口服避孕药保护卵巢储备功能预防化疗对大鼠卵巢损伤的动物的研究(可编辑)

口服避孕药保护卵巢储备功能预防化疗对大鼠卵巢损伤的动物的研究(可编辑) 口服避孕药保护卵巢储备功能预防化疗对大鼠卵巢损 伤的动物的研究 南方医科大学 硕士学位论文 口服避孕药保护卵巢储备功能预防化疗对大鼠卵巢损伤的动物 研究 姓名:王敏 申请学位级别:硕士 专业:妇产科学 指导教师:何援利 20080415硕士学位论文 口服避孕药保护卵巢储备功能预防化疗 对大鼠卵巢损伤的动物研究 硕士研究生:王敏 指导老师:何援利教授 摘 要 研究背景卵巢早衰 系指妇女在岁以前绝经,常现 为雌激素水平降低引起的月经紊乱、不孕、围绝经期综合征等一 系列症状。 病因复杂,目前仍不清楚,化疗远期毒副作用是其中之一。随着化 学毒性药物 在肿瘤及自身免疫疾病的广泛应用,其导致的性腺功能损害成为研究新热点, 其中以环磷酰胺,为代表的烷化剂引起的卵巢功能损害 研究较多,但其作用机制仍不清楚。一些研究显示,可直接损伤卵巢颗粒 细胞,并主要作用于有丝分裂活跃的卵泡,而静止的生殖细胞呈低度敏感。另 有学者提出,化疗期间应用口服避孕药抑制卵泡发育,能够减少化疗对卵巢的 损害,依据是化疗药物损伤卵巢的机制和口服避孕药的作用机理,即通过雌孕 激素负反馈抑制下丘脑.垂体一卵巢轴,从而抑制卵泡发育,储存原始卵泡,保 护卵巢储备功能,减少卵巢损伤。相关研究也证实口服避孕药能够降低及预防 化疗对卵巢的损伤,促进化疗后卵巢功能甚至是生殖功能的恢复。但也有学者 持不同观点,结论尚有争议。本研究旨在探讨化疗期间应用口服避孕药能否保 护卵巢功能,以确定口服避孕药的有效性。 目的 本文采用阴道涂片法监测大鼠动情周期,放射免疫法和组织切片 法,检 摘要 测大鼠血清雌二醇水平、卵泡刺激素水平、卵巢重量及卵泡数量, 并通过统计学分析,比较实验前后各组实验指标变化,探讨口服 避孕药在化 疗期间有否起到保护卵巢的作用及其相关机制。 与方法 .级近交系雌性大白鼠,月龄,体重 ~,购自中山 大学实验动物中心。喂食级鼠饲料及净化水,室温??,相对湿度 /.%,每日光照,饲养周熟悉环境后,每日清晨:行阴道细胞涂 片,显微镜下观察动情周期,选用有正常动情周期的大鼠进入实 验。口服避孕 药.?.达英一炔雌醇/醋酸环丙孕酮由先灵广州药业有限公司 提供。环磷酰胺,规格.支,购自山西普德药业有限公司。 .预实验,以确定最大程度抑制大鼠卵泡发育的最低剂量:只雌 性大鼠随机分为组,灌胃给予不同剂量,第组:..炔雌醇 /.醋酸环丙孕酮;第组:.炔雌醇/.醋酸环丙孕酮;第组: .炔雌醇/醋酸环丙孕酮。灌胃后每天行阴道涂片,并在第天的动 情间期测定各组、浓度并进行比较。 .动物实验:只雌性大鼠随机分为组:?空白对照组:不予 任何药物处理;?组:负荷剂量 /?腹 /腹腔注射,之后 腔注射,连续;?组:.炔雌醇/.醋酸环丙孕酮溶于生 理盐水,灌胃,连续;?联合治疗组:同时给予和,连续, 给药方法同?、?组;?联合治疗组:先连续给予灌胃,用药剂量 同?组;第起加用,给药方法、时间及剂量同?组。 .采用阴道涂片法监测大鼠动情周期,放射免疫法测定、浓度, 试剂盒购自北京匕方生物技术研究所。所有卵巢标本均经石蜡包埋,连续切 片,苏木素.伊红染色。 从实验开始到结束,各组大鼠每天行阴道涂片,并于给药结束前,每隔 硕士学位论文 天相当于大鼠个正常动情周期,于动情间期测定各组、浓度;停药 后第、天相当于及个正常动情周期,测定各组、浓度。另外, 停药当天、第、天,分别处死各组/大鼠,比较卵巢重量、卵泡数量变 化。 .统计学处理采用.软件包检验分析,数据以均数士标准差蜘 表示,采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分析,两两比 较采用及法,所有结果均以.具有统计学意义。 结果 .预实验各组大鼠、浓度及动情周期变化 第组给药后,动情周期持续存在,、浓度高于第、组,差异有 统计学意义.。第、组给药~天后均出现持续不排卵,且两组间 及分别比较,差异均无统计学意义伊.,提示将剂量从 ../.增加到./,不能增加抑制大鼠卵泡发育及排卵的程度, 故认为..炔雌醇/.醋酸环丙孕酮这组剂量是可以抑制大鼠卵泡 发育的 最低有效剂量。 .各组大鼠、浓度及动情周期变化 大鼠、行重复测量分析,结果示各组、各时间点、分别 比较,差异均有统计学意义俨.,且实验分组和时间均有交互作用 尸 .。 空白对照组: 于动情间期测定../, ../。阴道涂片呈正常大鼠动情周期改变。 组:从给药第天至实验结束,持续下降,持续上升,与 同期其余组、分别比较,差异均有统计学意义?.。阴道涂片见 该组大鼠在给药~天后出现持续不排卵,至实验结束,动情周期仍 未恢复。 