为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

转铁蛋白受体介

2017-09-20 20页 doc 107KB 75阅读

用户头像

is_212655

暂无简介

举报
转铁蛋白受体介转铁蛋白受体介 复旦大学 论文集(2007) 药学院04级 高会乐 药学院药剂学教研室 蒋新国 研究员 构建一种转铁蛋白受体介导的聚合物泡囊递药系统。以可生物降解性的共聚物聚乙二 醇-聚己内酯(MPEG-PCL)与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(Maleimide-PEG-PCL)为材料,采用注入法制备聚合物泡囊(PS),并将其与转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价连接。采用激光粒度测定仪、透射电镜对OX26-PS的大小形态进行鉴定;采用免疫透射电镜和X射线光电子能谱(XPS)对OX26-PS表面连接的OX26进行定...
转铁蛋白受体介
转铁蛋白受体介 复旦大学 论文集(2007) 药学院04级 高会乐 药学院药剂学教研室 蒋新国 研究员 构建一种转铁蛋白受体介导的聚合物泡囊递药系统。以可生物降解性的共聚物聚乙二 醇-聚己内酯(MPEG-PCL)与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯(Maleimide-PEG-PCL)为,采用注入法制备聚合物泡囊(PS),并将其与转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价连接。采用激光粒度测定仪、透射电镜对OX26-PS的大小形态进行鉴定;采用免疫透射电镜和X射线光电子能谱(XPS)对OX26-PS表面连接的OX26进行定性鉴定;采用ELISA法定量测定递药系统表面连接的OX26数目。结果显示,OX26-PS平均粒径在100nm左右,免疫透射电镜和 XPS证实OX26与PS共价连接的存在,ELISA法测得Maleimide-PEG-PCL与MPEG-PCL比例为1:10时PS表面连接的OX26平均数目为40.6个。 OX26,聚合物泡囊,脑靶向,血脑屏障, 随着人类社会的老龄化,脑部疾患的发病率逐年上升,已成为危害人类健康 的主要疾病之一。血脑屏障(BBB)的存在严重影响了药物的脑内转运和脑部疾 病的治疗。而脑内靶向递药系统的研究为其带来新的希望,其中尤以通过受体介 [1]导转运入脑的微粒递药系统的研究最为成功,代表性的研究为转铁蛋白受体的 单克隆抗体OX26介导入脑的空间稳定免疫脂质体。其具有诸多优点,但也存在 某些不足,如载药系统脂质体的体内外稳定性均较差,往往尚未到达脑微血管的 吸收部位,载药系统即已解体,严重影响了药物的脑内递释效果。鉴于此,有必 要而且也亟需探寻新型的载药系统,构建更为合理、有效的脑内靶向递药系统。 [2]聚合物泡囊(Polymersomes)是一种新型的药物载体,其与普通囊泡、胶束和脂质体不同,是由具有两亲性质的、可生物降解的聚合物分子构建而成,结 构类似于细胞膜的双分子层。它具有脂质体和纳米粒等微粒载药系统的主要优 [3]点,而其体内外的稳定性显著优于脂质体;由于具有亲水性的内核结构,因此, 对于亲水性药物,尤其是蛋白多肽类药物、基因药物的载药量可望优于纳米粒; 此外,通过聚合物分子的种类、分子量、嵌段比例等选择,所构建泡囊载药系统 的理化特性如粒径、载药量、表面修饰,乃至体内行为更具有主观的可调控性, 因此,可望获得比现有微粒系统更佳的载药效果和脑内靶向递药特性。 本课将聚合物泡囊与转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26相组合构建了一种新型脑靶向递药系统——OX26-聚合物泡囊递药系统(OX26-PS)。 - 315 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 电子天平(AE200,Mettler),漩涡混和器(XW-80A,上海医科大学仪器厂),旋转蒸发仪(R-200,Buchi),恒温水浴(B-490,Buchi),恒温磁力搅拌仪(B-490,Buchi),层析柱(上海锦华层析设备厂),电热恒温鼓风干燥箱(101-1-B,上海跃进医疗器械厂),紫外分光光度仪(UV-240 1PC,Shimadzu),粒度/zeta电位 TM测定仪(NICOMP380 ZLS,NICOMP),冷冻干燥仪(Alpha2-4,Martin Christ),台式离心机(TGL-16C,上海安亭科学仪器厂),核磁共振仪(Mercury Plus 400MHz,Varian),X射线光电子能谱仪(PHI 5000C ESCA System,PHI),透射电镜(CM120,Philip),高效液相色谱仪(LC-10A RF-10AXL,Shimadzu),凝胶渗透色谱仪 (Agilent GPC-Addon Rev.A.02.02),酶标仪(ELx800,Bio-Tek)。 