膀胱移行细胞癌9q的杂合性丢失及抑癌基因位点的定位

膀胱移行细胞癌9q的杂合性丢失及抑癌基因位点的定位 膀胱移行细胞癌9q的杂合性丢失及抑癌基 因位点的定位 中华泌屎外科杂志1999年7月第20卷第7期ChinjUro1.Jul ?7 膀胱移行细胞癌9q的杂合性丢失及 抑癌基因位点的定位尺77 杨晓峰申鹏\/开泰米振国刘尚莹 文一刘春刘红耀 【摘要】目的研究膀胱移行细胞癌的9号染色悻长臂(9q)杂台性丢失井对抑癌基因位点进行 定位.方涪通过应用25对高密度多态性微小卫垦标记经PCR扩增,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳,检侧膀胱移行细胞癌的9q杂台性丢失,寻找膀胱移行细胞癌相关抑癌基因的位点.结果25 倒病人约有92%的肿瘤至少有一个以上位点的杂台性丢失.最常见的丢失区域为9q12,9q21,9q22 和9q34,最常见的丢失位点是 DBH440%D9S15227%D9S181522.7%,Dgs176120%,D9S1831 160%.绘制出畴胱移行细胞癌9q杂台性丢失的染色体图谱.9q杂台性丢失与肿瘤的分级,分期无 相关性一结论膀胱移行细胞癌9q的杂合性丢失是肿瘤发生的早期事件之一,在9q34的DBH位 //—————-/bIJ Lossofheteroz)gosRyandtumorsuppressorlociof 肿瘤麓(捂膀(j Xiaofeng,SHENPengfei,0Kaitai,al'DepartmentofUrology,First MedicalUniversity',Taiyuan03000i MaddercanYANG ClinicalCollege,ShanM 【Abstract】 Ohjecti~To[o<~atethe】.ssofheterozygc~shy(LOH)andthesuppressorgene[ocion chlqo[no~o[n{9qinb】addertransitiona 【ce[【carcinomaMethods25microsate[[itemarkers~vereusedto assessLOHin25casesofTCCofbladderHighmo[eeularweightDNA~as"aSextractedfromtllnlorand bloodPCRand6%denaturingpolyacry[amidege[e[eelrophoresiswereperformedResults23tillnors (92%)showedLOH札 oneormore[ocion9qThecolllmonregionofde[etionwas[ocatedof9q12—9q21, 9@2and9q34TheCOlftmoillociofLOHweDBH44%,D9sl5227%,D9S1815227%,D9817612% andD9S183116%.theotherlocibeinglessthan10%ConehtsionsLOHOn9qmightbeanearlyevent ofthegenesisofb[addercarcinomaThebladdercardnomaassociatedsuppressorgenemight bepresentat DBHlocl._19q34anditsnearby 【Key】B[adderneoplasmCarcinomaGenes 近年来分子遗传学的研究明,在膀胱肿瘤移 行细胞癌(TCC)中有多种遗传学物质的改变,其染 色体的变化十分复杂,几乎每条染色体均有异常,而 且缺失大于扩增1,有报道9q/gq的杂合性丢失 (LOH)是最常见的遗传改变(>60%)kZl.Cavenee 等l3认为高频繁菲随机的LOH位点表明有抑癌基 因(TSG)的存在,而TSG的研究对TCC的发生发 展诊断,治疗有着十分重要的意义.目前有关 作者单位:030001太原,山西医科大学第一医院泌尿外科(扬晓 峰,米掘国刘尚莹,王东文,张泓刘春,刘红耀t:湖南医科太学湘雅 医院(申鹏飞);湖南医科大学肿瘤研究所(姚开泰, ? 论着? TCC的相关基因尚未找到,许多学者认为,在9q可 能存在着三个以上的TSG,但现仍未明确定位和克 隆4,51.