组:从给药第天至停药第天,该组、浓度均低于同期 摘要 空白对照组,差异有统计学意义妒.。停药第天,、浓度分别 与空白对照组比较,差异均无统计学意义俨.。阴道涂片见该组大 鼠在给 药~天后出现持续不排卵,停药天左右恢复正常动情周期。 联合治疗组:在联合给药第天,高于组,低于其余组, 而低于组及空白对照组,高于其余组,差异均有统计学意义泸 .。联合给药第天、停药当天、天,均高于同期组,低于空白 对照组,低于组和空白对照组,差异均有统计学意义.;与同 期其余组、相比,均无差异尸.。停药第天,高于组, 低于组,差异均有统计学意义尸.,与其余组分别比较,均无 差异俨.。阴道涂片见该组大鼠于给药~天后出现持续不排卵,停 药 天左右恢复正常大鼠动情周期。 联合治疗组:先给予药物的前天,、与同期组相 比,均无差异伊.。之后,在联合给药第天,高于组及联合治疗 组,低于空白对照组,同期低于组、空白对照组及联合治疗组, 差异均有统计学意义尸.;而、分别与组比较,差异均无统计 学意义尸.。联合用药第天、停药当天、天,均高于组,低 于空白对照组,同期均低于空白对照组及组,差异均有统计学意 义 妒.,而、分别与其他组比较,均无差异.。停药第 天,明显高于组,明显低于组,差异均有统计学意义尸., 与其余组分别比较,差异均无统计学意义?.。阴道涂片见该组大鼠在 给药天后出现持续不排卵,停药天左右恢复正常动情周期。 比较联合治疗、组的浓度,在联合给药第天,前者低于后者, 差异有统计学意义。之后组每次测定的比较,联合治疗组均高于组, 但差异均无统计学意义俨.。 .各组大鼠卵巢重量的变化 大鼠卵巢重量行析因分析,结果示各组、各时间点卵巢重量,差异均 硕士学位论文 有统计学意义。,.;.,.,且实验分组和时间 有交互作用.,.。 空白对照组大鼠卵巢重量为.?.。 组和联合治疗、组,在停药当天,大鼠卵巢重量降低,分别与 空白对照组比较,差异均有统计学意义.;而组之间相互比较,差异 均无统计学意义.。之后组卵巢重量均持续增长,至停药第天, 组基本恢复正常大鼠卵巢重量水平,与同期空白对照组比较,差异均无统计学 意义俨.。:同期分别比较联合治疗、组的卵巢重量,组均高于组, 但差异无统计学意义俨. 组按时间依次测定的卵巢重量,一直呈持续性下降,分别与同期 其余各组比较差异均有统计学意义俨.。 .各组大鼠卵泡数量的变化 各组大鼠卵泡总数及各期卵泡数目分别行析因分析,结果示各时间点 卵泡总数比较,无差异.,.,实验分组和时间也无交互作用 .,.,其余组间及时间点卵泡数目比较,差异均有统计学意义俨 .,实验分组和时间也均有交互作用.。 空白对照组大鼠卵泡总数为个,其中原始卵泡为个, 初级卵泡为个,次级卵泡为个,成熟卵泡为个。 组和联合治疗、组每次测定的卵泡总数,分别与空白对照组比 较,均无差异俨.。停药当天,组的原始卵泡比例明显增加,成熟卵泡 明显减少,与空白对照组原始卵泡、成熟卵泡分别比较,差异均有统计学意义 .。之后组原始卵泡比例逐渐减少,成熟卵泡逐渐增多,至停药第 天,组各期卵泡数量分别与空白对照组比较,均无差异伊.。联合治疗 、组间卵泡总数及各期卵泡数量分别比较,差异虽无统计学意义伊., 但组的成熟卵泡多于组。 组在停药当天至第天,卵泡总数及各期卵泡数量持续减少,其 摘要 中成熟卵泡减少最为明显,分别与其余各组比较,差异均有统计学意义伊 .。 结论 .环磷酰胺损伤大鼠各期卵泡,尤其是成熟卵泡,并且对卵泡生长有 刺激作用,加速原始卵泡发育为成熟卵泡,最终导致各级卵泡耗竭。 .口服避孕药通过雌孕激素负反馈作用,抑制了大鼠卵泡发育和生长, 储存了大量原始卵泡,有效保护了卵巢储备功能。 .联合治疗组中口服避孕药的应用,减少了卵泡对环磷酰胺的敏感性, 降低了化疗对卵巢的损伤,对卵巢功能的保护和恢复起到了一定的作用。 .由于实验条件有限,未能在停药后进行交配,故大鼠的生育功能是否 恢复,有待以后进一步实验证明。 关键词 卵巢功能 环磷酰胺 避孕药大鼠 硕士学位论文 : :., ,, , . , , ? ., ., , , ,.?, , .,, ,, , .,. . ,. , . , , , ,, . . , ?, ,. , , % . .,%. ,: ,/ .,“ .,. , .: , :硕士学位论文,:. /. ;:. /.;: . .. /, , . . /. . . : : 三 :;? :/ .. /:. /., ; : ? ? ;曼 :. /. . , .,. ?, ,? ., ,,、, ,、 ? , . , . . , 元.. 、、、 .. .、 、 ,尸.. , , 、, , 妒., ./, . /.. .、 ,、 、 ., .. ../、 、 . ../. ,: ,, , 妒.. . , :,,、 , 伊.. , 俨..