ε-己内酯(纯度99.9%,DOW),用氢化钙减压干燥24小时,用前减压蒸馏; 单甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)(Mn=3000,Sigma),用前放在装有PO的真空25器中过夜;辛酸亚锡(亚锡含量26.5%-27.5%,上海化学试剂公司),重蒸后 配成10%甲苯溶液使用。马来酰胺基聚乙二醇(Maleimide-PEG)(Mn=3400,Sigma),用前放在装有PO的真空器中过夜。转铁蛋白受体的单克隆抗体(OX26)25 (Serotec),2-iminothiolane(Sigma),10nm胶体金标记羊抗小鼠IgG(Sigma),小鼠IgG Elisa定量试剂盒(Bethyl)。 2A ε-己内酯、MPEG(或Maleimide-PEG)和适量辛酸亚锡装入干燥过的反应 瓶中,加入10mL甲苯,通入干燥氮气,密封。恒温90?ε-己内酯单体开环聚合24小时。冷水冷却终止反应,旋转蒸发去除甲苯。反应产物加入二氯甲烷溶 解,倒入乙醚中沉淀,以除去未反应的己内酯以及形成的己内酯均聚物。纯化后 的聚合物40?(Maleimide-PEG-PCL为室温)真空干燥24小时,再放入真空干 燥器中保存。改变ε-己内酯与MPEG(或Maleimide-PEG)的质量比,得到不同 分子量的MPEG-PCL及Maleimide-PEG-PCL共聚物。 1131将这两种聚合物溶于CDCl进行H和C核磁共振图谱分析,根据H谱中化3 学位移2.31ppm和3.65ppm峰面积,计算Maleimide-PEG-PCL和MPEG-PCL数均分子量。计算如下: SMn(MPEG),114,42.31ppmMn(NMR),,,Mn(MPEG)44,2S3.65ppm S—2.31ppm峰面积;S—3.65ppm峰面积 2.31ppm3.65ppm - 316 - 复旦大学 论文集(2007) Mn(MPEG)—MPEG段分子量,其中Maleimide-PEG分子量为3400,MPEG分子量为3000。 114—聚己內酯单元-O-CH-CH-CH-CH-CH-CO-分子量 22222 44—聚合物中乙二醇单元-O-CH-CH-分子量 22 采用GPC对聚合物的分子量和分布进行了表征。检测条件为室温,溶剂为四 氢呋喃,用聚苯乙烯品进行校准。 将Maleimide-PEG-PCL与MPEG-PCL按照1:20、1:10和1:5的比例混合,采用注入法制备聚合物泡囊,主要步骤如Fig.1A: []4 采用Traut’s试剂巯基化OX26。将OX26溶解于0.15 mol/L的硼酸钠/ 0.1 mmol/L的EDTA缓冲液(pH 8.5)中,以OX26: 2-iminothiolane摩尔比为1: 40加入Traut’s试剂,室温搅拌1 h,经Hitrap脱盐柱分离除去2-iminothiolane,洗脱液为0.01 mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(phosphate buffer saline,PBS,pH 7.0), [5]即得巯基化OX26。参考文献报道,采用5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB,Ellmann's试剂)测定蛋白质的巯基化程度。将巯基化后的OX26定量加入已制备好的空白泡囊中,室温下磁力搅拌反应6h,再通过Sepharose CL-4B柱分离除去游离的巯基化的OX26,即得OX26-PS,具体流程如Fig.1B。 Fig1.Preparation protocol of (A) PS and (B) OX26-PS ?采用粒度/Zeta电位测定仪,测定OX26-PS光散射粒径。 ?采用粒度/Zeta电位测定仪,测定OX26-PS 在0.001 mol/L NaCl介质中的Zeta电位。 ?OX26-PS经1-2%(w/v,pH 7.0)磷钨酸负染色后,透射电镜下观察OX26-PS - 317 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 的形态。 以Maleimide-PEG-PCL : MPEG-PCL=1:10的比例制备PS和OX26-PS,冷冻干燥;另外配制Maleimide-PEG-PCL : MPEG-PCL=1:10的混合物。X射线光电子能谱分析PS和OX26-PS冻干样品以及高分子材料混合物表面的元素组成(C,N,O)。仪器为美国PHI公司的PHI 5000C ESCA System;采用条件为镁靶(h=1253.6 o-8eV),电子发射角为54,高压14.0kV, 功率250W,真空优于1×10 Torr。采用美国RBD公司的RBD147数据采集卡和AugerScan3.21软件采集样品的0~1200eV的全扫描谱和各元素相关轨道的窄扫描谱,并采用AugerScan3.21软件进行数据分析。以C1s=284.6eV为基准进行结合能校正。采用AugerScan3.21进行分峰拟合。 由于OX26可以特异性的与脑毛细血管内皮细胞的转铁蛋白受体结合,以受 体介导的方式转运入脑,因此鉴定OX26-PS表面是否共价连接OX26十分重要。 [5]我们采用免疫胶体金染色实验鉴定PS表面是否连接OX26:取100μL OX26-PS 11(含10–30μg)与未稀释的免疫胶体金复合物(5–15 × 10 个金微粒)混合,在0.018M的 Tris缓冲液中(pH=8,含有0.9%的牛血清白蛋白、17%的甘油,总体积为58μL)孵育1h,过Sepharose CL-4B柱除去未结合的胶体金复合物。透 射电镜下观察。另取空白PS100μL(含10–30μg)重复上述实验作为对照,透 射电镜下观察。 考虑到OX26-PS表面连接的抗体数目对递药系统脑内转运效率具有显著的 影响,因此实验采用ELISA法定量测定了递药系统表面连接的OX26数目。首先根据对标准品、样品、空白以及对照品的分析量确定需要的孔数, 每个样品均制 O备复样。在每孔加入100μL包装缓冲液后加入1μL捕获抗体。37C孵育60min。孵育后,将每孔中的液体吸出。用洗脱液对每孔洗3次。在每孔中加入200μL O阻断液,37C孵育30min。之后将液体吸出,清洗3次。将标准品稀释为一系列 浓度(250~3.9ng/mL)。样品则要视被分析物的浓度而定。分别移取100μL的 O标准品或样品至已处理过的孔中。37C孵育60min。孵育后将液体吸出,并清洗 O5次。将HRP结合物稀释至一定浓度1:1000后,往每孔加100μL。37C孵育60min, O孵育后将液体吸出,每孔清洗5次。每孔加入100μL的酶底物溶液,37C孵育30min。加入100μL终止液终止反应。酶标仪测定A。采用Statistica6.0进450nm 行4-PL曲线拟合标准曲线。 - 318 - 复旦大学 论文集(2007) 1根据两种根据H谱中化学位移2.31ppm和3.65ppm峰面积,计算Maleimide-PEG-PCL和MPEG-PCL核磁共振分子量,结果见Tab1。聚合物的分子量可以通过调整MPEG与己内酯的比例来控制。通过严格控制实验条件可以得到与 预期几乎一致的聚合物分子量。从表中可以看出,具有羟基末端的MPEG-PCL和Maleimide-PEG-PCL的分子量与预期一致。 Tab1 Synthesis of Hydroxy-Terminated MPEG-PCL and Maleimide-PEG-PCL abbcc Mn MPEG PCL Mn Mw/Mn PEG feed PEG found Mn segment segment ratio(%) ratio(%) 30 28.28 10000 10610 3000 7610 8583 1.22 31.91 32.46 10400 10476 3400 7076 5011 1.26 a bCondition: 110 ? , 150mgSn(Oct)2, 24h, in bulk. calculated by feed ratio. ccalculated by 1HNMR spectra. obtained from GPC (based on standard polystyrene) 113Fig2. (A)HNMR and (B)CNMR spectra of MPEG-PCL(3k-7.6k) in CDCl3 113Fig3.(A)HNMR and (B)CNMR spectra of Maleimide-PEG-PCL3.4K-7K in CDCl3 我们合成所得到的共聚物MPEG-PCL与Maleimide-PEG-PCL具有与文献报道 - 319 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 [7]113相一致的特征性H和C核磁共振谱图(Fig2,Fig3)和化学位移。特征峰3.38 ppm (a), 4.2 ppm (d), and 3.8 ppm (c)也进一步说明反应形成了MPEG-PCL嵌段共聚物。我们采用GPC对嵌段共聚物进行了进一步验证,结果显示没有共聚物 单体或均聚物的存在(未列出数据)。 对于Maleimide-PEG-PCL来说,反应前理论上Maleimide-PEG亚甲基质子峰面积与Maleimide质子峰面积之比为220,与我们反应后的实测比值189十分接近,这说明反应后绝大部分马来酰胺基成功地保留在共聚物中。 透射电镜下观察,Maleimide-PEG-PCL和MPEG-PCL不同比例制备的PS和OX26-PS,粒子大小均匀,外观圆整,粒径在100nm左右。OX26-PS的粒径与PS无显著差异,其中以Maleimide-PEG-PCL:MPEG-PCL为原料制备的OX26-PS的透射电镜照片见Fig3A,3B。PS和OX26-PS的粒径和Zeta电位见Tab2。 Tab2 Volume-based particle size and Zeta potential of PS and OX26-PS (n=3) PS OX26-PS Sample Particle size Zeta potential Particle size Zeta potential (nm) (mV) (nm) (mV) 1:20 86.7 ?6.9 -18.12 ?1.3 95.5 ?7.9 -20.39 ?1.8 1:10 108.2 ?11.6 -22.36 ?1.5 105.2 ?12.5 -21.32 ?1.7 1:5 105.9 ?11.3 -19.54 ?1.5 119.7 ?12.8 -18.18 ?1.5 透射电镜下可以很清楚的观察到,OX26-PS表面标记有黑色的胶体金颗粒 (Fig4-D),而空白的PS表面(Fig4-C)未见胶体金颗粒,证实该聚合物泡囊表 面连有OX26。 