HL1细胞系IKACh功能特征及对电刺激的反应（可编辑）

HL1细胞系IKACh功能特征及对电刺激的反应（可编辑） 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,南本人独、、,:完成。本学 位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主 要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试验材料、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相应的法律 责任。 研究生虢司曼新签鲻二级学院肄., ./年占月弓日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文 中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成 果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自 负。 研究生签名:司更 翩签章蘑 口年月弓日目 录 中文摘要 英文摘要研究论文.细胞系西功能特征及对电刺激的反应 前言一 日?吾?“ 材料与方法结果 附图 讨论 结论 参考文献? 综述致谢个人简历?中文摘要 细胞系 ?功能特征及对电刺激的反应 摘 要 .细胞是心房肌细胞系,它来源于.小鼠心房肿瘤组织。. 细胞可进行传代培养,培养过程中可观察到.细胞具有自主收缩 性, 并保持与心房肌细胞相似的生物化学特性和电生理学特征。.细 胞具 有胚胎期心房肌细胞的超微结构。应用技术研究。细胞的基 因表达,其基因表达特征与成年小鼠心房肌细胞基因表达很相近, 包括 .肌球蛋白重链、.肌动蛋白、间隙连接蛋白以及心房钠脲肽因子。 采用膜片钳技术,在.细胞上可记录到延迟内向钾电流样的电流, 在.细胞上还可记录到与通道电流相似的电流,但还没有得到确 切验证。.细胞系由于其显而易见的优点可长期传代培养,易获得 等,有很多潜在的应用价值。目前的证据表明.细胞在很多方面都 与成年小鼠心房肌细胞的生理生化特征和电生理特征很相近,但 同时也需 要更多的实验证据来丰富对.细胞系的认识,以便更好地利用它。 钾通道在心房肌细胞发挥重要作用,但对于.细胞中是否存在 功能性尚不得知。因此,本部分将针对.细胞的内向整流钾电 流进行研究。 在心房肌细胞存在有乙酰胆碱激活的内向整流钾电流,它在心 房肌细胞动作电位复极化过程中发挥重要作用。现已知道,瞄. 和.是构成的分子基础。在哺乳动物体内, 和主要分布于心房肌细胞和窦房结细胞,对调节心脏兴奋性起重 要作用。心脏中分布着交感神经与迷走神经纤维,迷走神经兴奋 释放神经 递质乙酰胆碱,,与心肌细胞膜上的受体结合, 激活相偶联的对敏感的蛋白,从而诱发内向整流钾电流。 另外,其他与敏感的/蛋白偶联的的受体如】嘌呤受体 以及家族的神经鞘脂类受体也可以激活。在心房肌细胞 动作电位复极化的过程中发挥重要作用。迷走神经张力过高可过度激活 通道,使心房细胞的有效不应期和动作电位时程 缩短而离散度增加,导致房内折返的发生,成为可能的心房颤动的诱发和中文摘要 维持机制。心房颤动与有着密切关系。