硕士学位论文 . :, , , , , , 、.. , ,, ., 、,, 俨.. , 尸., ,,俨... :,. , , , , 、 、 妒., 、俨.. , , , 妒., , 、 ,, , .., 沪.,.. , , . , ,.. 、 、 、 , 、, ,.. , .,.;. ,., .,...士.., 谢 , , , 尸., , 尸.., 埘 , 妒.. , ,., .硕士学位论文, , , 俨.. .:吐 , .,.,.,.. ., ..士, , 一, . ,, 妒.. , ., 尸.. , . , . , 妒., . , , . , 妒.., . ,, . ,. . . . ,. , . ; ;; 硕士学位论文 南方医科大学大学 学位论文原创性 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包 含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明 确方式外, 本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属南方医科大学。 本人承诺承担本声明的法律效果。 作者签名: 王敏 日期:年月日 ?妇 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和 借阅。本人授权南方医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于请在以下相应方框内打“妒’: 、保密口,在一年解密后适用本授权书。 、不保密?。 勿纫 作者签名:王敏 日期:年月日 导师签名:何援利 日期:年月日 饧耀剖 硕士学位论文 ? .? 刖 舌 年.与首次提出卵巢早衰 ,的定义??在青春期之后、岁之前发生的非生理性的月经停止, 伴有潮热、原发或继发不孕、全身和生殖器萎缩【】。虽然对的研究不断 进展,国内外对的定义仍未统一,各个定义一致之处在于岁之前闭经、 伴有卵泡刺激素升高和雌二醇下降,不一致之处在于是否包括原发闭 经及染色体、基因异常等性发育问题。对的认识也有了许多转变,有学者 提出不再是不可逆的病理过程,而是可以保留残存的卵巢功能,是暂时的 或一过性的。目前认为卵巢早衰是一种多病因所致的卵巢功能衰竭,一般人 群中发病率为%%,在闭经者中占%%,近年来临床上发病率有逐年上 升的趋势【刮。本病可致患者不育及低雌激素水平所带来的一系列问题,尤其是 年轻患者所致的不孕,给患者本人及家庭造成极大痛苦,因此卵 巢早衰所致的 不孕症妇女恢复排卵乃至妊娠成为当前重要的研究课题。 卵巢早衰的病因多且复杂,化疗的毒副作用是其中之一。【】等人回 顾性研究了例年龄?岁的乳腺癌患者,术后以阿霉素、环磷酰胺 化疗,平均随访.个月,长期闭经?个月的发生率为%。嘲 研究了静脉推注冲击疗法的例狼疮肾炎女性患者,随访时/.?. 个月,其中例.%出现闭经,例.%患者永久性闭经。【】等 人对例绝经前系统性红斑狼疮女性患者在治疗前后检测血中卵泡刺激 素、黄体生成素浓度,结果%患者出现和高促性腺激素性闭经,年龄 岁者发生率‰而~岁者,发生率为%。 曾提出患者在接受化疗后,出现持续性不可逆性闭经,定量超过/, 称为化疗诱导卵巢早衰。 目前化疗引起卵巢早衰的确切发病机制仍不清楚。其中以为代表的烷 化剂引起的卵巢功能损害研究较多。.、】和前言 【”】等人的研究均显示,及其代谢产物可直接损伤卵巢颗粒细胞及基底膜, 且主要作用于中大卵泡,即有丝分裂活跃的卵泡,而静止的生殖 细胞呈低度敏 感,还可刺激卵泡加速发育,使原始卵泡持续生长为成熟卵泡,并进一步 破坏成熟卵泡,最终导致卵泡衰竭,卵巢功能丧失。 、】 等人研究发现:青春期后患急性淋巴细胞白血病的患者接受化疗后,较青春期 前的患者的卵泡数明显减少,且更易发生闭经和不孕,提示化疗主要损伤成熟 卵泡。 随着化学毒性药物在肿瘤和自身免疫疾病的广泛应用,一些生育年龄妇女 经化疗药物治疗后引起卵巢功能丧失,如闭经、围绝经期综合征,甚至丧失生 育力,产生了一系列心理和社会问题。因此在提高患者生存率的同时,保护卵 巢功能、预防化疗后卵巢早衰的发生,对于提高患者愈后生活质量显得十分重 要】。国内外学者也提出并研究了一些新的治疗,主要包括不排卵方法, 如、口服避孕药的使用,卵巢移位,深低温保藏卵巢组织及移植等【‘。 但由于卵巢移位及深低温保藏卵巢组织后移植,均需行创伤性手 术治疗,费用 较高,而药物抑制排卵的方法,经济简单、不良反应小,成为研究热点。 目前对于口服避孕药能否在化疗期间对卵巢组织起到保护作用,尚有争议 和 】首次提出化疗期间应用服避孕药对卵巢进 】。 行保护,依据是口服避孕药的作用机理和化疗药物损伤卵巢的机制,并做了相 关临床试验,研究分析了例霍杰金淋巴瘤女性患者,结果发现应用口服避孕 药组,化疗后卵泡数目与化疗前相比,无明显减少。 