我们选用定位精确高密度的微4,卫星 DNA标记,对TCC9号染色体长臂的LOH进行分 析,以明确TCC相关的TSG位点 材料和方法 一 ,主要试剂仪器 丙烯酰胺,三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs), PGEM7Z{(+)/SHae?DNAMarker,TaqDNA聚 合酶购于华美公司.25对微小卫星DAN标记引物 ? ,, ? ,@一 毕泌尿外科杂志1999年7月第20卷第7期ChinJUro1.Jul1999.Vol20,No7 (美国ResearchGenetics,Inc),Centrifuge5403低温 高速台式离心机,uV一3100S岛津紫外自动扫描分 光光度仪,PerkinElmerPCR仪,Mode[300垂直电 泳仪. 二,组织标本和DNA的提取技术 按参考文献进行分子克隆并稍有改进. 三,PCR扩增 PCR反应体系:100,150t~g基因组DNA,10× PCR缓冲液5【,2mmoi/LdNTP混合液5tit,R和F 引物各lt,l(20t,g/200t,1),Taq聚合酶1.5U,蒸馏水 37l,振荡,离心,总反应体积为50,【,加石蜡油 40/,[.反应条件:变性94?5分钟,尔后27个周期 循环,变性条件94?1分钟,退火条件45?,72? (不同引物退火温度不同,DBH为72?)1分钟,延 伸条件72?1.5分钟,72?保持lO分钟延伸 每次PCR扩增后PCR产物均用1.5%琼脂糖 检测,观察扩增效果,无非特异性带时,进行下一步 聚丙烯凝胶检测. 四,变性聚丙烯凝胶电泳 每次取6%的变性聚丙烯酰胺凝胶40ml,再加 入10%过硫酸胺500,ul,TEMED50t*I,立即灌胶,胶 的大小为(20×30×0.0004)cm,l,1.5小时后胶自 然凝固.撕去周边胶带,固定在垂直电泳槽上,电泳 液为1×TB,预电泳l5分钟.取PCR产物10t*l加 2×甲酰胺上样缓冲液2l,95?8分钟变性后点 样,电泳条件为:电压lO00V,电流0.05A,功率 50W,室温下电泳1.5,2小时. 五硝酸银染色 电泳毕将胶放在0.2%的硝酸银溶液浸泡20 分钟染色,去离子水清洗数秒,1.5%氢氧化钠加 0.4%甲醛溶液中显色,自来水洗涤,将其放在滤纸 上加热抽干,以便. 六,统计学方法 FISHER判别分析检测总体实验的意义,方差 分析检测LOH与临床特征的关系. 结果 DNA在抽提溶于TE后用紫外分光光度仪测 吸光度A值为1.53,1-89,0.6%的琼脂糖检测片 段在23kb以上,说明所提取的DNA为相对高分子 质量的大片段DNA,符合实验要求. 本组共采用了25对高度多态性的微小卫星 DNAl物,l对位于9p,其余24对高度紧密地排列 在9q,典型的银染聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图l. 图1示在DBH位点lO个膀胱肿瘤LOH的电泳图, 标本l,3,5,9,血液DNA均两条等位基因片段,系 杂合子,而肿瘤组织仅有一条DNA片断扩增,即单 倍体等位基因丢失,第5号标本肿瘤中有一条带明 显色泽减弱(吸光度A值<4O%),同样也定为 LOH,而其它是杂合子或纯合子无LOH. 检测25对正常DNA和肿瘤组织DNA,23例 (92%)肿瘤在9q至少有一个以上的位点有LOH, 每个肿瘤每条染色体25个位点的LOH率各不相 同,从图2(TCC9qLOH的染色体图谱)可发现不同 肿瘤的L()H数可以是0,5个位点,即有0,2O% (平均9.6%)的位点有LOH.最常见的缺失区域为 9q12,9q2l,9q22,9q34.LOH较高的位点是DBH 44%,D91522.7%,D9S181522.7%,I)9S1831 l6%,D9S17612%.而其它位点均小于l0%. DBH位点的LOH为44%,显示该位点有一个与膀 胱肿瘤相关的TSG存在. 本组25例病理学分级:I级l2例,?级9例, ?级4例.分期L8例,,3l5例,T3N.M02 例.统计学分析LOH与分级分期无相关性.说明 在9q34DBH位点TSG的失话与膀胱肿瘤的发生 有关,是肿瘤发生发展的早期事件之一. 讨论 研究表明,恶性肿瘤中都有多个TsG的失活 如p53,p16,RB1等TSG可以在TCC中同时失活 图1膀恍穆行细胞癌9号染色体DBH位点杂台性盖先的电泳图,图中共10对标 本B:正常血穰,T:肿瘤组缎,M:PCR标记物 中华泌尿外科杂志1999年7月第20卷第7期ChinJUrol,Jull999.Vol20N07 圈225侧膀胱肿瘤在9号染色体长臂杂音性丢先的 染色体图谱图中所示9号染色体的所有医带25对微 小卫星杯引物的分市情况和10个标奉杂和性丢失的 位点黑框内) 而与TCC关系较密切的TsG还未克隆,LOH是示 踪TSG位置十分有效的途径.TCC的LOH分析 将有助于寻找未发现的与TCC相关的TSG1_. 