有两种观点,一种认为 上调是诱发心房颤动的原因,另一种观点认为心房颤动会引起上调。 因此是心房肌细胞非常重要的钾离子电流,对其功能调节及机制的 深入研究对了解包括心房颤动等在内的心脏疾病有重要意义,而.细 胞系在这方面有重要的潜在价值。 本研究将首先验证.细胞是否存在,对此将使用乙酰胆碱 及腺苷诱发,用特异性阻断剂.对诱发的电流进行鉴别, 在此基础上对的其它特征,如去敏化等进行研究。 我们还以电压为 频率为 刺激.细胞小时,比较刺激前后 的变化。上述研究结果将为应用细胞系研究心肌细胞电生理 特征打下基础。 目的:研究.细胞是否存在及其特征;研究电刺激对. 细胞功能的影响。 方法:培养.细胞。复苏细胞前一天先在培养瓶中加入明胶和纤 维结合蛋白?孵育,第二天复苏细胞转入培养瓶中培养,小时后 更换 培养基。细胞铺片前先加入明胶和纤维结合蛋白?孵育。用.% .把培养瓶中的细胞消化下来,将细胞悬液均匀的滴在玻璃 片上,?温箱中培养。 利用乙酰胆碱和腺苷激活心肌细胞。乙酰胆碱, ,与心肌细胞膜上的受体结合,激活相偶联的对敏感的 蛋白,从而诱发内向整流钾电流。但是由于对受体的特异 性不强,除外还可激活偶联蛋白受体等,后者会抑制通 道,因此我们还选用腺苷作为激活剂。腺苷 通过与其受体结合,激活相偶联蛋白进而激活通道。利用腺 苷对电流的激活,以及.对是的特异性阻断作用, 对.细胞的进行研究。 . 、频率为 电刺激 利用 以电压为 .细胞,比较刺激的细胞和未刺激的细胞经上述刺激前后功能 的变化。 结果: 基础内向整流钾电流存在的证据。实验所用电压钳制程序为持骥 骤目鎏‘璺哗蜘尉翼觐十产洲鬃翠冰粝睥串戮彭 刚唠翠《圈‘骤目产朝辞色碎妊娶觐产瞽菊卫骤目叫掣朝磁印买驯 。翠 戟骤印耵‘唑拥尉冥娶,工工椠翠泓粝睥中戮 、彭硝畴翠杲椠圉‘骤目户明群刍碎妊亲觐,瞽鸦卫骤印叫掣明辅 ‘咄 ’‘骤印叫掣明酉醣朝刨业少鞋驻甲娶驯 。鬃码印副翠硫 髯中锈摹犟叫椠。骤印翳哇骤印唱羽,瞬狲珥目明坐刚畴’杪 。弩硫砖旱硫帛旦 絮骤目戥璇肆稍『歪澎砸‘肆削士粝劐刨到轴朝抖刨。酱砸碴翠阜一刚田; 哪笤门,豺叼明显刚畴‘醣鼹酱彰驰丁‘、『/独澎彩设戥明翠型薪 斟弛剧辘翠百\/敬擞百日理士粝坳一影羽习勤明骤审戥璇蚓‘辙刮辗 删士粝量‘髫 靴弓华骤印劫鳓蛭群搬‘戮莓蟛娶设戥 明翠型澎斟碰郡辑翠骤胃叼朝戥联‘詈靴百日辑蜊粝。弩 砸璃辛阜毋显著骤目叼明丁当刚唠’上潼砸狂。撇莓蟛耍骤印 哪‘散到,明翠型萄斟辙邵;显哗睡联翠曲。芬诳冯罩明骤印蛩著一 丑姑朝叼朝刚嘭哪髫门,。亚斟璃军朝例当刚畴。 。骤审归?朝戥璇辱韶唑撒刮 辊联鸦翠型硝畴。翠醣璁酱粝娶丁‘娶畔四砷鲲士?明 。。明 。妻 。翠再砷腿明骤印鎏百业 歪截苗县摹妍罩裂戡与‘ ‘蜘尉‘出娜唑蜘尉飘哲甜叼礁乜毋骤目掣掣娶‘蛹尉产 州礁卫骤印研百骤印叫掣县璇也毋肆部‘协晔独剧输与。 戥獭鞠荟朝治卧目噩妁朝酒酶旨裂娶诵也舁韶‘目勘明舁鄱哗 联词世骤砷即‘骤印 睡璇一暂朝叼?上凿隘雅。蜘尉产 鸪骤嚣叫掣明戥璇碰邵辑瞳誊舀丁刚畴。翠‘哗睡獬岫?椠勘辙 副辘 上出现扎挺瑚巯摹衅砰。群丑朝翠型骤印吣乙 。骤印岛婴嚣叫甲辨目中骤审掣掣啦霉朝腰誊邕丁询醣骐‘娶群 。翠码日皱 珂单鲲击朝 ’乙‘朝崦勘茑影罩与‘娶捌 召明艇崔舀‘骤印叫鎏蜘尉产删目‘亚辑磐目骤毳刨甲朗酉醣 阜骑唧骤印弭审掣甲朝腰咨鲁蟛‘华鼻。