】等人以女性 霍杰金患者为研究对象,化疗同时予口服避孕药治疗,试验前后以光电纤维镜 观察卵泡超微结构,并计数卵泡,发现实验组较正常对照组卵泡数无明显减少, 而未应用口服避孕药的化疗组,卵泡结构明显破坏,卵泡数目明显减少,提示 】等人的研究也发现 口服避孕药能够降低化疗对卵泡的毒性损害。 霍杰金淋巴瘤女性患者化疗期间应用口服避孕药能够使卵巢功 能得到保护。但 四等人做类似临床试验,名患者化疗 也有一些学者持不同观点【, 硕士学位论文 期间服用口服避孕药,结果人发生闭经,人月经量减少,认为口服避孕药 不能对卵巢起到保护作用。总之,目前对口服避孕药能否预防化疗对卵巢的损 伤,没有统一定论。 迄今为止,国内外有关化疗期间应用口服避孕药对卵巢进行保护的动物 实验尚未见报道。本研究采用阴道涂片法监测大鼠动情周期,放射免疫法检 测大鼠、浓度,组织切片法检测大鼠各级卵泡结构和数目,探讨化 疗期间应用口服避孕药能否对卵巢功能起到保护作用,以确定口服避孕药的有 效性。 材料与方法 材料与方法 一、材料 级近交系雌性大白鼠,月龄,体重,购自中山大学 实验动物中心。喂食级鼠饲料及净化水,室温??,相对湿度 %%,每日光照,饲养周熟悉环境后,每同清晨:行阴道细胞涂 片,显微镜下观察动情周期,选用有正常动情周期的大鼠进入实 验。口服避孕 药卜达英炔雌醇/醋酸环丙孕酮由先灵广州药业有限公司 提供。环磷酰胺,规格.支,购自山西普德药业有限公司。 二、主要试剂和仪器 .雌二醇放射免疫分析试剂盒,购自北京北方生物技术研究所 .人促卵泡生长激素放射免疫分析试剂盒,购自北京北方生物技 术研究所 .无水乙醇、过氧化氢、甲醛、双蒸水、苏木素等国产试剂 .高分辨显微镜日本光学公司,带自动照相系统 ,德国 .病理组织切片机 .病理组织漂烘处理仪,常州 .电热恒温水浴箱..,上海 .电子天平,上海 .生物组织自动脱水机.,湖北 .病理组织包埋机和包埋冷冻台.,常州 .电子干燥箱.,潍坊 .自动放免测量仪,北京 .一次性吸头.公司、管、载玻片、盖玻片、冷冻盒、树脂等均 为国产产品。 硕士学位论文 三、预实验:最大程度抑制大鼠卵泡发育的最低剂量的确 定 只雌性大鼠随机分为组,每组只,分别灌胃给予不同剂量的 。所有大鼠均于灌胃后每天行阴道涂片,并在第天的动情问期测 定、 浓度并进行比较。 .第组:.炔雌醇/.醋酸环丙孕酮。 .第组;.炔雌醇/.醋酸环丙孕酮。 .第组:.炔雌醇/醋酸环丙孕酮。 四、实验分组及用药 只雌性大鼠随机分为组: .空白对照组:不予任何药物处理。 .组:给予负荷剂量 /腹腔注射,之后 /?腹腔注射, 连续。 .组:.炔雌醇/.醋酸环丙孕酮溶于生理盐水,灌胃, 连续。 .联合治疗组:同时给予和,连续,给药方法同、组。 .联合治疗?组:先连续给灌胃,用药剂量同组;第起加 用,给药方法、时间及剂量同组。 五、 阴道涂片法观察动情周期 采用阴道涂片法监测大鼠动情周期。从实验开始到实验结束,各组大鼠每 天行阴道细胞涂片。 将消毒棉拭子用生理盐水湿润后插入大鼠阴道,轻轻转动后取出,涂片。 在涂抹处滴加美兰滴,固定分钟,纯水冲洗掉美兰,镜下观察表层细胞与 底层细胞分布比例,判断大鼠动情周期。 材料与方法 正常成熟雌性大鼠动情周期约天,分个阶段:动情前期,动情期, 动情后期和动情问期。动情前期:全部是有核上皮细胞。偶有少量角化细胞; 动情期:全部是无核角化细胞或问有少最上皮细胞;动情后期:白细胞、角化 细胞、有核上皮细胞均有;动情间期:大量白细胞及少量皮细胞和粘液。见 图~幽 、》?詹攀?? 、舔盔渭留迸 固动情期美蓝染色,. ‘ ‘ ’ ~? , ’。 。. ‘ ,? . , .. 一’一?.。 .,。.’? ? ?引 图动情后期 圈动情问朋 口 ? 美蓝染色, 美蓝染色硕士学位论文 六、放射免疫法测定性激素 从实验开始到给药结束期间,各组每隔天相当于大鼠个正常动情 周期 的时间,于动情间期测定、浓度;停药后第、天相当于及个 正常动情周期,测定各组、浓度。 剪尾法采血:将大鼠尾部浸于温水~,剪尾.,收集 大鼠血液约。静置小时后离/ ,取上层血清,用放射 性免疫法测定、浓度。 .浓度测定 测定原理:采用均相竞争原理,即标准或待测样品中的和一定量的 .共同与限量的抗体在适宜条件下进行竞争性结合反应,一部分与抗体 结合形成抗原一抗体复合物,而另一部分呈游离状态。.与抗体结合的比 例取决于标准或待测样品中非标记的含量,非标记的含量越高,. 与抗体结合的比例越小;非标记的含量越少,.与抗体结合的比例越大。 用免疫分离试剂将结合部分与游离部分分离后,测定结合部分的放射 性活度,并计算相应结合/。用已知标准含量与对应结合率作图,即得标 准抑制曲线。从标准曲线上查知对应结合率的待测样品中的含量。 