胶质原纤维酸性蛋白的研究进展

胶质原纤维酸性蛋白的研究进展 3胶质原纤维酸性蛋白的研究进展 ()张 辉 饶志仁 黄文晋 第四军医大学全军神经科学研究所 ,西安 710032 ( ) () 摘要 星形胶质细胞 ast rocyte ,A S约占正常成人中枢神经系统 cent ral nervo us system , CN S细 ( 胞总数的 40 % ,其重要功能日益受到重视 。A S 可特异性达胶质原纤维酸性蛋白 glial fibrillary ) acidic p rotein , GFA P。GFA P 是 A S 骨架蛋白特有的成分 ,可作为 A S 的特异性标记物 。本文主要 ( 从分子生物学角度 ,就 GFA P 在复杂的细胞活动 如细胞骨架重建 、髓鞘维持 、细胞粘附和信号转 ) 导途径等中的广泛作用 ,及 GFA P 转基因动物研究等做一综述 。 关键词 胶质原纤维酸性蛋白 ;星形胶质细胞 ;中枢神经系统 ;分子生物学 学科分类号 R322 . 81 ( )真核细胞骨架主要由微丝 、微管和中间丝 IFs GFA P 。 三种 蛋 白 质 组 成 。IFs 又 分 为 至 少 6 型 : 角 质 素 二 、GFAP 基因及转录调控 ( ) () () Keratins是 I 型 酸性和 I I 型 碱性的唯一成员 ; 目前已从人类 GFA P cDNA 克隆的核苷酸序列 ( ) ( ) ( ) 而波形蛋白 vimentin、硬纤维蛋白 desmin、GFA P 推导得出 GFA P 的氨基酸序列 。Brenner 1990等 和 perip herin 归为第 ?型 ,它们有 70 %以上的同源( ) 及 Bo ngram2Rudloff 等 1991 已 将 小 鼠 和 人 的 α性 ;神经丝蛋白和2inter nexin 属第 ?型 ; 核纤层蛋 GFA P 全 长 基 因 克 隆 并 测 序 。大 鼠 、小 鼠 和 人 的 () 白 L amin为第 ?型 ; 而一种叫 nestin 的蛋白 ,存在 GFA P 在 基 因 编 码 区 有 高 度 同 源 性 , 不 同 种 属 间 于胚胎发育早期的神经上皮干细胞 ,根据序列及结GFA P 同源性达 90 %, 95 % , 但在 3 ’端非翻译区 构被划作 IF 超家族的第 ?型 。同源性较低 。现已确定人类 GFA P 基因定位于第 A S 广泛分布于 CN S 各个部位 ,约占正常成年 ( ) 17 号染色体 17q21。一个包括至少 22 个基因的 人脑细胞总数的 40 % 。GFA P 则是 A S 特有的细胞 合成性基因簇定位于 17 号染色体上 ,而 GFA P 基因 骨架蛋白 ,分子量 50 kD ,属细胞质内 IFs 的一种成正属于其中一部分 。 分 ,在诸多复杂的细胞活动中具有十分广泛的作用 。( GFA P 基因增强子或正性调控区 po sitive regu2 一 、星形胶质细胞的特征性标记物 ) lato ry regio n 位 于 - 250bp 到 - 80bp 之 间 和 - GFA P 最初是从慢性多发性硬化病患者的白质 ( ) 1980bp 到 - 1500bp 之间 , 而沉默子 silencers或负 () 斑块 plaques中分离出来的 。GFA P 表达受多种生 ( ) 性调控 区 negative regulato ry regio n位 于 - 650bp 理 、病理条件影响 , CN S 受损时发生 GFA P 水平上() 到 - 360bp 之间 。Besnard 等 1991发现人类 GFA P 调 ,是 CN S 及 A S 最常见的特征性反应之一 , 目前() 基因启动子 p ro moter在正性调控区内存在针对环 GFA P 已成为正常及病理情况下应用最广泛的 A S( ) - 磷酸腺苷 cAM P的反应性结合蛋白 、Sp21 、N F2标记物 。胚胎神经发育早期 A S 前体的 IFs 一般以 1 、Ap21 及 Ap22 等转录因子的结合部位 。这些转录 波形蛋白为主 ,在 A S 成熟时波形蛋白的表达水平 因子是受各种刺激后首先产生的一些蛋白质 ,能介 降低而 GFA P 表达增加并贯穿一生 ,因此 GFA P 被导由激素 、生长因子及抗原诱发的基因调控变化 。例 1 公认为 A S 的成熟标志。如 :脑部炎性反应期可释放白细胞介素类物质 ,导致 免疫组化染色显示 GFA P 含量随 A S 肿瘤恶性 c2J un 和 c2Fos 水平增高 。已证实这些早期反应基因 程度增 加 而 减 少 , 高 度 恶 性 胶 质 细 胞 瘤 中 浓 染 的 () early response genes产物结合于 GFAP 启动子 Ap21 , GFA P 阳性肿瘤细胞较低度恶性的胶质瘤或正常脑 并提示这些细胞因子可能增强 GFAP 转录 。 