;(2) 用10mol/L磷酸盐缓冲液漂洗10min/次,3次后, 再置人异硫氰酸荧光素ffluoresceinisothiocyanate, FITC)标记的羊抗小鼠IgG血清(1:200稀释)和得 克萨斯红(Texasered)标记的羊抗兔IgG血清(1: 200稀释)混合液中,4.C冰箱中过夜.上述抗体均 用含5%的正常羊血清,0.3%曲拉通X一100(Triton X一1001,0.05%的叠氮钠和0.25%的角又菜胶的10 mmol/L磷酸盐缓冲液来稀释.把切片裱于清洁的 载玻片,室温干燥后,用对荧光物质具有保护作用 的封片剂加盖玻片封片.荧光显微镜短暂观察是 否有阳性结果后,用激光共聚焦显微镜进一步详 细观察并照相. 石蜡油对照组和完全空白对照组制片及具体 染色过程同上. 1.4.1阴性对照试验 取上述各组第二套脑干切片在10mmol/L磷 酸盐缓冲液中漂洗,10min/次,3次后,用正常兔 血清替代小鼠抗GFAP或者兔抗GS或者省略一 抗,其余染色步骤同上,进行对照试验,未见阳性 标记产物. 1I4.2尼氏染色 取上述各组第三套脑干切片在10mmol/L磷 酸盐缓冲液中漂洗,10min/次,3次后,进行尼氏 染色,以便对照观察阳性结果的部位. 1.4.3阳性细胞计数 参考Stuesse等[6]的计数方法对每组大鼠脑干 切片进行计数,在荧光显微镜配备的图像分析 系统下,每张切片在Vc背部区域选取5个视野, 在2O倍镜下,对视野内GFAP阳性细胞数,GS阳 性细胞数及GFAP/GS双标细胞进行计数,以均 数土标准差f土s)表示,同时对GFAP阳性细胞和 GS阳性细胞的荧光强度进行半定量分析,计算光 密度值. 1.5统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行分析, 数据用均数土标准差(土s)表示,各组间GFAP阳 性细胞数,GS阳性细胞数及GFAP/GS双标记细 胞数及光密度值的差异用t检验,以P<0.05为差 异具有统计学意义. 2结果 免疫荧光双标记实验和激光共聚焦技术观察 完全空白组大鼠脑干GS和星形胶质细胞特异性 标记物GFAP的表达和分布f图1),可见GS主要局 限分布在脑干的灰质,尤其密集于Vc,而GFAP在 脑干的各个部位均有分布,并且大部分GFAP也 表现出GS免疫阳性.在牙髓内放入石蜡油30min 后,观察到大鼠Vc内GS和GFAP的表达和分布 与空白对照组之间比较无明显差异fP>O.05),而 牙髓内放入芥末油30min后的大鼠脑干切片,观 察到GS和GFAP的表达由Vc的背侧部分向中间 部分扩散,并且表达数量和荧光强度都明显增强, a:激光共聚焦Vc低倍镜下芥末油组GFAP标记的 细胞,标尺为500m;b:激光共聚焦Vc低倍镜下芥 末油组GS标记的细胞,标尺为500m;c:高倍镜 下Vc内GFAP/GS双标记的细胞,标尺为50m. 图1芥末油组GFAP和GS免疫荧光双标记图 14兰州大学(医学版)第37卷 星形胶质细胞显着被激活,细胞胞体变大,突起 增多,增粗,延长,G8和GFAP之间有很高的共存 率,与石蜡油对照组和完全空白对照组之间比较 差异有统计学意义(表1,2). 表1Vc内GFAP,GS和GFAP/GS免疫阳性 细胞数 完全空白对照组57.00+2.1351.00~1.724500=1=1.97 石蜡油对照组63.00~243a58.00~1.87a47.004-207 芥茉油组167.00士3.75152.00~-2.5814100~3.13 n=6;a:与芥茉油组比较,尸<0.05. 表2Vc内GFAP免疫阳性细胞和GS免疫阳性 细胞光密度值 a:与芥茉油组GFAP比较,P<0.05;b:与芥茉油组 GS比较,P<0.05. 3讨论 星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的 胶质细胞.研究表明星形胶质细胞并非完全辅助 细胞,它在引导突触发生,促进突触生长,指导突 触凋亡,调节突触传递及维持突触的正常功能等 方面也起重要作用[引.星形胶质细胞和神经元之 问关系密切,它们对神经元周围微环境的改变非 常敏感,能迅速发生反应,同时激活的星形胶质细 胞能释放大量的神经活性物质和促炎性因子.谷 氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,参 与疼痛信息的传递,突触间隙内谷氨酸的重摄取 主要依赖于星形胶质细胞,在星形胶质细胞内通 过GS生成谷氨酰胺,释放到细胞间隙,被神经原 突触前末梢摄取,重新代谢为谷氨酸,补充谷氨酸 神经递质池,形成了谷氨酸谷氨酰胺循环途径, 而GS在该循环中起着重要的作用,从而在痛信息 的传递过程中发挥重要的作用_3]3. 先前的研究发现Vc伤害性感受神经元对芥 末油刺激牙髓会产生敏感化【4】'而且此敏感化可 以被星型胶质细胞内谷氨酰胺合成酶或顺乌头酸 酶阻断[,8I,提示Vc星型胶质细胞在炎性刺激下 可能被激活而产生反应,并进一步参加对炎性痛 的调节.本研究发现Vc星型胶质细胞在芥末油刺 激牙髓的情况下被明显激活,而且GS的表达明显 增强,从而证明了上面的假设,为Vc星型胶质细 胞及谷氨酸一谷氨酰胺循环参与炎性痛的调节提 供了直接的形态学证据.Vc星型胶质细胞不仅参 与对炎性痛的调节,它也可能参与对神经病理痛 的调节,有研究表明在下颌神经切断造成的神经 病理痛模型中,星型胶质细胞明显被激活,而顺乌 头酸酶抑制剂可抑制星型胶质细胞的激活及伤害 性感受行为[9l.这些研究表明星型胶质细胞通过 胶质网络传递信号,从而与神经元互补,共同参与 疼痛的传导. 参考文献 I1fALLENNJ,BARRESBA.Signalingbetweenglia andneurons:focusonsynapticplasticity[J].Curr OpinNeurobiol,2005,15(5):542—548. f21BACCIA,SANCINIG,VERDERIOC,eta1.Blockof glutamate—glutaminecyclebetweenastrocytesand neuronsinhibitsepileptiformactivityinhippocam— pus[J].JNeurophysiol,2002,88(5):2302—2310. j3JFONSECALL,MONTEIROMA,ALVESPM,eta1. 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(本文编辑:白维仁) (上接第14页) [9]OKADAOA,SUZUKII,SESSLEBJ,eta1.As— trogliainmedullarydorsalhorn(trigeminalspinal subnucleuscaudalis)areinvolvedintrigeminalneu— ropathicpainmechanisms[J].JNeurosci,2009 29(36):11161—11171. (本文编辑:吕吉臣)