本研究显示9q343的DBH位点及其附近存在着一 个与TCC相关的TSG. 染色体某一特定片段的缺失,引起TSG的失 活,在肿瘤细胞中检出某一位点频发LOH,则代表 在这一缺失区域及其附近存在TsG.目前的研究 已有许多这样的例子进行相关基因的定位.包括 TCC在内的多种肿瘤在9p21的LOH较高,从而克 隆了Pl6基因~s,97:在我们和其他学者的研究中都 发现9q的LOH,并且在浅表型和浸润型TCC中都 有LOH.这样看来,9q的LOH不同于pl6和p53 基因,其失活发生在TCC的早期,为TCC发生的最 早因素之一,9q34.3DBH位点的LOH是44%,但 由于癌细胞中含有正常细胞比例较大,干扰l『IOH 的判断,造成假阴性结果,可能DBH的LOH比 44%大.其它位点的LOH的发生率较少,为随机 丢失,在这些位点无TCC相关基因存在. 有些研究者认为,TCC9号染色体的各个信息 位点都有LOH.一部分LOH是肿瘤的原发性因 素,即它们与肿瘤的发生和病因有关;而另一部分是 继发性LOH,是肿瘤发展,浸润和转移中伴随的现 象l】".我们认为寻找在肿瘤发生发展过程中起关 键作用的LOH,才是该研究的首要问,另外也发 现,虽然9号染色体的所有位点都有LOH,但多数 位点LOH的发生率并不显着,有人发现9q常见的 缺失区为ASSP3(9ql3-2l,1)和D9S60(9q33—34, 4);还有人认为是在D9S61一D9S66(9q34)之间约13 , 14CM(1000bp/CM,CM为遗传学物理图谱的基 因交换单位,是Cent[morgan的缩写,中文称分 摩)",Habuchi等一则认为D9S153一D9S109是 目前的研究结果并没有真正确定 缺失区,这样看来, 与TCC密切相关的LOH区域.本研究采用25对 明确定位的微小卫星DNA标记,且它们之间的遗 传学距离较小,密度高,约1CM左右,检测涉及整个 9q,反映的信息量大且准确,虽然也发现肿瘤样本的 LOH为92%,许多位点有LOH.在9q,TCC有三 个常见的缺失区9ql2-9q21,9q22和9q34,但仅有 9q34.3的DBH位点LOH率较高,从而进一步明确 了9qLOH的非随机和随机LOH位点,缩小了LOH 的遗传学距离,为进一步的TSG定位和克隆TCC 相关基因提供了重要资料.进一步的工作尚需在 9q34.3DBH位点及其附近再检测LOH,缩小遗传 学距离,克隆TCC相关基因. 参考文献 1KaUioniem~iA,KalllonoemiOP,CitAG,etalIdentificationofIns and10ssesofDNAsequencesin.primarybladderca~cerbvcompar~ tiregenomichybridi~tionGeaesCh?sC~cer,1995,l2: 2l3219 2KnowlesMAMdmul~geneti~ofbladderC~RePJBrJCancer. 1995.75(suppi1】:57—66 3CaveneeWK.DryjaTP.PhillipsRA.etalExpre~]onofrecessiveat- Idesbychmm~ma]mechanismsinretinob~smmaNatu~,1983, 305779 4HabuchiT,DevlinJElderPA.nDetaileddeletionmapping. chromosome9qinbladder?r?evidence{ortwot~moTsuppr~r lociOncogene.1995.11:16711674 5KeenAJ.Knowl~MADefinitionoftw.regions0deleti~ORchin mo~me9iacarcinomaoftheMAdderOncogene,1994.92083— 21)88 中华泌尿外科杂志1999年7月第20卷第7期ChinJUroL,Ju】1999,Vol20,No7 6ColLinsA,Forabc~coP.Lsw~nceS.talAnintegraledmapchro m0洲蚰9HunGeNeI.】995.59393402 7KwiatkawskiDJ.AmaourJ,BaleA.etalReportinthe…dinter— nati~alworkshopOnhumanchr0…e9Cytc~enetCellGenet. 