Fig3 Transmission electron micrograph of (A) OX26-PS, bar 100 nm; (B) OX26-PS, bar 20 nm;(C) PS stained with Immuno-gold (10nm), bar 20nm;(D) OX26-PS stained with Immuno-gold (10nm), bar 10nm. 由X射线光电子能谱分析可以推测Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL (1:10) - 320 - 复旦大学 论文集(2007) 混合物、PS和OX26-PS表面元素的组成(Tab3)。通过曲线拟合发现,C1s能谱可以分为4个峰,O1s能谱可以分为2个峰,OX26-PS所产生的N1s能谱可拟合成峰,但信号较小;而Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL (1:10)混合物和PS无N1s能谱,也不能所产生拟合成峰(Fig5)。 利用X射线光电子能谱对PS进行表面元素分析,可以测定PS表面以下5-10 [9]nm深处的元素组成。分析结果显示,以Maleimide-PEG: MPEG为1: 10制备的OX26-PSPS,表面的N元素占C,O,N的0.5%(Tab6,XPS检测限为0.1%)。由于PEG-PCL材料的元素组成中不含有N元素,OX26-PS表面的N元素可能来自于马来酰亚胺基和OX26。对照分析Maleimide-PEG: MPEG为1: 10物理混合物的结果,聚合物中马来酰亚胺基N元素的含量低于检测限(0.1%)。由此可知,OX26-PS表面N元素主要来自于OX26,从而证明PS表面连接有OX26。 Fig5 Carbon C1s envelopes from XPS analysis of: (A) mixture of Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL mixture (1:10) copolymers, (B) pegylated nanoparticles unconjugated with OX26 (PS) and (C) OX26-PS (Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL ratio is 1:10). Nitrogen N1s envelope from XPS analysis of (D) mixture of copolymers, (E) PS and (F) OX26-PS. Oxygen O1s envelopes: (G) mixture of copolymers, (H) PS and (I) OX26-PS. Tab3 XPS analysis of Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL mixture (1:10), PS (Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL ratio is 1:10) coupled with or without OX26 - 321 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 XPS O1s XPS elemental XPS C1s envelope ratios (%) envelope ratio (%) ratios (%) Samples C-C/C-H C-O-C C-O-C=O O-C=O O=C O-C C O N Binding Energy (eV) 286.0 287.5 288.7 291.4 534.4 535.4 Copolymers 75.1 24.9 - 1.6 4.5 83.2 10.7 2.3 97.7 PS 79.3 20.7 - 44.6 0.6 47.4 7.5 73.5 26.5 OX26-PS 80.2 19.6 0.2 8.0 13.9 68.4 9.4 45.8 54.2 - = below the detection limit Copolymers = Maleimide-PEG-PCL:MPEG-PCL mixture (1:10) 不同浓度标准品的A吸收值如Tab4所示。 450nm Tab4 A of various concentrations of standard solutions 450nm 浓度(ng/ml) 250 125 62.5 31.25 15.625 7.8 3.9 A450nm 1.195 0.883 0.543 0.313 0.203 0.132 0.092 计算聚合物表面OX26的平均数目,过程如下: ?ELISA测定OX26浓度Y: Y=(0.081728-1.65163)/(1+(X/122.806)^1.26402)+1.65163, R=0.99979 2?A350浊度法测定PS浓度: 线性Y=0.4091X+0.0056 R=0.9998。