CD34_造血干细胞研究进展

CD34_造血干细胞研究进展 〃小 专 论〃 - CD34 造血干细胞研究进展 ()王冬梅 裴雪涛 军事医学科学院输血研究所 ,国家生物医学分析中心 ,北京 100850 摘要 新近研究发现 ,在小鼠和人体内存在一类 CD34 抗原阴性的造血干细胞 ,它们以其更广泛的 增殖和分化潜能 ,向临床造血干细胞移植提出了新的挑战和选择 ,也引起了人们的关注 。本文对- CD34 造血干细胞目前的研究进展加以阐述 。 关键词 造血干细胞 ; CD34 抗原 ;造血重建 学 科分类号 Q461 lo/ - - - 一 、CD34 造血干细胞存在的证据 CD34Lin 。此 结 果 提 示 , 人 类 也 可 能 存 在 - CD34 分子 是 一 个 跨 膜 的 唾 液 粘 蛋 白 , 达 在CD34 造血干细胞 。 - 1 %,3 %的人骨髓细胞表面 。体外检测发现 ,骨髓 为了证明确实存在人 CD34 造血干细胞 , Zan2 + 1 2 ( 中的 CD34 细胞群承担了绝大部分的造血活力 如 jani 实验室及 B hatia 实验室分别设计了巧妙的 ) 果不是全部的话,并且移植免疫缺陷的小鼠后能够 动物体内移植实验 。在 Zanjani 等建立的人/ 绵羊异 - - 在受者体内分化生成各类血细胞 ,因此 CD34 分子 种移植模 型 中 , 移 植 纯 化 的 人 Lin CD34 细 胞 60 被认为是造血干细胞的阳性标志 。目前 ,临床和实 天后 ,在受者体内可检测到多系供者造血 ,更令人感 9 + + 兴趣 的 是 还 检 测 到 约 10人 CD34 细 胞 , 支 持 了 验室多是基于对 CD34 细胞的富集来筛选造血干 - + 细胞的 。 CD34 细胞可能为 CD34 细胞的前体细胞的说法 。 - -但是 ,1996 年 Osawa 提出 , 具有重建长期造血 二次移植的成功也证明第一次植入的 Lin CD34 lo/ - 活 力 的 小 鼠 干 细 胞 的 表 型 为 mCD34, 而 细胞中确实含有多能造血干细胞 。B hatia 等分别用 + - - - + mCD34 细胞只具有迅速但并不持久的造血活力 。 Lin CD34 细 胞 和 Lin CD34 细 胞 分 别 移 植 - + 他 们 给 受 致 死 剂 量 照 射 的 受 者 输 注 单 一 一 个 NOD/ SC ID 小鼠则发现 ,Lin CD34 细胞移植小鼠 lo/ - + + - - mCD34c2Kit Sca21 Lin 细胞 。结果 21 %的受后 ,可 产 生 大 量 的 髓 系 和 B 系 淋 巴 细 胞 , 而 Lin - 者重建淋巴系统造血达三个月以上 ,而且在受者的 CD34 移植后的小鼠 ,除了能产生和前者比例相当 lo/ - + 骨髓中检测到供者来源的 mCD34和 mCD34 细 的髓系和 B 系 淋 巴 细 胞 外 , 还 能 产 生 表 达 CD2 和 lo/ - CD3 以及 CD4 和 CD8 的 T 系淋巴细胞 。临床移植 胞 ,证明植入的 mCD34细胞在体内进行了扩增 + + 3 并且分化产生了 mCD34 细胞 。二次移植供者来源 病例也证明 CD34 细胞缺乏向 T 系分化的能力:lo/ - + + - + 的 mCD34c2Kit Sca21 Lin 细胞仍可重建受者 移植纯化的 CD34 细胞 58 天后 , 病人体内仍检测 + 造血达四个月 。具有二次移植能力的细胞无疑为干 不到 CD3 细胞 ,而在移植全骨髓的对照组病人体 - - 细胞 。虽然这一发现引起了人们极大的兴趣 ,但毕竟 内可以检测到 。由此说明 ,Lin CD34 细胞群具有 + 只是关于小鼠造血干细胞的实验 ,而人和鼠的造血干 更广泛的分化潜能 ,与 CD34 细胞相比可能处于造 细胞在 CD34 分子表达上的关系还不是很清楚 。 血阶层的更早期 。 4 Goo dell 等 的 实 验 则 提 示 , 人 类 也 可 能 存 在 采用人/ 绵羊异种移植改进模型,在 4,6 个 - CD34 造 血 干 细 胞 。 他 们 基 于 荧 光 染 料 月的时间内就可鉴定出一群细胞的造血活力 。利用 - + Hochest 33342 的迅速泵出在小鼠骨髓中发现了一群 这一模型比较 CD34 和 CD34 细胞的造血潜能则 4 + ( ) 特殊的细胞 ,称为 SP side pop ulatio n。这群细胞具 发现 ,移植 4 ×10CD34 细胞的嵌和体在经过四轮 有长期骨髓再植能力 ,更重要的是 ,进一步研究发现 生长因 子 处 理 后 就“耗 尽”了 , 而 移 植 数 量 相 当 的 - 它们不表达 mCD34 分子 。利用这一方法 , 他 们 在 CD34 细胞的嵌和体并没有表现出明显的“消耗”。 - 以上实验都证明 ,体内确实存在 CD34 造血干 人类 也 找 到 了 一 群 类 似 的 SP 细 胞 , 其 表 型 为 + 细胞 , 它与传统认为的 CD34 造血干/ 祖细胞有着 的帮助 。 - + 明显的差异 ,有着更广泛的分化潜能 。三 、CD34 造血干细 胞 与 CD34 造 血 干/ 祖 细 - - 二 、L in CD34 细胞体外培养特性胞在已知基因表达上的差异 - + 在体外培养中 ,Lin CD34 细胞一个显著的特 采用 R T2PCR 技术对小鼠造血干细胞基因表达 - + - ( ) 征是表现出很强的克隆形成细胞 CFC和长期培养 情况进行分析发现 ,CD34 、CD34 、Lin 细胞都表达 - - () β启动细胞 L TC2IC活力 。为了检测 Lin CD34 细 看 家 基 因 HPR T、GAPDH 和 2Actin 。 GATA 21 在 + - 胞的体外造血活力 ,同样对其进行了这两方面的实 CD34 细胞阶段开始表达 ,而 GATA 22 早在 CD34 细2- - - - - 。结 果 Lin CD34 、Lin CD34 CD38 及 胞阶段就已经开始表达 ,并随细胞分化而下调直至消 验 - - - + 失 。所有细胞因子的受体在 Lin 细胞上都可以检测 Lin CD34 CD38 都表现出很低的 L TC2IC 活力 ; - - - - - + βLin CD34 及 Lin CD34 CD38 细胞的 CFC 活力 到 ,CD34 祖细胞不表达 IL22R、IL27R 和 IL29R ,而 - + - - 目前认为这三者的表达始于定向祖细胞阶段 ; 对于 也明 显 低 于 Lin CD34 CD38 细 胞 , 只 有 Lin - + - αγCD34 CD38 细胞表现出相对较高的 CFC 活力 ,但 CD34 干 细 胞 , 除 了 IL21R、IL22R、A IC22B 、c2Kit 、 是所 有 这 些 CFCs 都 定 向 于 红 系 。但 这 并 不 证 明 EPO2R 和 c2mpl 外 ,其他检测的基因如 IL23R 、IL26R - - - Lin CD34 细胞的造血活力差 ,很可能是由于它们 和 GM2CSFR 等均不表达 。这正是 CD34 干细胞仅 代表了更原始的造血干细胞 ,而目前还不了解它们 在 IL23 存在时不能形成克隆的原因 。 在体外培养所需要的更合适的条件 。 利用 R T2PCR 只能检测已知基因表达的差异 , - - - 随后许多研究人员对 Lin CD34 细胞的体外而 CD34 造血干细胞作为一种新型的造血干细胞 , 5 培养条件进行了进一步的研究 。Fujisaki 等采用 必定存在许多决定其性状的未知基因 ,因此采用其 五种细 胞 因 子 组 合 的 无 血 清 悬 浮 培 养 体 系 , 培 养 它 可 高 效 分 析 和 分 离 差 异 表 达 基 因 的 方 法 , 如 - - - - Lin CD34 CD38 细胞 10 天 后 , 细 胞 总 数 增 加 了 SA GE 、DD2PCR 、RDA 、SSH 等 , 找出 CD34 造血干 + + 28 ?8 倍 ,并且生成了少量的 CD34 细胞 。但是这 细胞和 CD34 造血干/ 祖细胞的差异表达基因 , 可 些细胞迅速向终末分化 , 只检测到很低的 L TC2IC 有助于深入理解造血干细胞分化发育过程中的调控 活力 ,也不能移植免疫缺陷的小鼠 。相反 ,在人脐静 机制 。 ( ) 脉内皮细胞 HU V EC条 件 培 养 液 培 养 条 件 下 , 虽 四 、CD34 分子在造血干细胞上可逆表达 - - - 7 然 Lin CD34 CD38 细胞的数目维持稳定甚至稍 Sato 等采用同系小鼠移植实验对 CD34 分子 有下 降 , 但 植 入 NOD/ SC ID 小 鼠 的 能 力 却 明 显 增 在造血干细胞上的表达进行了研究 。供者分别为正 2( ) 。这提示 ,再植能力的增强和自我更新并无直常小鼠和 52FU 52fluo ro uracil处理 小 鼠 。52FU 对 强 - - - 接关系 ,而是刺激 Lin CD34 CD38 细胞进入了一 分裂中的细胞有毒 ,因此可快速清除骨髓中的定向 种移植所需的状态 ,如表达归巢受体或粘附分子等 。祖细胞 ,动员静止的干细胞进入细胞增殖周期 ,并可 6 能使其进入血液循环 。分别采集正常小鼠和 Nakamura 等第 一 个 用 体 外 实 验 证 实 了 52FU - + + - + - 处理后小鼠的骨髓后 ,分离出 Lin c2Kit Sca21 细 CD34 细 胞 可 分 化 成 CD34 细 胞 。