组织中要少 ,因此 GFA P 还可作为正常 A S 及 A S 系 GFA P 启动子还包含使 A S 产生胶质细胞相关肿瘤分化的可靠标志物 。但应注意区分 GFA P 阳 表达 的 DNA 序 列 。目 前 对 控 制 A S 相 关 表 达 的 性肿瘤细胞与嵌入或包绕肿瘤组织的反应性 A S ,两 GFA P启动子序列尚有争议 ,但意见一致的是在人 者均表达丰富的 GFA P ;而且角膜上皮细胞 、唾液腺 3 上皮细胞 、Mlüler 细胞起源的肿瘤细胞等也可表达 () 国家自然科学基金资助课 39770251 γ GFA P 启动子正性调控区内一段胶质细胞特异性表 GFA P2mRNA 则同时存在于 CN S 和非 CN S 组织 6 () 达的序列 ,命名为“人类 GFA P 保守序列”,或“hgcs包括骨髓和脾等组织。L ef rancois 等发现用反 () human GFA P co nsensus sequence ”。已 知 几 种 顺 义 GFA P mRNA 阻断 GFA P 合成 ,抑制 A S 增生 ,减 式作用蛋白具有特异性结合到 GFA P 启动子上并 轻对神经突起再生的阻碍作用 。目前人们对 GFA P 增强胶质细胞特异性表达的性质 ,可利用这些蛋白 mRNA 各种形式的功能与作用了解较少 。 将 GFA P 启动子连接到感兴趣的其它基因 , 在 A S 蛋白质在丝氨酸 、苏氨酸或酪氨酸残基上发生 培养或转基因动物中实现特异性表达 ,用于神经发 育 、脑损伤和胶质细胞肿瘤发生及治疗等方面的研 磷酸化是一种常见的翻译后修饰 ,可使蛋白质构象 2 究 。Mc Kie 等已 将 GFA P 启 动 子 构 建 到 单 纯 疱 及功能发生迅速而可逆的改变 。正如其他 IFs 及细 疹病毒 RL 1 的突变载体中 ,并可选择性增强目的基 胞骨架蛋白一样 , GFA P 并非以单一形式静止存在 , 因的有效表达 。由于脑内肿瘤都是胶质细胞或以胶 而是处于不断聚合与解聚的动态变化之中 。现在一 质细胞起源为主 ,提示今后可将治疗性或肿瘤杀伤 般认为 GFA P 磷酸化对其从细丝解聚到可溶形式 性基因导入中枢系统肿瘤 。Toggas 等把人类免疫 缺陷病毒 H IV21 包被蛋白 cDNA 连接到一种转基 非常重要 ,这种解聚可能有助于细胞质分裂相胞质 因小鼠的 GFA P 启动子后 ,发现导致了神经元严重 成分平均分配到两个子代细胞 。3 损伤 。Trejo 等利用 GFA P 启动子通过转基因技 ( ) GFA P 的 中 央 杆 状 区 ro d do main高 度 保 守 , 术使动物体内合成达到治疗剂量的多巴胺 ,给治疗 而氨基与羧基端则具有可变的氨基酸序列 。氨基端 Par kinso n’s 病带来希望 。 片段的多变性提示该片段参与 GFA P 的调节功能 , 三 、GFAP 转基因动物研究已知发生磷酸化的 4 个氨基酸残基都位于该片段 ( ) Mucke 等 1991最早报道了 GFA P 转基因研 () 内 。Q uinlan 等 1989的研究表明氨基端顶端区域 究 ,他们发现 GFA P 启动子可指导 CN S 细胞某一报 () head regio n对 GFA P 细丝的形成必不可少 , 用凝 告基因的活动 , 而在其它器官则没有 。Camp bel 等 血酶消化氨基端可使 GFA P 失败 。另外发现 GFA P 用转基因技术在小鼠脑部 A S 中表达 IL26 ,发现转 氨基末端区域的丝氨酸和苏氨酸残基可作为如细胞 基因小鼠的后代发育迟缓 , 运动失调 , 并有癫痫发 周期蛋白依赖性蛋白激酶 cdc2 、cAM P 依赖激酶和 作 ,检查可发现其神经元和树突缺失 、或受损 ,并有 蛋白激酶 C 等多种蛋白激酶磷酸化的底物 。各种 4 明显的胶质细胞化和新血管形成 。Liedt ke 等发 蛋白激酶均可在 GFA P 聚合时发挥作用 ,且针对不 现 GFA P 基因缺陷小鼠生后 6 个月 ,脊髓 、视神经及 同残基部位依次激活可能对有丝分裂中胶质细丝的 大脑的髓鞘发育异常 ,提示 A S 功能与维持神经髓 解聚过程非常关键 。GFA P 氨基端被这些激酶磷酸 质密 切 相 关 。为 评 价 GFA P 的 功 能 , McCall 等 化 ,可促进已聚合细丝的解聚 。目前尚未确切了解哪 () 1996用胚胎干细胞基因打靶制成 GFA P 缺陷小 一个磷酸化位点及哪一种蛋白激酶对 GFAP 解聚最 鼠 ,发现突变小鼠行为及 CN S 形态均无明显异常 , 为关键 。在氨基末端区域的磷酸化显然是一种调节 CN S 中仍存在 A S ,但 A S 的中间丝数量极度减少 。 