骤审揖骤毳掣号审骤目 刨掣 朝『】委警融丑锈华具眦雅。露朝琶抱卓著业‘磐审蚂叫、彭鬃 犁磐串叫彭研 ‘骤目掣彭面也轴卫鞋翠业‘婴印叫甲朝酉醣面乜期粤辫翠珂目 副‘刚畴 。华珥申事黔澎 。丑。 计睡莓蚁 。鞴‘ 善骅 牟麟重印塘罩县 部:弛邵输.:鞋哦桑觐士掣岛:目噩 当刚畴。:殴嚣姜 ? ,弗秘‖? ? 。币独翠逻骤印明刚畴.翦而且 璇晔审。撤莓蟛耍叼 磁戥朝翠型萄斟弛酬辘翠茸‘芬诳璃罩翠 型 .毋叼鲷刚畴朝戥璇辙酣辘甲‘辩一峨嗡朝哪髫叼,刨。叼 骤肆蚂骤舞叫掣朝县獭独邵辐翠掣显瞽刚嘭晕巯半目世那图 ‘尴蜘副科哲姑叼普。出瑚,‘蜘尉邶 ?如唑 产 ’ 骥也‘叼骤目曲骤嚣刨掣明县獬斑酣输翠掣刚畴。:拱粝 一 . 。粥雅朝 叼狲割诵世獭晔目硝畴。翠醣擎凿弱菊释。‘‘。千 。乙瞠’ ‘椠暂髟翠毋骤印明叼朝髯磐肆翻。‘/ ’千抄。瞠。千’ 鬃眙髟瑁露骤印明叼朝髯磐擞酣辊甲 刚畴。朝璇哗士易咄璇胖半醣擎酱粝。砒甄朝骤申婆鞍晔潍羽‘骤 目蜘目。唑乙它士粝鞴‘叼?明髯磐曼韶瞠搬郡输甘誊融 髻影半辑船曹瓤目滥。驻羽身桑刚畴朝勒学奖崭抖刨与期刨‘期 \/乙刚畴璇哗繇华朝 鬃索瞬 椠珥目丽‘器獭晔印附 。目卷锈萃。蛐缮明鸦辁叼当硝畴牲搬哗审 。蜘喇 莒辫 牟英文摘要 .. 一 .? ,. , , 一;? 一. .. 一 ., . 一. 一. ,. . . , . .. ,.. 英文摘要 ? , . , ? . . . ,. , : . . .. 【 .? ? .一 ., ? , . . :; 、 ? . . :一 , / ? // ., / . , . . , /.?. , ????英文摘要 . , ’ . .?,. . . ... .. ?: 一. : . ,, .,. 十 . ?, , . . . . ... . .., . ?.. . ,. .英文摘要? . ,., . . “ , . 一 . . 一 ? . 计 , , , ? . . . . .? . 肛 .州. ? . . . . /. . . .; ./.. 一.: “ .? ?. . ? . ? . . . 英文摘要 ;: ; :. : :;:研究论文 细胞系 枷功能特征及对电刺激的反应 .‰苎, 舌 刖 .细胞是心房肌细胞系,它来源于小鼠心房肿瘤组织【.。 一细胞可进行传代培养,培养过程中可观察到.细胞具有自主收缩 性,并保持与心房肌细胞相似的生物化学特性和电生理学特征。.细 胞具有胚胎期心房肌细胞的超微结构。应用技术研究.细胞 的基因表达【】,其基因表达特征与成年小鼠心房肌细胞基因表达很相近, 包括.肌球蛋白重链、.肌动蛋白、间隙连接蛋白以及心房钠脲肽 因子。采用膜片钳技术,在.细胞上可记录到延迟内向整流钾电流 样的电流【】,电流的激活部分和去活的尾电流部分呈电压依赖性, 是的特异性抑制剂,可明显抑制该电流【】,因此可确定.细胞确实 表达功能性延迟内向整流钾电流。在.细胞上还可记录到与 通道电流相似的电流,但还没有得到确切验证。.细胞系由于其显而 易见的优点可长期传代培养,易获得等,有很多潜在的应用价值。目 前的证据表明.细胞在很多方面都与成年小鼠心房肌细胞的生理生化 特征和电生理特征很相近,但同时也需要更多的实验证据来丰富对。 细胞系的认识,以便更好的利用它。钾通道在心房肌细胞发挥重要 作用,但对于.细胞中是否存在功能性尚不得知。因此,本部 分将针对.