他 们 将 Lin - + - CD34 细胞铺在小鼠骨髓基质细胞系 H ESS25 上 , ,再分成 CD34 和 CD34 两部分分别进行移植 。 胞 - 再加上胎牛血清及多种细胞因子联合培养 ,不仅可 结果来源于正常供者的 CD34 细胞使全部 8 个受 + 者都获得了植入 ,而 CD34 细胞移植的 8 个受者中 维持细胞的活力 ,而且七天以后 ,细胞的数目增加了 2 . 2 ?0 . 8 倍 ,并且平均 6 . 0 % ?3 . 7 %的细胞开始表 仅有 1 例植入 。相比之下 , 来源于 52FU 处理小鼠 - + - 达 CD34 分子 。CFU2C 检测发现 ,虽然培养前 Lin 的 CD34 和 CD34 细胞均使受者获得了水平相当 - - CD34 细胞不具有克隆形成能力 ,培养七天后 ,平均 的植入 。而如果细胞先经过培养 ,使 75 %的 CD34 + 每 1000 个细胞可形成 82 . 2 ?41 . 1 个克隆 ,细胞的 细胞都表达 CD34 分子 ,则结果就会相反 : CD34 细 - 克隆形成能力与培养后 CD34 分子的表达呈明显的 胞可植入受者而 CD34 细胞不能 。以上实验表明 , - ( ) () 正相关 r = 0 . 91。利用 NOD/ SC ID 小鼠移植实验 在某种条件下 52FU 处理或体外培养,CD34 细胞 - - 被激活进入一种活化状态 ,并且获得了 CD34 的表 检测培养前后 Lin CD34 细胞重建长期造血的活 力 ,结果显示 ,供者细胞植入的程度和培养过程中诱 达 。在激 活 状 态 下 , 干 细 胞 更 易 于 植 入 受 者 体 内 。 + 导出的 CD34 细胞的总数呈正相关 。这一发现对 Dao 认为这种激活不是简单的静止细胞由 Go 期进 - 入细胞周期 ,因为在他们的实验中 ,通过减少周期蛋 于进一步的研究和操作 CD34 造血干细胞有很大 +- - 白依赖性激酶的抑制剂也可以诱导静止的 CD34 ,Lin CD34 细 胞 是 一 群 异 质 性 的 细 胞 , 总之 细胞进入细胞周期 ,但并没有相应的 CD34 分子表 目 前 面 临 的 首 要 任 务 是 安 排 到 一 个 可 以 筛 选 - 达水平的改变 。 CD34 造血干细胞的阳性标志 。 + Sato 等用同样的实验证明 ,活化的 CD34 细胞六 、结语 - 7 - 仍可回到静息的 CD34 细胞状态。以上实验结 对 CD34 造血干细胞的研究给临床造血干细 果提出一个问题 ,即 : 细胞活化状态的改变与 CD34 胞移植提出了新的挑战和选择 ,这在干细胞移植 、细 分子表达的改变是否存在着因果关系 ? 这一点目前 胞治疗 、成分输血和基因治疗领域具有十分重要的 - 影响 。因此 ,只有努力对 CD34 造血干细胞进行更 还不能证明 。 - 五 、CD34 造血干细胞分离纯化方法的研究深入 、透彻的研究 ,最终才能达到指导临床应用的目 - 要对 CD34 造血干细胞进行研究 ,前提是必需 的 。在此之前 ,或许只有基于排除成熟细胞的负性 筛选造血干细胞的方法才是最可靠的 。 能把它分离出来 ,但是现在还没有找到可用于直接 - 分离 CD34 造血干细胞的阳性标志 ,这也从一方面 说明了为什么它一直没有被发现 。目前均采用负性 参 考 文 献 - 筛选技术来分离 CD34 造血干细胞 ,也有一些实验 - 1 Zanjani ED , Almeida2Porada G , Livingsto n A G , et al . Hu2 室找到了某个阳性标志 ,来对负性筛选出的 CD34 - man bo ne marrow CD34 cells engraf t in vivo and undergo 造血干细胞做进一步的富集 。 + 2 - - multilineage exp ressio n t hat includes giving rise to CD34 最初 ,B hatia 等在筛选 Lin CD34 细胞过程cells. Exp Hematol , 1998 , 26?353,360 . 中首先采用 StemSep 负性筛选系统排除了人脐带血 2 Bhatia M , Bo nnet D , Murdoch B . A newly discovered class - 中表达十种不同系特异抗原的单核细胞 ,然后 Lin 细of human hematopoietic cells wit h SCID2repop ulating activi2 胞再用和 F I TC 相连的 CD34 单抗 ?标记 ,流式细 胞 t y. Nat Med , 1998 , 4?1038,1045 .- + - 仪分析把 Lin 细胞分成两群 : CD34 和 CD34 。 