GFAP 聚合与解聚的重要方式 ,而 GFAP 在末端区域 5 Nolte 等则利用转基因技术表达受 GFA P 启动子 以外也发生磷酸化 ,其意义尚不清楚 。今后有待于对 控制的加强绿荧光蛋白 ,对小鼠 A S 进行标记 ,发现 GFAP 磷酸化的部位及时相做进一步研究 。 具备 A S 形态学特性的 GFA P 阳性细胞在 CN S 各 五 、GFAP 的功能区域均有稳定表达 ,大大方便了荧光显微镜观察 ,为 () 一GFA P 与细胞骨架的相互作用 已知 A S 活体脑组织观察 A S 及星形胶质纤维化提供了很好 通过 GFA P 丝与细胞核膜 、细胞膜之间的相互作用 的工具 。转基因技术对研究胶质细胞及与神经元相 来加强骨架蛋白 、维持细胞形状 。免疫电镜可显示 互作用很有价值 ,并预示了对 A S 起源肿瘤或 A S 行 A S 突起与神经内皮或软脑膜基底层接触部位存在 为施加影响的良好开端 。 丰富的 GFA P 丝 ,也就是说 GFA P 构成细胞膜与核 四 、GFAP 的磷酸化之间的连接结构 。这种物理性相互作用很可能与中 GFA P mRNA 公认的长度为 3 . 5 kb , 标准形式 ( α) 间丝相关蛋白 IF2associated p roteins , IFA Ps有关 , βγ为 GFA P2,还有 GFA P2和 GFA P2。外周神经系 7 β α 统中 以 GFA P2为 主 , CN S 中 以 GFA P2主 , 而 但细节尚不完全清楚 。Yang 等将一种连接神经 丝与 肌 动 蛋 白 微 丝 的 细 胞 骨 架 连 接 蛋 白 命 名 为 B PA GIn ,具有 B PA GIn 缺陷的小鼠会发生感觉神经 退变 ,并出现肌张力障碍 ,他们认为 B PA GIn 可能与 轴突运输机制相关 。另外在大鼠 C6A S 瘤细胞系中 来便逐年递增 , 其中 GFA P 的磷酸化 、去磷酸化及 发现了一种结合于 GFA P 可辅助细胞骨架支撑的其与细胞周期的关系 , GFA P 与细胞粘附 、信号转导 () IFA P ,叫网格蛋白 plectin,分子量 300 kD ,存在于 的实质联系 , GFA P 基因表达的调控与应用等方面 各种细胞中 ,可与几种 IFs 结合并共存于灶状粘附 都有许多亟待解决的问题 ,而不断涌现的新技术 、新 斑和肌动蛋白张力纤维部位 。 方法则 为 解 决 这 些 热 点 问 题 , 帮 助 人 们 深 入 了 解 () GFA P 在中枢神经系统中的功能提供了可能 。二GFA P 与细胞粘附 用 GFA P 反义序列处 理 GFA P 阳性细胞系 U2251M G 可使细胞粘附显著 下降 。IFs 通过肌动蛋白结合蛋白连接到肌动蛋白 参 考 文 献 细丝 ,而肌动蛋白则通过同一肌动蛋白结合蛋白连 1 Go mes FC , Paulin D ,Moura NV ,et al . Glial fibrillary acidic 接到细胞膜区域 ,这提示在空间上 GFA P 既与肌动 ( ) p rotein GFA P: modulatio n by growt h factors and it s im2 蛋白又与细胞膜相连 ,在细胞对微环境的反应及细 plicatio n in ast rocyte differentiatio n. Braz J Med Biol Res , 胞形状改变方面发挥作用 。 1999 , 32t 619,631 . () 三GFA P 与信号转导途径 细胞周期的演变 Mc Kie EA , Graham D I , Brown SM . Selective ast rocytic 2 过程受一系列蛋白激酶的调控 , 而蛋白激酶与 IFs t ransgene exp ressio n in vit ro and in vivo f ro m t he GFA P 之间存在密切的相互作用 。IFA P 介导切断 IF - IF p ro moter in a HSV RL 1 null mutant vector2potential 连接 ,并由单体 IFs 解聚为蛋白细丝 ,而信号转导途 glioblasto ma targeting. Gene Ther , 1998 , 5t 440,450 . Trejo F , Vergara P , Brenner M , et al . Gene t herap y in a 径中一种蛋白激酶 p 34cdc2 的激活则与波形蛋白 IF 3 rodent model of Par kinso n’s disease using differentiated C6 网的有丝分裂重组互相协同 。目前的研究已将 IFs cells exp ressing a GFA P - tyrosine hydro xylase t ransgene. 