细胞的内向整流钾电流进行研究。 在心房肌细胞存在有乙酰胆碱激活的内向整流钾电流,它在心 房肌细胞动作电位复极化过程中发挥重要作用。现已知道,瞄. 和.是构成的分子基础】。在哺乳动物体内, 和主要分布于心房肌细胞和窦房结细胞【’】,对调节心脏兴奋性起 重要作用。心脏中分布着交感神经与迷走神经纤维,迷走神经兴奋释放神 经递质乙酰胆碱,,与心肌细胞膜上的受体结合, 激活相偶联的对敏感的蛋白,从而诱发内向整流钾电流【】。 另外,其他与敏感的/蛋白偶联的的受体如嘌呤受体 以及家族的神经鞘脂类受体也可以激活。在心房肌细胞 动作电位复极化的过程中发挥重要作用。迷走神经张力过高可过度激活研究论天 】,导致房内折 ?通道,使心房的和缩短而离散度增加 返的发生,成为可能的心房颤动的诱发和维持机制。心房颤动与 有 着密切的联系】,现有两种观点,一种认为上调是诱发心房颤动 的原因,另一种观点认为心房颤动会引起上调【引。因此是心 房肌细胞非常重要的钾离子电流。 本研究将验证.细胞是否存在,对此将使用乙酰胆碱及腺 苷诱发,用特异性阻断剂.对诱发的电流进行鉴别,在此 基础上对的其它特征,如去敏化等进行研究。我 的电刺激刺激.细胞小时,比较刺 们还以电压为 频率为 激前后的变化。上述研究结果将为应用细胞系研究心肌细胞 电生理特征打下基础。 材料与方法 材料 .试剂 美国 公司 美国公司 美国 ? 公司 日本公司 乙酰胆碱 腺苷 美国公司 美国公司 】 . , 美国公司 美国 ?, 公司 美国 公司 ?,× ’公司 ? 美国 公司 美国公司 美国公司 美国公司研究论文美国 公司 美国公司 美国公司 .仪器 膜片钳 美国公司 .?超低温冰箱 美国 公司 恒温水浴箱 德国 公司 纯水机 法国公司 微型离心机 公司 .型电极拉制器 美国 公司 ? 美国公司 恒温培养箱 德国,公司 倒置显微镜 日本,公司 .实验细胞系 实验选用.细胞系, 由教授惠赠 ., 方法 一 . .细胞的培养 ..细胞复苏 /复苏前一天预先在培养瓶中加入 ?孵育。第二天倒掉/ ,加入含%的 培养液 ,孵育。在“离心管中加入 培养液 ,。孵育。将冻存的细胞于 含%的 ?水浴约 ,细胞悬液转移到上述准备好的离心管中,×离心 分钟。移去上清,加入 培养液, 含%的 轻轻混悬细胞,加入到已准备好的培养瓶中,小时后换液。 溶液组成:/ :称取. ,用 蒸馏水溶解,高压灭菌, 浓度为.%。稀释 于 .% 溶液中,轻轻混匀,每 分装 于 离心管中,.?贮存。 研究论父,培养液:/: , /, ,】. ? 贮备液:称取 一 蒸馏 和 一溶于 水,无菌滤过分装,.?贮存。 ..细胞传代 待培养瓶中细胞长满后即可进行传代。传代前一天预先在两个培 养瓶 / 中各加入 。孵育,第二天传代前倒掉 / 培养 ,各加入含%的 液 ,置于?培养箱中。传代时首先加入 .%., ?孵育分钟,倒掉胰酶。再加入 .%.,?孵 育分钟,倒置显微镜下观察。镜下观察,细胞蜷缩,用手掌轻拍培 养瓶 的侧壁,致细胞脱落。加入 终止酶的消化。 离心管中。在原培养瓶中加入 含%和 浆细胞悬液转移至 培养液,清洗培养瓶底部,然 .的 后也转移至离心管中。离心机中×离心分钟。移去上清,加入含 培养液 ,轻轻混悬细胞,将细胞悬液 %的 平均分至两个培养瓶中,?培养。 溶液组成: :称取’ ,,溶于 溶液无菌滤过分装,可在?