顾Bornhauser M , Thiede C , Brendel C. Stable engraf t ment 3 - - 名思义 ,Lin CD34 细胞不表达至少十种系特异 af ter megadose blood stem cell t ransplantatio n across t he 性抗原和 CD34 分子 。根据 CD38 的表达 ,又可将这 HL A barrier . Transplantatio n , 1999 , 68?87,88 . - + Zanjani ED. The human sheep xenograf t model for t he 4 群细胞分成两部分 : CD38 和 CD38 , 而且实验发 - - - st udy of t he in vivo potential of human HSC and in utero 现造血干细胞活力主要集中在 Lin CD34 CD38 8 gene t ransfer . Stem Cells , 2000 , 18?151 . 部分 。 Gallacher 等则 利 用 表 面 标 志 AC133 和 5 Fujisaki T , Berger M G , Rose2Jo h S. Rapid differentiatio n CD7 ,找到一群极其稀少但具有造血干细胞活力的 - - - of a rare subset of adult human Lin CD34 CD38 cells - - - + - 细胞 :Lin CD34 CD38 AC133 CD7 细胞 。它们 stimulated by multiple growt h factors in vit ro . Blood , - - - 是在 Lin CD34 CD38 细胞群的所有亚群中唯一 1999 , 94?1926,1932 .+ 一个可以经过体外液体培养产生 CD34 细胞 ,并且 Nakamura Y , Ando K , Chargui J . Ex Vivo Generatio n of 6 可以 移 植 NOD/ SC ID 小 鼠 的 亚 群 。另 外 , 利 用 + - CD34 Cells f ro m CD34 Hematopoietic Cells. Blood , 9 - - CD164 分 子 , Zanjani 将 Lin CD34 细 胞 分 成 1999 , 94?4053, 4059 .+ - CD164 和 CD164 两群 。虽然两群细胞在小鼠 FB2 Sato T , Josep h HL , Ogawa M . Reversible Exp ressio n of 7 ( CD34 by Murine Hematopoietic Stem Cells. Blood , 1999 , MD21 饲养 层 上 均 不 能 形 成 卵 石 样 造 血 区 co bble2 94?2548,2554 .) sto ne area2fo r ming cells ,CA FC,但都可植入胎羊并 - + 8 Gallacher L , Murdoch B , Wu DMM . Isolatio n and charac2 维持多系造血 , 只是 CD34 CD164 亚群植入的水 - - + - - - terizatio n of human CD34 Lin and CD34 Lin 平要明显高于 CD34 CD164 亚 群 。因 此 , 他 们 认 hematopoietic stem cells using cell surface mar kers AC133 - 为 CD164 可作为一个分离不成熟的 CD34 造血干 and CD7 . Blood , 2000 , 95?2813,2820 . 细胞亚群的新标志 。Zanjani ED. CD164 defines an immat ure subset of human 9 10 - 新近 ,Nakamura发明了一种过滤系统 ,可除 bo ne marrow CD34 negative stem cells. Blood , 1999 , 94? - - 去大部分的红细胞和血小板 ,使 Lin CD34 细胞富 462a . 集 16 . 8 ?8 . 81 倍 , 回 收 率 达 48 . 57 % ?13 . 59 % 。 Nakamura Y , Ando K , Muguruma Y. Enrichment of lin2 10 - eage2CD34 cells using a newly developed filter system. Br 富集的细胞再用 FACS 进一步纯化 ,避免了使用多 J Hematol , 2000 , 108?801,804 . 种单克隆抗体带来的非特异性结合等负影响 。