【doc】革兰氏阳性细菌表面显示技术及其应用

【doc】革兰氏阳性细菌面显示技术及其应用 革兰氏阳性细菌表面显示技术及其应用 中国生物制品学杂志2OO4年9月第l7卷第5期ChinJBiolo~iealsSqfl1ber2OO4,Vo1.17No.5?329? 革兰氏阳性细菌表面显示技术及其应用 衣作安张成海李武平 【摘要】本文概述了革兰氏阳性菌表面显示技术的基本原理,开发研究的热点载体和菌株及其应用前景, 并与其它表面显示系统进行比较,指出了今后研究开发需要解决的关键问题. 【关键词】革兰氏阳性细菌;表面显示 细菌表面呈现系统是继噬菌体表面展示技术之 后的又一重要的微生物表面呈现系统,它能够有效 地克服噬菌体表面展示技术对目的蛋白表达的偏 性,是对噬菌体展示的有益补充.该技术发展之初 倾向于对革兰氏阴性菌表面呈现技术的研究,但由 于革兰氏阳性菌包括多种食品工业菌并具有许多革 兰氏阴性菌所不可比拟的优点,应用前景更为广阔, 因此近年来颇受重视.细菌表面呈现技术的基本原 理是将外源蛋白或多肽与细菌表面蛋白融合或嵌合 并表达于细菌表面.该技术由于在微生物学,免疫 学,分子生物学,疫苗学以及生物工程的多个领域具 有广泛的应用前景而成为研究的热点…. I.革兰氏阳性菌表面呈现系统 革兰氏阳性菌胞膜外有一层较厚且坚韧的细胞 壁,其主要成分是肽聚糖,由聚糖支架,四肽侧链和 五肽交链桥三部分组成.革兰氏阳性菌细胞壁中含 有大量带负电荷的磷壁酸,其抗原性很强,是革兰氏 阳性菌的重要表面抗原.目前研究最为成熟,也是 应用最多的是葡萄球菌表面蛋白A和链球菌表面 蛋白M6,其它一些表面蛋白也在进一步探索中. I.I葡萄球菌表面蛋白A(SPA):SPA存在于 90%以上的金黄色葡萄球菌菌株的表面,在Cowan I株每个细菌表面可有80000个SPA分子,占细菌 干重的I.4%,胞壁的6%.SPA是完全抗原,具有 属特异性.SPA与人类IgGl,IgG2和IgG4的Fc段 发生非特异性结合,形成的复合物具有抗吞噬,促细 胞分裂,引起变态反应,损伤血小板等多种生物学活 性【2J.对SPA结构的研究表明,它的组成是:N端信 号肽,五个(有些菌株是四个)IgG结合区,高度重复 的脯氨酸和甘氨酸丰富区,与细胞壁相互作用带电 的x区,C端细胞壁分捡(sorting)区(M区).其M 作者单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,病毒基因 工程国家重点实验室(zlk京100052). 作者简介:衣作安(1972,),男,博士,主要从事幽门螺杆菌防治 相关研究工作,E-mail:ztm~ny@yahao.0o111. 区的结构具有典型的特点:?保守的五肽基序(ITIO— tif),LPXTG;?1522个氨基酸的疏水区;?67个 氨基酸的带电尾巴(RRREL),共约35个氨基酸J. 经证实,这是革兰氏阳性菌细胞壁锚定的通用信号. 在LPXTG基序中包含着蛋白溶解酶的识别位点,即 在T和G之间切开,然后T通过与上述细胞壁肽聚 糖的五甘氨酸交连桥共价连接,而使蛋白锚定于细 胞壁,催化切开和转肽反应的是分捡酶(so他Se)nJ. SpA的XM区作为融合部分,被用于与不同的插入 序列和各种信号肽融合,在木糖葡萄球菌(Staphylo— COCCUSxylosus),金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau— reus),肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus),乳酸球 菌表面显示表达.插入的目的蛋白可以从l5个氨 基酸到397个氨基酸不等. I.2链球菌表面蛋白M6:M6蛋白是A组链球 菌的表面蛋白,具有抗吞噬作用,有8O多个不同的 血清型.化脓性链球菌的M6蛋白是enlnl基因编码 的相对分子质量为53500的多肽,具有上述典型的 细胞壁锚定序列.M6作为锚定载体,保留其N端 122个氨基酸和C端140个氨基酸对于异源蛋白表 面显示是最佳的构建方式.Pozzi等将HPVE7蛋白中的99个氨基酸的抗原决定簇替代了M6的180个 氨基酸,并将该序列重组到格式链球菌(Streptococ— CDSgordinii)的染色体中J.