与细胞周期相关基因的表达联系起来 ,今后在该领 Life Sci , 1999 , 65t 483,491 .域的研究无疑将阐明 GFA P 在诸如突起形成 、细胞 Liedt ke W , Edelmann W , Bieri PL , et al . GFA P is neces2 4 粘附和细胞运动等诸多复杂细胞反应中的作用 。 sary for t he integrit y of CN S white mat ter architect ure and () 四GFA P 表达的调节 体外培养发现 A S 可 lo ng - term maintenance of myelinatio n. Neuro n , 1996 , 对细胞密度 、培养基成分和促进 cAM P 生成的激素 17t607,615 . 等多种 因 素 作 出 反 应 , 调 节 GFA P 的 合 成 。Reilly Nolte C , Matyash M , Pivneva T , et al . GFA P p ro moter - 5 8co nt rolled E GF P - exp ressing t ransgenic mice : A tool to vi2 β 发现转化生长因子1 对 A S 形态影响不大 ,但 等 sualize ast rocytes and ast rogliosis in living brain tissue. Glia , 导致 GFA P mRNA 和蛋白质水平显著增高 ,而碱性 成纤维细胞生长因子使 A S 形态由多角 形 变 为 星 2001 , 33t72,86 . 形 , GFA P mRNA 和蛋白质 水 平 明 显 降 低 , 并 能 显 L ef rancois T , Fages C , Peschanski M , et al . Neuritic out2 6 β著抑制转化生长因子1 的效应 ,已经证实在 GFA P growt h associated wit h ast roglial p henot ypic changes induced 增强子区域存在生长因子等的结合区 。此外 GFA P ( ) by antisense glial fibrillary acidic p rotein GFA PmRNA in 表 达 还 受 甲 状 腺 激 素 、糖 皮 质 素 等 激 素 的 调 节 。 9 injured neuro n - ast rocyte cocult ures. J Neurosci , 1997 , Chan 等对 培 养 的 A S 给 予 脉 冲 磁 场 刺 激 , 发 现 17t 4121,4128 . GFA P 水平在 3 天后一过性升高 ,并于 5 天后恢复 Yang Y , Dowling J , Yu QC , et al . An essential cytoskele2 7 正常 。 () 五其他 已知 A S 对神经元成活具有重要作 tal linker p rotein co nnecting actin microfilament s to inter2 mediate filament s. Cell ,1996 ,86t655,665 . 用 ,而 GFA P 则可能影响 A S 对中风后脑组织损伤 的保护作用 。实验证明 GFA P 缺如条件下小鼠对 Reilly J F , Maher PA , Kumari V G. Regulatio n of ast rocyte 8 10 脑缺血损伤具有更高的敏感性, GFA P 在缺血性 GFA P exp ressio n by T GF2beta1 and F GF22 . Glia ,1998 , 脑损伤发生发展过程中具有重要作用 。 22 202,210 . t 六 、展望9 Chan P , Eng L F , L ee YL ,et al . Effect s of p ulsed magnetic 目前 CN S 研究中胶质细胞已经开始受到前所 stimulatio n of GFA P levels in cult ured ast rocytes. J Neu2 rosci Res , 1999 ,55t 238,244 . 未有 的 重 视 , 而 GFA P 研 究 无 疑 应 得 到 进 一 步 深 Nawashiro H , Brenner M , Fukui S , et al . High suscep ti2 10 化 。关于 GFA P 的研究论著自从 20 世纪 70 年代以 bilit y to cerebral ischemia in GFA P2null mice. J Cereb Blood Flow Metab , 2000 ,20t1040,1044 .