线性范围:0.196-1.96mg/mL ?根据平均粒径计算每毫升洗脱液中OX26-PS的平均数目: -333-21N=6×W×10/(π×(D-(D-10))×10×ρ),根据文献查得ρ=1.13 3g/cm; -923?每毫升洗脱液中与纳米粒结合的OX26数目:M=Y×10/MW×6.02×10, MW=160000; ?计算平均每个PS上接有OX26的数目:P=M/N。 计算数据如Tab5所示。 Tab5 Calculated average number of OX26 per OX26-PS Maleimide-PEG-PCL: MPEG-PCL 1:10 1:20 PS concentration (W, mg/ml) 2.085 0.866 Particle size (X, nm) 105.2 95.5 Particle Number (N) 1.1696×1013 5.95×1012 Conjugated OX26 concentration (ng/ml) 1.261×105 3.02×104 Conjugated OX26 number (M) 4.47527×1014 1.13778×1014 Average number of OX26 per OX26-PS 40.6 19.1 - 322 - 复旦大学 论文集(2007) 采用药剂学方法克服血脑屏障,增加药物的脑内转运,已经成为脑内递药研 究的新热点。利用OX26作为靶向头基介导药物的脑内传递,国外已有报道。如 转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26介导入脑的空间稳定免疫脂质体,OX26的脑靶向作用得到了很好的证实。但上述研究中脂质体的体内外稳定性均较差,往往尚 未到达脑血管的吸收部位,载药系统即已解体,严重影响了药物的脑内递释效果。 为了提高给药系统的体内外稳定性及载药量,本课题以Malemide-PEG-PCL和MPEG-PCL为聚合物材料制备了聚合物泡囊,以OX26作为靶向头基,与之共价 连接制备新型药物传递系统——OX26-PS。 生物可降解性材料有多种,如聚己內酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基 [9]乙酸的共聚物(PLGA)等,它们均具有生物相容性好,安全性高等特点,但是采用这些疏水性材料制备的地为粒径血管给药后迅速被体内单核巨石系统吞噬, 因此血浆半衰期短,AUC小。为了克服这种缺陷,将高分子材料连接亲水性PEG链,合成二嵌段共聚物。这样所制备的纳米粒或脂质体核心由共聚物中疏水性部 分构成,表面有亲水性PEG覆盖。由于PEG链的立体屏障作用,使得纳米粒或脂 [10]质体免受单核巨噬系统的吞噬,延长血浆半衰期,提高AUC值。我们借鉴这样的经验,本试验选择合成PEG-PCL二嵌段共聚物作为聚合物泡囊的材料。 另一方面,考虑到聚合物泡囊表面Maleimide-PEG需与OX26共价连接,因此在选择PEG链长时考虑Maleimide-PEG的分子量应大于MPEG分子量,这样使得聚合物泡囊表面的Maleimide-PEG可以伸出MPEG形成的“刷状”或“雾状” 结构,有利于与OX26的共价连接。同时,与聚合物泡囊相结合的OX26伸出聚合物泡囊的表面,有利于其余BBB上的转铁蛋白受体相结合,通过受体介导胞吞转 运入脑。故本试验选择Maleimide-PEG3400和MPEG3000。 转铁蛋白(transferrin,Tf)是一类广泛存在于脊椎动物体液及其细胞中的 单体糖蛋白家族,包含血清转铁蛋白、卵转铁蛋白、乳铁蛋白和黑素转铁蛋白。 在脊椎动物所有具核细胞中均有转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)的表达,尤其在肿瘤细胞、血脑屏障(BBB) 、快速分裂等代谢旺盛需要大量铁的组 织。生理条件下,由于转铁蛋白在血清中浓度较高, 约为25μmol/L,血脑屏障的TfR被认为几乎完全被转铁蛋白饱和,转铁蛋白作为药物脑靶向载体受到限制 [11]。然而,由于TfR的单克隆抗体OX26与TfR 的结合位点和转铁蛋白与TfR 的结合位点不同,且不相互干扰,因而可采用OX26作为药物脑靶向载体。 - 323 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 一项对离体牛的毛细血管研究表明,经过2 h的孵育,大约50%放射性标记的OX26通过内吞作用被摄入。另外,颈动脉灌注实验表明,65%注射量的OX26 通过了血脑屏障进入细胞外间隙,这个值远远高于对照组蛋白(血清白蛋白和免疫球 蛋白) ,这表明通过转铁蛋白受体极大地加强了OX26通过血脑屏障的能力。静脉 快速注射放射性标记的OX26也使OX26在脑内稳定蓄积,然而放射性标记的OX26 注射后迅速地从血清中被清除,这就表明OX26 在血脑屏障迅速地与转铁蛋白受 [12]体结合随后逐渐通过血脑屏障。而Bickel 等把化疗药物与OX26 偶联后,借 [13]TfR也成功将药物导向脑部。