这种方法被成功地用于 在格式链球菌表面显示各种长度的抗原决定簇(15 — 38个氨基酸).Piard等将编码野生型M6蛋白 的质粒转化到异源宿主中,如:乳酸球菌,发酵乳杆 菌,清酒乳杆菌,嗜热乳酸球菌,结果M6蛋白在这 些宿主的表面均可以表达.这表明M6在不同宿主 中有相同的锚定机制,同时也发现其锚定效率在不 同宿主中有差别. 利用乳酸球菌Usp45的N端信号肽和M6蛋白 的C端细胞壁锚定区,中间插入葡萄球菌的核酸酶 (Nuc)作为报道蛋白,在清酒乳杆菌,植物乳杆菌,于 酪乳杆菌,罗伊乳杆菌的表面得到了表达;无C端 ? 330?中国生物制品学杂志20O4年9月第17卷第5期ChinJBiologicalsS印 lal)er20O4,Vo1.17No.5 细胞壁锚定区的蛋白则实现了分泌性表达.但其表 面显示效率不一致,很多蛋白只锚定在细胞膜上,其 主要原因可能与细胞内分捡酶的限制有关.不管是 锚定于细胞壁上的还是分泌性蛋白均具有核酸酶的 活性,说明它在不同的部位得到了正确的折叠.蛋 白表达总量为24ITlg/L,如果按4ITlg/L的产量, 40%表达于细胞壁计算,每个细胞表面将有l04个 分子.作者认为提高表达量的方法在于提高分捡酶 的表达;破坏细胞壁蛋白酶;或增强其它伴侣分子的 表达. 1.3其他表面显示蛋白:Strauss等J以葡萄球 菌的纤连蛋白结合蛋白(fibronectinbindingprotein, FnBP)C端锚定区作为载体将脂酶插入其中,实现了 在肉葡萄球菌的表面表达. Stover等】将伯氏疏螺旋体的外膜蛋白OspA与 卡介苗(BCG)的脂蛋白Mtb19的N端部分融合在 BCG表达.用重组菌免疫小鼠,所诱发的免疫应答 水平明显高于OspA在BCG胞质中表达或分泌表达 所诱发的免疫应答水平,抗体效价比可高出100一 l0o嘴.提示表面呈现蛋白的免疫提呈方式可能 不同于一般的抗原,效率更高,再者脂蛋白的免疫佐 剂作用也利于诱发高水平的免疫应答. 在枯草杆菌细胞壁锚定的自溶解素修饰蛋白 (autolysinmodifierprotein.CwbA)和保加利亚乳杆菌 的胞外蛋白酶(PnB)也被用来作为嵌合蛋白表面暴 露的一部分u引. 2.革兰氏阳性菌表面呈现技术的应用 重组微生物表面暴露活性蛋白质在疫苗学,应 用微生物学和生物技术学方面有巨大的前景.其中 研究最早,最多的是在疫苗领域,但近年来,细菌表 面显示技术在生物催化剂,生物感受器,生物活性多 肽,抗体或肽文库筛选方面也引起了重视. 2.1活菌疫苗投递系统:在疫苗发展方面,用 活菌载体表达亚单位疫苗比单纯亚单位疫苗或失活 的细菌更有吸引力.这是由于其容易生产,免去了 纯化的麻烦步骤和耐受疫苗保藏运输过程中的各种 苛刻条件,同时,活菌本身有佐剂效应,有时一次接 种可获得长时间的免疫.而表面暴露异源性抗原在 诱发特异性抗体方面更具优势川.活疫苗表面显 示为疫苗设计提供了新的前景:?数个抗原可以同 时表面显示;?免疫调节抗原决定簇(特异性T或B 细胞决定簇)可以同时表达;?抗原与佐剂同时显 示;?能够与特异性免疫反应部位的受体靶向结合, 以增强疫苗激发免疫反应的潜力. 活菌疫苗载体通常可分为两种类型,一是减毒 的致病菌:沙门氏菌,BCG,二者具有较好的佐剂效 应,但其主要顾虑是婴儿和免疫耐受的人;二是非致 病的共生菌或食品级细菌,如:格式链球菌和葡萄球 菌,乳酸菌等.关于乳酸杆菌是否可以作为佐剂,研 究表明,口服乳酸杆菌并腹腔注射加强免疫,能刺激 小鼠产生针对乳酸杆菌表面成分的体液免疫. BoelBlIk~,等n发现不同的菌株发挥的佐剂效果不一 样,以干酪乳杆菌和植物乳杆菌佐剂效应最强. 应用共生菌作为疫苗载体的目的是将载有疫苗 的细菌暂时植入内源性菌群中,延长疫苗抗原暴露 于免疫系统的时间u.而非定居细菌在宿主中存 在时间较短,有赖于抗原的高效表达.格式链球菌 是人类口腔共生菌,自然状态下就处于感受态,容易 转化并整合于染色体而稳定表达,被广泛用于疫苗 载体的研究,如HIV,HPV等.通过粘膜免疫小鼠和 猴证实能够诱发rgA和IgC反应,说明该投递系统 作为粘膜疫苗载体是适合的. 广泛用于肉类发酵用的葡萄球菌也被用于疫苗 投递载体.它们与金黄色葡萄球菌同源性较低,不 产生毒素,溶血素,蛋白A,凝血酶等,也适合作为疫 苗载体.