保存一个月。 ..细胞冻存 培养瓶中细胞长满后可进行冻存,每个培养瓶的细胞可冻存在一个冻 存管中。首先在皿离心管中加入 和山,混匀, 待用。消化培养瓶中的细胞,方法同传代一样。将细胞悬液转移至 离心管中,×离心分钟,移去上清。加入已配好的和 的混合液,轻轻混悬细胞,将细胞悬液转移至冻存管中。冻存管放入含有 异丙醇的冻存罐,.。放置小时后转移至液氮罐中。 .细胞在.和六孔板中的培养 将小玻璃片放入六孔板中,每孔放置四片,加入/研究论文 ?孵育,第二天用滴管吸出,加入含%的 培养液 ,置于?培养箱中。把培养瓶中的细胞消化下来, 方法同细胞传代所用的消化方法。把细胞悬液均匀的滴于.培养板 和六孔板中的玻璃片上,?培养箱中培养小时。将.的电线接 . 刺激细胞小时。 于 ,以电压,频率 .电生理实验记录 膜片钳实验记录:电压钳制模式记录细胞膜上内向整流钾电流。 玻璃 微电极拉制并抛光后,灌充电极内液,控制阻值在. 。利用三位操 作器将电极推向细胞,并给予负压吸引细胞膜,使这小块膜与电 极形成高 阻封接,电极内应用两性霉素终浓度. /做穿孔膜片钳记录。 在电压钳制下以. 渐变 为电压,指令电压从. ,记录.细胞中的内向整流钾电流的电流值,同时 至 计算电流值和细胞膜电容的比值得到电流密度值。 作为的激动剂,但是由于对 本试验起初采用“ 受体的特异性不强,除外还可激活偶联蛋白受体等,后者 会抑制通道,因此我们又选用腺苷作为激活 剂。腺苷是常用的激动剂及心律失常等的治疗药物。腺苷可以通 过 与敏感的蛋白偶联的受体激活。 本实验条件下.细胞的钾离子平衡电位通过方程计算等于 .. 。用于比较试验中记录的电流的翻转电位,验证记录的电流是否 是钾电流。 溶液配制:电极内液/: ; ; ; . 。 ; ; ; . 细胞外液/? ; .; ; .; . 。 .; ,应用时加入”?终浓度为 .数据处理 和 电生理实验数据的采用.美国公司 .完成。实验数据用士表示,为平均值,为标准误。 两组数据间的比较用两样本检验和配对检验,.认为有显著性 差异。 以上实验均在室温下进行。研究论文 结 果 .细胞的培养 。 在六孔板培养.细胞.。细胞膜电容为. .细胞的基础内向整流钾电流 用全细胞膜片钳技术记录正常.细胞中的内向整流钾电流。实验 ,然后从一 所用电压钳制程序为持续钳制电压为。 渐变到 .。.为在一细胞,当膜电 时所诱发的电流。我们首先验证记录到的内向电 位从. 流中包含内向整流钾电流。是常用的内向整流钾离子电流的阻断 剂, 可引起内向电流的明显抑制。.是将 由.可见, .中在有和没有的情况下的两条电流曲线相减后所得到的对 的电流成份,可见该电流的电压一电流曲线有明显内向整流电流 特征, 的 记录到的反转电位在. 附近,与公式计算得到的.. 平衡电位相近,说明以上记录到的基础内向电流是内向整流钾电 流。当 及以上时,可见有明显的外向整流特点的电流成 膜电位去极化到. 份.,此电流应为外向整流钾电流,本研究将不对此电流进行进 一步研究。 .细胞的电流 我们首先使用了 乙酰胆碱作为激动剂。.是在 .细胞上记录到乙酰胆碱激活的电流的时程图,所记录的电流是膜电 位为. 时的电流。乙酰胆碱激活的此电流很快达到高峰,随后逐渐 衰减,可被 完全阻断。.所示为使用乙酰胆碱前后,以 及在存在的情况下得的电压.