因此,我们以OX26作为本递药系统的靶向头基。 本递药系统包载药物后,可以通过表面共价连接的靶向头基OX26与脑部的转铁蛋白受体特异性结合,利用受体介导胞吞转运的方式增加药物透过BBB。其脑靶向效果会在接下来的药效学试验中进行验证。 [14]聚合物泡囊的制备方法主要有超声法、注入法、逆相挥发法、薄膜分散法、 [5]反复过膜法等。相比而言,注入法十分简便,只需将以溶解在有机溶剂中的成 膜材料注入一定比例的缓冲液或去离子水中,静置使其自组装即可。其次注入法 的包封率比较高,如在离子表面活性剂与胆固醇摩尔比为1:1时,注入法和薄 [14]膜分散法制得的泡囊对胆固醇的包封率分别为0.44和0.106L/mol。同时该方法对试验条件的要求很低。另外聚合物泡囊采用注入法制备,有利于包载水溶性 药物,如蛋白质多肽类药物,并可掩盖药物的自身性质,代之以聚合物泡囊的特 性,有利于载药系统靶向脑部。故本试验采用注入法制备聚合物泡囊。 激光散射粒径仪和透射电镜测定结果显示,聚合物泡囊在连接OX26后粒径未发生明显增加。OX26-PS和PS的粒径均在100nm左右。由于粒径是影响BCEC内吞的关键因素,通常认为粒径分布范围在200nm以下的脑内特异性传递的微粒 [4,5,15,16]给药系统的效果比较好。因此,我们制备的聚合物泡囊可望得到比较好 的脑靶向特性,提高药物的入脑量。 Zeta 电位是微粒的一个重要参数,与微粒体系的稳定性、流变性以及界面和 分散体系的相互作用密切相关,测定Zeta 电位可以预测微粒体系的储藏稳定性 [17] 。通常,较高的Zeta 电位混悬液体系可由电荷间的排斥作用,使得粒子间的凝聚减少,从而使整个体系较为稳定。OX26-PS及PS的Zeta电位均在-20mV左右,因此该聚合物泡囊相对比较稳定。OX26-PS的Zeta电位主要有两部分构成: ?粒子表面的PEG链,它能够屏蔽泡囊核心PCL所产生的强烈负电荷,?泡囊表 面连接的OX26所带电荷。由于泡囊表面所带OX26数目较少,且OX26本身所带电荷也较少,因此对整个粒子的Zeta电位贡献不大。从OX26-PS的Zeta电位仅比PS低1~2mV,占总体Zeta电位不足10%亦可得出此结论。而PEG的屏蔽作用则十分显著,MPEG-PCL聚合物泡囊的Zeta电位(-20mV)显著高于PCL纳米粒 - 324 - 复旦大学 论文集(2007) [18]的Zeta电位(-29.0mV),这是决定泡囊Zeta电位的最重要因素。 另外,BBB上虽然也带有负电荷,但由于本递药系统主要是依靠OX26与转铁蛋白受体的特异性结合来介导药物转运入脑内,因此Zeta电位是负值并不会影响到该递药系统的靶向特性及药物的入脑量。 课题采用注入法,以MPEG-PCL、Maleimide-PEG-PCL和OX-26为原料制备OX26-聚合物泡囊递药系统,国内外未见报道。经透射电镜观察和OX26-聚合物泡囊表面元素分析证实OX-26连接在聚合物泡囊表面;用浊度法和ELLISA法相结合即可定量计算出当Maleimide-PEG-PCL:MPEG-PCL分别为1:10和1:20时聚合物泡囊表面连接的OX26平均数目为40.6和19.1;平均粒径约为100nm,Zeta电位在-20mV左右,这些结果显示本递药系统可望获得较好的脑内递药特性。 [1] Pieter J Gaillard, et al. Targeted delivery across the blood-brain barrier[J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2005, 2(2):299-309. [2] Ennis E Discher, et al.Polymer vesicles[J]Science, 2002, 297:967 -973. [3] Eter J. Photos, et al. Polymer vesicles in vivo: correlations with PEG molecular weight[J]. Journal of Controlled Release, 2003, 90:323 -334. [4] Huwyler J, Wu DF, Pardridge WM. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes[J]. Proc Natl Acad Sci,1996, 24 (93):14164-14169. [5] Oliver J C, Huertas R, et al. Synthesis of pegylated immunonanoparticles[J]. Pharmaceutical Research, 2002, 19(8): 1137-1143. [6] Ellmann GL. Tissue sulfhydryl groups[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82 (1): 70-77. [7] Yuan M, Wang MH, et al. Polymerization of Lactides and Lactones. 