操作步骤:取圆底聚苯乙烯试管若干,用记号笔编号、.和待 测样品管中,然后用微量取样器按下表加样。加样前所有试剂尤其分离剂包 括待测样品要摇匀,除样品外其它试剂最好平衡到室温。见表 .浓度测定 测定原理:应用竞争机制原理,标准或样品中的和加入的 共同与一定量的特异性抗体产生竞争性免疫反应。与抗体的结合量与 标准或样品中的的含量呈一定的函数关系。用免疫分离剂将结合部分 与游离部分分离后,测定结合部分的放射性强度,并计算相应结合率/。 用已知标准含量与对应结合率作图,即得标准抑制曲线。从标准曲线上查 知对应结合率的待测样品中的的含量。 材料与方法 操作步骤:取圆底聚苯乙烯试管若干,用记号笔编号、和待 测样品管中,然后用微量取样器按下表加样。见表 表 测定操作程序表 .管别 样品或 总管 管 。管 .管 试剂 质控管 蒸馏水 一 一 一 一 “”标准 一一 一 一 一 一 一 .标准 样品或质控 一 一 一 一 . 一 一 兔抗.体抗 摇匀,?水浴小时 驴抗兔免疫分离荆 充分摇匀,室温下放置分钟,转/分离心分钟,吸弃上清液。测量各 管沉淀的放射性计数。 单位: 标准品 ?? ?? 待测样品兔抗.抗血清混匀, 任取三管测总, ?温育小时 驴抗兔免疫分离试剂 充分摇匀,室温下放置分钟,转/分离心分钟,吸弃上清液。测量 各管沉淀的放射性计数。 单位: 硕士学位论文 七、卵巢重量测定 各组分别于停药当天、第天、天处死/的大鼠,取出双侧卵巢称重。 操作步骤:%水合氯醛../腹腔注射背部固定于解剖板一 腹部酒精消毒灭菌剪刀沿腹中线切开,暴露子宫及双侧输卵管子宫为双子 宫,呈字型沿输卵管上行,接近终末端见双侧卵巢眼科剪分离周围组织 并取出卵巢一剔除卵巢周围多余脂肪组织电子天平称重%甲醛溶液浸 泡。 八、组织切片法 全部卵巢标本均经%福尔马林固定,常规脱水后石蜡包埋。所有蜡 块连续切片,每张切片厚,之后行染色。 染色的操作过程: .染色:二甲苯?,甲苯??无水酒精%酒精 %酒精%酒精一流水冲洗一苏木素染核 一流水冲洗盐酸酒精分化流水冲洗一氨水溶液一 流水冲洗一伊红染色流水冲洗%酒精.%酒精 一纯酒精?纯酒精?一石炭酸二甲苯二甲苯三道透明。 .封固:中性树胶封片,晾干。 .镜下观察,计数卵泡数,并根据卵泡大小及结构,测定原始卵泡、初 级泡数、次级卵泡、成熟卵泡数量。 九、统计学分析 统计学处理采用.软件包检验分析,数据以均数土标准差孑蜘表 示,采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分 析,两两比较 采用及法,所有结果均以.具有统计学意义。 结果 结 果 一、预实验各组大鼠、浓度及动情周期变化 第组给药后,动情周期持续存在,、浓度高于第、组,差异有 统计学意义妒.。第、组给药卜天后出现持续不排卵,但两组间 及分别比较,差异均无统计学意义泸.,提示将剂量从. /.增加到./,不能增加抑制大鼠卵泡发育及排卵的程度,故认为 .炔雌醇/.醋酸环丙孕酮这组剂量是可以抑制大鼠卵泡发育的最 低有 效剂量。见表 表预实验各组、浓度士 . 坛,疗 注:?与第组比较,. 二、各组大鼠、浓度及动情周期变化 .大鼠、行重复测量分析,结果示各组、分别比较,差异 均有统计学意义.,.;.,.,各时间点、 分别比较,差异也均有统计学意义.,.;., .,且实验分组和时间有交互作用. ,.;.,.。 .空白对照组:于动情间期测定为.士./,为.士. 硕士学位论文 /。该组阴道细胞涂片呈正常大鼠动情周期改变。 .组:从给药第天至实验结束,该组持续下降,持续上升, 与其余组分别比较,差异均有统计学意义.。大鼠阴道涂片在给药 ~ 天后出现持续不排卵,至实验结束,动情周期仍未恢复。 .组:在给药第及第天,浓度为../、... /,浓度为../、.../,均低于空白对照组, 与空白对照组分别比较,差异均有统计学意义伊.。之后,该组、 维持此浓度至给药结束。停药第天,../, ../,仍均低于空白对照组,差异有统计学意义俨.。停 药第天,、分别上升至../、../, 与空白对照组比较,差异均无统计学意义尸.。阴道细胞涂片显示 该组大 鼠在给药天后出现持续不排卵,停药天左右恢复正常动情周期。 .联合治疗组:联合给药第天,为../,高于 组,低于空白对照组、组及联合治疗组,而浓度为../, 低于组及空白对照组,高于其余组,差异均有统计学意义尸.。联 合给药第天、停药当天及第天,该组分别为..、.. 及.../,均高于同期组,低于空白对照组,差异有统计学 意义尸.,与组和联合治疗组比较,差异无统计学意义俨.; 同期为...、..、.../,分别低于 组和空白对照组,差异均有统计学意义伊.,与同期组和联合治疗 组比较,差异也无统计学意义尸.。