电流关系曲线,.为对敏感的 基础和乙酰胆碱激活的电流电压关系曲线,可见二者均有内向整流特点, 左右,接近钾离子平衡电位。这些结果说明在. 反转电位均在. 细胞存在乙酰胆碱激活的。 腺苷是另外一个常用的激动剂。可以 通过与敏感的蛋白偶联的受体激活。.所示为由 在.细胞诱发的电流。.是在.细胞上记录到腺 时的电流。像 苷激活的电流的时程图,所记录的电流是膜电位为.研究论叉 乙酰胆碱激活的电流一样,腺苷激活的电流也可被“ 阻断。. 所示为使用腺苷前后,以及在存在的情况下得的电压.电流关系 曲 线,.为对敏感的基础和腺苷激活的电流电压关系曲线,可见 腺苷激活的电流有与乙酰胆碱很类似的特点。 我们又观察了腺苷及激活的电流对特异性阻断剂.的 反应。.是目前所知的唯一对有特异性阻断作用的药物。 .为此部分实验结果。腺苷激活的电流可被 .阻断. /,而且被阻断电流的翻转电位在. 左右.,接近 平衡电位相近。 上述结果都说明,在.细胞存在电流。 .细胞电流的去敏 心房肌细胞的主要特点之一是的去敏现象,即在激动剂 乙酰胆碱持续存在的情况下,电流逐渐衰减。我们观察了. 细胞系上的电流是否也有去敏现象。.所示为乙酰胆碱和腺苷 所激活的电流的去敏现象比较。如.所示,给予 乙酰 胆碱后,激活的电流在乙酰胆碱持续存在的情况下逐渐衰减,洗 掉 后,再给予 药物待电流完全消失 乙酰胆碱,所激活电 流的幅度比第一次给予乙酰胆碱小且在乙酰胆碱持续存在的情况下继续 减小。.为第二次给予乙酰胆碱激活的电流幅度相当于第一次给予 乙酰胆碱的百分比。上述结果说明.细胞系的像心房肌细胞一 样有去敏现象。同样的时间间隔给予腺苷,观察到腺苷激活电流没有出现 脱敏现象./。 .细胞的电压依赖性电流和电流 我们在实验中发现在膜电位为. 和. 附近出现两个不同的 明显的内向电流.,.处的内向电流可能是通道开放引 起的电流,因为当在细胞外液中加入终浓度为 通道 附近出现的内向电流可能是 阻断剂,此电流消失.;在. 通道开放引起的电流,因为在细胞外液中加入终浓度为 . 通道阻断剂后,该电流被阻断.。 电刺激对.细胞电流的影响 由研究表明,可能在房颤的发生中起重要作用,的功能改研究论 又 变可能是维持房颤发生的重要因素,而房颤时的快节律兴奋又可 导致 功能的改变。因此我们观察了电刺激对功能的影响。实验采 频率为 的方波刺激. 用. 电刺激器,以电压为 细胞小时,同时与同样培养条件下的.细胞进行比较。采用膜片 钳技术分别记录用乙酰胆碱和腺苷诱发的,然后给予和 .阻断电流,比较刺激前后电流的变化。结果如.和. 所示。结果表明,未刺激和给予刺激的.细胞由乙酰胆碱诱发的 的电流密度分别为.?.和.?./,..; 腺苷诱发的的电流密度分别为..和.?./, ..。这些结果表明在.细胞电刺激可以降低的功能。研究论文 附 图研究论文 ???????????????????????????????????????????????一 ????????? ?乍姗脚一 兽 . ./ ., 如../ 么 ’如’ 跏 麓歹劫二』 .? ‖ 掣 址询确; .. 一一 .一 .. . 十 舶..’. . 研究论文 一 ??????????????????????????????????????????????????????? ?????一 弘 效? 茸? 