10. Synthesis,Characterization, and Application of Amino-Terminated Poly(ethylene glycol)-co-poly( -caprolactone) Block Copolymer[J]. Macromolecules, 2000, 33:1613-1617. [8] Dehouck MP, Dehouck B, et al. Drug transport to the brain: comparison between in vitro and in vivo models of the blood-brain barrier[J]. Europe Journal of Phamaceutical Science, 1995,3(3):357-365. [9] Dong Y, Feng SS. Methoxy poly(ethane glycol)-poly(lactide) (MPEG-PLA) - 325 - 多肽蛋白修饰树突状大分子PAMAM用于基因转染研究 nanoparticles for controlled delivery of anticancer drugs[J]. Biomaterials, 2004,25(14):2843-2849. [10] Plard JP, Bazile D. Comparison of the safety profiles of PLA50 and Me.PEG-PLA50 nanoparticles after single dose intravenous administration to rats[J]. Colloids SurfB Biointerfaces, 1999,16(2):173-183. [11] Bazile D, Prud’homme C, et al. Stealth Me.PEG-PLA nanoparticles avoid uptake by the mononuclear phagocyte system[J]. Journal of Phamaceutical Science, 1995,84(4):493-498. [12] 赵莉霞,颜冰,黄培堂。转铁蛋白受体及其在药物运输中的作用[J]. 生命 的化学,2004,24(6):468-469. [13] Bickel U, Yoshikawa T, Pardridge W M. Delivery of peptides and proteins through the blood-brain barrier[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2001,46:247-279. [14] 张景京力,陆彬。类脂泡囊的研究进展[J]. 国外医药——生化药 合成药 制剂分册,1999,20(3):188-192. [15] Thöle M, Nobmanna S, Huwyler J, Bartmann A, Fricker G. Uptake of cationzied albumin coupled liposomes by cultured porcine brain microvessel endothelial cells and intact brain capillaries[J]. Journal of Drug Targeting, 2002, 10 (4): 337-344. [16] Calvo P, Gouritin B, et al. Long-circulating PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as new drug carrier for brain delivery[J]. Phamaceutical Research,2001,18(8):1157-1166. [17] Rainer HM, Karsten M,Sven G. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery-a review of the state of the art[J]. Europe Journal of Phamaceutical Science, 2000,50(1):161-177. [18] Verger ML, Fluckiger L, et al. Preparation and characterization of nanoparticles containing an antihypertensive agent[J]. Europe Journal of Phamaceutical Science, 1998(46):137-143. 感谢李政道及其夫人设立这个基金,感谢莙政基金对我的资助,感谢蒋新国 研究员和庞志清博士对我实验的认真、耐心的指导,感谢陈钧讲师、徐丰师姐和 李婧伟师姐和本课题组的所有成员在实验中给与的支持与帮助。 - 326 -
/
本文档为【转铁蛋白受体介】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索