停药第天,浓度升至.. /,仍高于组,而浓度上升为.../,低于组, 差异均有统计学意义妒.,与其余组分别比较,差异均无统计学意 义户 .。阴道细胞涂片显示该组大鼠于给药天后出现持续不排卵,停药 天左右恢复正常大鼠动情周期。 .联合治疗组:事先给予的第天、天,分别为..结果 /、../,分别为../、../, 与同期组比较,差异均无统计学意义.。继而在联合给药的第天, ../,高于组及联合治疗组,低于空白对照组,差异均 有统计学意义尸.;同期浓度为../,低于组、空 白对照组及联合治疗组,差异也均有统计学意义尸.;两者与组分 别比较,差异均无统计学意义俨.。联合用药第天、停药当天、第 天,浓度分别为..、..及../,均高 于同期组,低于空白对照组,差异有统计学意义沪.,与组和联 合治疗组比较,差异无统计学意义尸.。而同期浓度分别为 ..、.士.、../,均低于同期空白对照组及 组,差异有统计学意义沪.,与组和联合治疗组比较,差异也 无统计学意义妒.。停药第天,浓度升至 ../明显高于 组,浓度为../,明显低于组,差异均有统计学 意义尸.,与其余组分别比较,均无差异.。阴道细胞涂片显示 该组大鼠在给药天后出现持续不排卵,停药天左右恢复正常动情 周期。 .比较联合治疗、组的浓度,在联合给药第天,前者低于后者, 差异有统计学意义.。之后两组每次测定的比较,联合治疗组均高 于组,但差异均无统计学意义尸.。见表、表 . . . ?. . .. 江.厶 .心一一.‘邑 一岳厶。斟 心. 一?“ ?. 卜崎一“心 .寸寸口.岣? ?厶.寸 岔?试 ?寸 .葛力 小 寸“寸 “ 卜寸. ?,寸 寸小.寸 卜西一 . 蕾?口寸“? 寸?一 . 一冀 一“ 寸“ . 怅玖 &.” 寸.” 寸岔.价 寸.磊 .寸 ???. . 囊一一慷艇如岱诱 司 式. “ 岭一 卜“ 寸岔. . 寸试寸 寸 岔一“ ”.一 ?价辱 ?寸 一.寸 司口葛寸 卜岭.? 怅糯址。怅繇林 卜夺. 一“ 寸? ?寸“ ?一. . .寸 帐 ?一“ 乞? 司?心尊 ?式寸 寸小“岔一 价一譬.幻耵.叶.龇 母 衄 式 ‘ 心“ 寸.乙 . 。一“ . 卜. ?一.寸 联皋迥特二蟹 .卜卜. 司譬 司跫寸 司?忑寸 ??一. ?帐糯址。怅。寸禽俅 搽磐林 岔一. ?. ?乜 西. . “ 冀寸 一黑莆附一铎丑星越爱?蠹谁寸僻 帐一 岭?” 司. .一. 一瓷.?寸.芷 昌.~.鄹丑蠹寸《球唧?并.~.酃羞囊受霞正料婶司 ?. “ 吗一. 寸. 乜 . “ “ “ 蚺一.寸 卜?. 。口辞 。二寸 一怅和‰迦。怅群冰 鼎一慷瘿如誊毒蠹.寰苍。鼎甏莨正剥. 帐 吨 . ?. ?. 寻文 一 .寸 ?一式 岔“价 “ ?口. . 乜 司?荨 司专窨 ?. 寸. 心. . . . 式呐 ? 寸. 卜一.” 卜. . 乙. 柱藩林 ? 们 ? 们 ? 们 暴囊 寸 ‘山 .葛;力. . . 一寸卜. . .. 江.盆 . .邑 . ??? ?一寸. 卜?. 岭. .心“寸 ?/一暑?卦 式. . ? . 心气 . 岔. . .力 冀寸 各. .心?. ?. 卜. . ?一. ?一. 卜口. ?一. 甙岣. . 卜.寸 . 求捻 .警卜 ?崞.? 嗣一一慷艇如餐诺 罱. 寸. ?心. . . ?一 . . 司葺 寸 .. 日暑 日。葛 心.卜 怅‰址。帐箔繇冰 一??.千厶;。.? ?. 西. . . ?. . 昏. ?西. . & .一叼 西。. 司罨 葛 岔.寸” 寸 媒军亭 . 式. 寸. 寸心. ?. 卜卜. ?一. 小一. . .. 日心。. 罨 罨 而王?山 苫一? 一帐”一鬣班?帐。寸簿袜 籁承林 . . 心一. . 岭. ?. . . 帐 司岔。. 司琏 ?。. .疚寻 .寸一 一一坠.嚣时一酃丑星谜避?‰《砖擀 ;岛 .芦 . 罱. 寸. 岭. 岔? . 岔. ?口. . 司。 一 卜西寸 .~.鄂丑熹寸《球奸?诺。.钆.群丑舞琵靛皿州坷 ?抓糯进?怅冷繇冰 舞一愫瘿如凿。寸黑.鼎卜?囊受靛正科. 怅 ??. 寸. 小叼. ?一. . 昏. . . 心峪. . ??寸 . 蔫 。: 卜峪. 寸. 卜啦. . . 卜?. 寸. 寸? 崎 罱. 一心. 口口. 柱繇林 们 ? ? 们 ? 们 累 寸 函厶 暑:力硕士学位论文 三、各组大鼠卵巢重量的变化 .大鼠卵巢重量行析因分析,结果示各组、各时间点卵巢重量分别 比较, 差异均有统计学意义.,.;.,.,且实验分组 和时间有交互作用.,.。 .空白对照组大鼠卵巢重量为..。 .组和联合治疗、组在停药当天,大鼠卵巢重量明显降低,分别 为.:.、.:.、.:.,与空白对照组比较,差异 均有统计学意义俨.;而三组之间相互比较,均无差异伊.。之后三 组卵巢重量均持续增长,至停药第天,三组均基本恢复正常大鼠 卵巢重量水 平,与同期空白对照组比较,差异均无统计学意义。