进一步研究验证了重组活木糖葡萄球菌疫 苗载体系统将抗原表面表达在诱导抗体反应中的必 要性.尽管抗体水平并不一致,但这一结果明确证 实了在这一葡萄菌载体系统中表面显示抗原在诱发 抗体反应的必要性u引. 在近来的研究中,Sanltlelson【l比较了肉葡萄球 菌和木糖葡萄球菌作为亚单位抗原投递系统的效 率.肉葡萄球菌诱发的抗体水平较木糖葡萄球菌 高,这可能由于肉葡萄球菌表面表达外源蛋白的数 量较多的缘故.在提高经粘膜途径应用的疫苗载体 系统方面,目前研究了在肉葡萄球菌表面共表达粘 膜粘附分子以提高载体疫苗的效率. 2.2酶在细菌表面的呈现:在食品及化工行 业,常常需要各种酶作为化学反应的催化剂.某些 酶可以在细菌表面显示表达并保持活性,这种新型 微生物催化剂使酶的回收和再生过程大大简化.包 括内酰胺酶,脂酶,碱性磷酸酶等多种酶分子在细 菌表面得到了呈现,而且其催化活性没有受到影响. 进一步的研究证实,细菌表面呈现的内酰胺酶催 化效率比胞质表达的内酰胺酶高50倍.与传统 的酶相比,它具有许多优越之处:?产量高,成 本低.细菌繁殖力强,易于培养,具重组蛋白的拷贝 数一般很高,在葡萄球菌表面呈现的f}_内酰胺酶可 中国生物制品学杂志2OO4年9月第17卷第5期 ChinJBiolooealsSeptember2OO4,Vo1.17No.5?33l? 达到l04个酶分子,细胞;?再生能力强.通常酶在 催化过程中或不适环境下不可避免地会失活,而在 细菌表面呈现的酶则可通过细菌的分裂增殖获得再 生:?与胞内表达的酶相比,避免了使酶释放的破膜 过程,减少酶分子的损失,而且催化效率更高. 2.3表面显示在环境中的应用:细菌表面呈现 技术为构建新型全细胞生物吸附剂打开了方便之 门,单链抗体,蛋白受体,金属结合蛋白等在细菌表 面得到了呈现.用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌表面 显示聚组氨酸,结果这些细菌获得了结合和 Col2的能力.由于这种生物吸附剂成本低,易于大 量制备,功能繁多,因而有着广泛的应用前景,特别 适合于化学物质的分离纯化以及毒物污染水源的净 化等环境方面的应用. 2.4作为全细胞诊断工具:鼠抗人IgE的scFv 抗体片段在肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌表面得到了 显示表达,能够结合人I,作为全细胞单克隆抗体 可以开发为新型诊断工具.这是第一次报道抗体片 段在革兰氏阳性细菌表面以功能形式表达.在细胞 表面表达单链抗体或抗原,以全细胞作为诊断试剂 可能具有很好的开发价值. 2.5抗体或肽文库的制备和筛选:利用细菌表 面呈现系统制备抗体或肽文库是对噬菌体展示文库 的有力补充,它可用荧光激活细胞分选技术进行大 规模的筛选,较噬菌体表面显示更为方便快捷,并可 避免噬菌体展示筛选过程中的一些关键步骤,如靶 分子的固定化,结合噬菌体的洗脱以及洗脱噬菌体 的再感染等.采用细菌表面呈现技术优势在于:? 细菌繁殖力强,载体蛋白往往又是多拷贝的,多肽的 产量可以很高,从而保证有足够的免疫原;?载体蛋 白具有较好的免疫原性,融合蛋白可以作为免疫原, 省却了化学交联的步骤;?细菌本身就是天然的免 疫佐剂.但革兰氏阳性菌的转化效率较低,库容量 较噬菌体文库小. 3.问题与展望 细菌表面呈现技术是一个良好的技术平台,而 革兰氏阳性菌表面呈现技术与食品工业密切结合, 在疫苗学,生物工程等多个领域显示出广泛的应用 前景.目前存在的主要问题是载体系统的表达效率 和稳定性,既要获得较高的细胞表面显示率,又要防 止包涵体的形成;对于表面显示蛋白的生物学效果 也需要大量实验证实.相信随着载体系统的不断完 善和发展,革兰氏阳性菌表面呈现系统必将会在多 个领域发挥作用. 参考文献 [1]WesterusH,LehtioJ,SamuelsonP,eta1.Engineeringstaphylococcal surface~forbiotechnolooealapplications.JBiotechnol,2OO2,96:67-78. 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