1993a,6494,121 8Kwiatkowsk~DJ.I)ibC,SlaugmbauptSA,etatAnindexmarker map(1fchromo~me9pmvid~slmngevidencepositiveimerf~ 眦AmJHUnlGenetI993b.53:1279128l 9Nobori1,MiuraK.WuDJ.DtatDeLetion.theeycLin—dtp~Jdent kina~4inhibitorgeneinmultipleC~CeYSNature,1994,3h8:753— 756 10HahnSA,SchmteM.Hcg.eATMS.na【DPC4.Ac~didatetur …upp…geneathunchchrom~el8q211Science, 1996,271.350-351 l】SmutsW,PauwelR.LaarakkemL,etatChrom~malanalysisof btndder?r?.N0mndoma]IeraIionsCancerG目】etCyto genet,1987,29:294】 12(lPShawME.KnowlesMAInitiationofbladderCaNcermay involvedetetionoaIumorsuppr~rg曲eOnchrom~me9 Oncogene,t993,8:10831085 13%【tuP.ShawME.KnowlesMAPreLiminarymappingofthe deletedregionofchromosome9inbladderCaflcerCancerRes, 】993.5312301232 (收稿:l998.07.20恪回:199901,I5) 肾脏原发恶性淋巴瘤一例 李建民焦士兰扬萱琴徐树明程林仙 患者,女性,59岁主因左季肋区 疼痛半月,渐进性加重伴有谊胀,纳差 等症状.于1998年9月1E『收^院.体 检:全身浅表淋巴结无肿大,左季肋区肌 紧张,可触及约lOcm×10cmx9cm的不 规则突起.左肾区外形轮廓不清.核医 学影像检查:右肾正常,左肾失去正常形 态,仅见上下极各有较小有功能肾组织, 肾主体大部分呈缺损区,提示左肾中部 占位性病变.CT检查提示后腹膜肿物, 左肾癌.于同年9月5日在全麻下行左 肾根治手术,术中见左肾肿物lOcmx 10cm×9cm,质硬.与胰尾,腰大肌等紧 密粘连,腹腔未见肿大淋巴结. 病理检查:左肾大小15cm×12cmx 9cm,输尿管残端长短45cm,直径 0.3cm.肾门纵切面可见肿物大小为 作者单位:030013太原,山西省肿瘤医院 13cm×1lem×8cm,几乎占据全部肾组 织,肾脏组织挤压.肿物切面呈灰白淡 粉色鱼肉样镜下见:肿瘤细胞呈嚣漫 分布瘤细胞以裂细胞和无裂细胞相混 杂裂细胞棱多为不规则形,具有切迹 及线状裂淘.染色质细颗粒状.分布疏 橙.拨仁小,胞质少,界不清.无裂拨细 胞棱大,圆形,棱膜厚,染色质凝块状,分 布疏橙,可见有2,4个核仁不等,紧贴 核膜,多为嘈碱性,胞质中等,界不清. 瘤细胞问有少量纤维和血管.瘤细胞已 侵犯肾赃的髓质和皮质,但界限尚清楚. 免疫组织化学标记:CD2.(十+) LCA+,CD一EMA一Myog[obin一, ER十,PR+. 病理诊断:左肾原发性弥漫型恶性 淋巴瘤B细胞型 讨论肾脏原发性恶性淋巴瘤罕 ? 病例报告? 见.1956年Kneopp提出,原发于肾脏 的恶性淋巴瘤应符台以下三个标准;(1) 肿瘤局限于肾包膜内.(2)周围淋巴结 阴性,【3)全身其他部位未找到肿瘤证 据. 肾脏是厚发淋巴瘤或淋巴瘤,白血 病继发累及的部位,中老年^常见其 症状包括有局部疼痛,胃纳差或恶心,血 尿等.多数为单懊I肾脏内单灶病变,偶 为双侧多灶性.多灶发生者可为同时发 生或先后发生肿瘤常景及肾周围组织 及邻近结构.囱眼上易误诊为肾癌.如 果为白血病侵犯肾脏常呈弥漫性,主要 侵犯肾皮质的外层.本例患者肿瘤仅局 限在肾脏,且侵犯髓质和皮质,经免疫组 织化学标记证实为B细胞淋巴瘤.而且 激素受体ER和PR均呈阳性表达 (收稿:1998.1221)