同期分别比较 联合治疗、 组的卵巢重量,组均高于组,但差异无统计学意义伊.。 .组在停药当天、第天、第天,卵巢重量持续降低,分别与 其余各组比较,差异均有统计学意义俨.。见表 表各组大鼠卵巢重量的比较蝴,, . :,刀 单位: :空白对照组:组组:联合治疗组 :联合治疗组 ?主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,.;?与其余组比较,.结果 四、各组大鼠卵泡数量的变化 .大鼠卵泡总数及各期卵泡数目分别行析因分析,结果示除各时间点卵泡 总数比较,差异无统计学意义.,.,及实验分组和时间无交互作 用伊.,.,其余组间及时间点卵泡数目比较,差异均有统计学意 义.,实验分组和时间也均有交互作用.。 .空白对照组大鼠卵泡总数为个,其中原始卵泡为个, 初级卵泡为个,次级卵泡为个,成熟卵泡为个。 .组和联合治疗、组每次测定的卵泡总数,分别与空白对照组比 较,差异均无统计学意义尸.。停药当天,三组的原始卵泡比例明显增加, 成熟卵泡明显减少,与空白对照组原始卵泡、成熟卵泡分别比较,差异均有统 计学意义.。之后三组原始卵泡比例逐渐减少,成熟卵泡逐渐增多,至 停药第天,三组各期卵泡数量分别与空白对照组比较,差异均无统计学意义 尸.。其中个联合治疗组间卵泡总数及各期卵泡数量分别比较,联合治 疗组的成熟卵泡多于联合治疗组,但差异无统计学意义.。 .组在停药当天至第天,卵泡总数及各期卵泡数量持续减少,其 中成熟卵泡减少最为明显,分别与其余各组比较,差异均有统计学意义俨 .。见表表,图~图 硕士学位论文 表各组大鼠卵泡总数的比较妇,垆 . 士,玎 实验天数 组别 停药天 停药当天 停药天 ? . . ?? . . ? ? ? . .?. .. .?.?. . . . . 。. , .开 . . . . :空白对照组:组:组:联合治疗组 :联合治疗组 ?主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,.;?与其余组比较,. 表各组大鼠原始卵泡比较蝴,萨 . . 实验天数组别 停药当天 停药天 停药天 . ?.., . . . . :联合治疗组 :空白对照组:组:组:联合治疗组 ?主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,.;?与其余组比较,. 结果 表各组大鼠初级卵泡的比较如,.:, 停药天 停药当天 停药天 组别????型达坠?一吣 . . ? ? ? ? . . ? ?? ?? ? ? . . ?? ? ?。 ? . . ? ?“ ?“ . . ?“ ? ? ? .?.木 ? ? ?...?广 .宰 . . . :联合治疗组 :空白对照组:组:组:联合治疗组 主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,.;?与其余组比较,. 表各组大鼠次级卵泡的比较蜘,.一,停药当天 停药天 停药天 组别???』堂型一 . . ? ? ? ? . ?? ?? ? . ? . ?“ ? ? . ? . . ? ? ?“ ?“ . ?“ ? ? . ?“ .?.事 ? ? ?.,., 、 . . . . :联合治疗组 :空白对照组:组:组:联合治疗组 ?主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,.:?与其余组比较,. 硕士学位论文 表各组大鼠成熟卵泡的比较姆,, . 烈虹,, :空白对照组:组:组:联合治疗组 :联合治疗组 ?主效应的统计量和值;交互效应的统计量和值。 ?与空白对照组比较,户.;?与其余组比较,. 表各组大鼠原始卵泡、成熟卵泡百分比变化姆,萨 . 姆,萨 ?与空白对照组比较,.;?与其余组比较,. 结果 崮空白对照组染色,× 图 组染色. 圈 组染色,× 图联?治疗组染色,× 图空白对照组:可见各级卵泡和黄体 图 组:各级卵泡数目及颗粒细胞明 显减少.间质纤维化,细胞空泡样改变。 图组:尤量原始卵泡,少见成熟卵 泡和黄体,组织较少纤维化。 周联合浒疗组:可见大量原始卵泡, 少见次级、成热卵泡.组织纤维化程度较 组减轻, 图联合治疗?组:可见丈量原始卵泡, 少见次缓、成熟卵琅,组织纤维化程度轻 组减轻。 图联合治疗组染色,× 硕士学位论文 讨 论 随着化疗的治疗进展,许多恶性肿瘤及自身免疫疾病患者可以长期生存, 甚至完全治愈,但这些患者经过化疗特别是包含烷化剂的化疗,引起月经失调, 急性、慢性卵巢衰竭并导致不孕,最常见的卵巢损害是卵巢早衰【。因此越来 越多的学者提出,在实施一些可能造成永久性或暂时性卵巢功能丧失的医疗行 为之前,尽可能采取一些保护措施】。 国内外学者多次提出并探讨口服避孕药在化疗期间能否对卵巢功能进行保 护,其理论基础是口服避孕药的作用机制及化疗药物以为代表损伤卵巢 的机理。目前认为可直接损伤卵巢颗粒细胞,并主要作用于大、中卵泡, 且对卵泡动力学有刺激作用,促使原始卵泡进入生长阶段,生成成熟卵泡,最 终导致大量卵泡损伤及耗竭,引起卵巢早衰。而口服避孕药可通过负反馈抑制 下丘脑一垂体一卵巢轴,阻止原始卵泡向成熟卵泡转变,使卵泡尽可能多的处 于对化疗药物不敏感的状态,从而保护卵巢储备功能【。 一、卵巢储备功能的评价 卵巢储备功能是指卵巢内存留的卵泡数量和质量,反映女性的生育能力。 卵巢产生卵子的能力减弱,卵母细胞质量下降,导致生育能力下降,称为卵巢 储备降低。临床一些疾病可导致卵泡闭锁及卵子质量下降,这是卵巢储备能力 低下的表现,并且有可能发展成为卵巢功能衰竭。因此加强监测、评估卵巢储 备功能对早期发现卵巢衰竭倾向和预测生育力的潜能具有重要的临床意义。 本研究采用计数卵泡数量,测量卵巢重量、测定血清和浓度以及监测 阴道细胞涂片,作为卵巢储备功能的评价指标。 卵泡数量是反映卵巢储备功能最直接的一个指标,卵泡数量减少即说明卵 巢储备功能降低。卵巢重量并不能直接反映卵巢的功能,但与卵泡数量相关。 卵巢重量的降低间接表明卵泡数量降低,卵巢储备功能降低。本 研究在停药当 讨论 天、停药第天、第天各组分别处死只大鼠,取出双侧卵巢称重。并将 卵巢组织常规石蜡包埋,切片、染色,光镜下计数卵泡数量。 血清基础水平和水平都能够间接反映卵巢储备功能【:卵泡发育 不良常伴有早期升高,这是由于垂体对卵巢功能降低的调节性反应??促 性腺激素释放激素代偿增高,继而引起增高。研究表明基础 水平升高与卵巢的储备力降低有关。在月经周期第天,血清/者 较~/者的体外授精成功率增加倍。还有学者发现在周期中, 基础水平较高的患者取卵数会大大降低。等学者也发现,基础 血清./者,往往因卵巢反应性差而使周期终止的发生率明显高于 ./者。这些均表明基础水平对卵巢储备功能及最终的妊娠结 局有很高的预测价值【。血清主要来源于颗粒细胞,因此被视为卵巢储备功 能的指标之一,可以直接反应卵泡发育状况。并且有学者发现,在对卵巢储备 的评价中,将月经周期第天的水平与年龄和基础水平结合起来,能 够更好地评价卵巢的储备能力【粕】。本研究从实验开始到实验结束,各组每天 行阴道细胞涂片,并且从实验开始到给药结束期间,每隔天相当于大鼠个 正常动情周期的时间于动情间期,各组均测定及浓度,停药后第、 天相当于及个正常动情周期,各组再测、浓度,这样应该能够 反映出大鼠的卵巢功能了。 二、对卵巢的影响: 目前对药物引起卵巢功能衰竭的研究多集中于烷化剂,其对卵巢的毒 性作用己明确,如环磷酰胺、氮芥等。烷化剂类药物作用于细胞 而引起单链或双链断裂,以至、和蛋白质的合成受抑制使 】在大鼠应用 性腺组织损伤【。多项研究提示可能与下述机制有关。 实验中发现,可导致大鼠卵泡明显减少,尤其对发育中的大卵泡损伤 更大。 等人的研究发现,主要作用于中大卵泡,并对卵泡动力硕士学位论文 学有刺激作用,加速卵泡成熟,促使原始卵泡进入生长阶段生成成熟卵泡,最 终导致卵泡衰竭。体外实验中,当把活化的与大鼠卵巢颗粒细胞混合后, 发现对卵巢损伤的靶细胞为颗粒细胞,进一步使卵泡过早排空并 导致 。我国学者也做了相关研究,结果均发现,导致大鼠卵巢组织出血、 坏死、纤维化明显,卵泡数量明显减少,尤其是成熟卵泡【?。 本研究结果显示:导致大鼠卵巢组织坏死,纤维化明显。组大鼠 卵泡总数在停药当天、停药第天、第天分别为个、个、 个,呈持续降低,各期卵泡数目也减少,其中成熟卵泡减少最为明显, 分别为士个、个、个,与同期空白对照组比较,差异有统计学意 义尸.。提示主要影响生长发育中的卵泡,的卵巢毒性可能在于 破坏成熟卵泡,使性激素分泌减少,垂体缺乏外源性黄体生成素释放激素类似 物的刺激,反馈性引起分泌的增加,募集卵巢初级卵泡向成熟卵 泡转变,使成熟卵泡再受的破坏。因此,经过一段时间化疗,卵巢的各级 卵泡受损,最终导致卵巢储备减少,卵巢不可逆损伤。 组大鼠在给药第天,大鼠浓度已明显下降,明显升高,说明 损伤了卵巢中的成熟卵泡,使得成熟卵泡中的颗粒细胞分泌减少,继而通过下 丘脑一垂体一卵巢轴,负反馈引起升高。给药结束后,组浓度持续降 低,持续升高,进一步证实了对卵泡的损害呈进行性发展。使卵巢 皮质有不同程度的纤维化,卵泡发生闭锁,颗粒细胞不能分泌雌、孕激素,进 一步干扰下丘脑.垂体.卵巢轴,从而使性激素合成、分泌紊乱,表现为 水平的升高,水平的下降。 三、对卵巢的作用 口服避孕药自世纪年代上市以来,由于疗效确切,目前已经成为全球 应用最广泛的避孕方法之一。此外,在功能失调性子宫出血、子宫内膜异位症 等妇科疾病的治疗方面也占据着重要的地位,所以受到了人们普遍关注【.。