乒 么 一:’ ? 茎罗葡鼍 薯 : ? 怎. / ’歹确’兰 . . .. , 肛 .?, . “ . 如 . ? .. 研究论文田 苫 寮 曾 枷? 型 ., 侈 棚 扩耵量 冒 ?. .? .‘ ??? ’” /。二, 加 ?订打靠釜 ..一 肛. .十 , .一 ... 一十. 研究论文 ????????????????????????????????????????????一一??? ????????一 蝌迅蚰田 墨工?? 鲁 一 ? 型 嘲 . 一 毒 加. ‰ 却.一柚删斌 一抽’卅 鼍 机 . . . .州 ?, . . . . . 一.‘ ‘ ’,、 ,弋,一 乙印’。 . . 研究论文 一????????????????????????????????????????一 ?一??一 暑 嘲旨墨闺墨冒吕 田 曲。 . 耆 置. 置 昏 葛. 叼 圆. 膏 《 蜀 誊. 昌 . . . .州.晒. 州.宰., . “.研究论文 、,? 兽 .// 叩‘ 一, 加 幽西步删‰: 一 】?。 曾 . / 耐 如二砸一吨蚋鳓’ 细 / : , 。斩印 抓『。岁垆基 /: ? 十 . ? . . ? . ? 一十州 , . .研究论文 ..警 一 葛 姗四 三: 一 ............么 ~一贯一 .一芦 穆 崎 , ?少 一?歹毒 矗”/ ” 耋 ‘量 .. . 痧 山哪 么 气晰 ’妫’旃 耋矿一荸罗珈三 譬 副复孙由? 仅悸旧 一 . . . 一撕. . . 宰.,?研究论文 量 ?? . 卸心匐 警 量 ? 耋。一旷?一 吾 一: 吐一一。 ’力’曲 ‘ 蓑 ,。/巧: 一 .”.;竺又 . ‘耋一’二一 .. .. .. . 粤”: 吉.』 .. .. .. 蚋 椭 培 . .?一 . . . . .,? . . 研究论文 ?.一 . . ? . ?, ? . .? ? .? . 半.,. 研究论文 讨 论 .细胞是心房肌细胞系,它来源于小鼠心房肿瘤组织【矧。 培养基,其它培养 在培养条件上有其独特性,需使用 基则不能满足.细胞的生长需要。.细胞具有自主收缩性并可进行 传代培养,并保持与成年小鼠心房肌细胞相似的生物化学特性和电生理学 特征。.细胞具有以下特点:具有小鼠胚胎期心房肌细胞的超微 结构】。细胞器的重组和肌源纤维生成与发育中的心脏有丝分裂的过 程相似【】。具有与心肌细胞相似的闰盘结构存在。应用 技术研究.细胞的基因表达,其基因表达特征与成年小鼠心房肌细胞 基因表达很相近,包括.肌球蛋白重链、.肌动蛋白、间隙连接蛋白 以及心房钠脲肽因子【】。采用膜片钳技术,在.细胞上记录到延 迟内向整流钾电流样的电流,是的特异性抑制剂,可明显 抑制该电流【】。在.细胞上还可记录到与相似的电流,但还没有 得到确切证实。.细胞保持心肌细胞的分化表型,并可无限传代, 这 些都优于.细胞。由于.细胞具有以上优点,在针对心房肌的功 能调节机制研究方面有重要应用价值。 心房肌细胞内向整流钾电流在心房肌细胞复极化过程中发挥重要作 用,尤其以激活的内向整流钾电流最为重要,并与心房颤动等 心律失常有密切关系。/主要分布于心房、窦房结细胞,以异源四 聚体的形式构成的分子基础。迷走神经兴奋,释放乙酰胆碱,作用 于心肌细胞受体,激活与百日咳毒素敏感的蛋白,使 亚单位 与亚单位分离,从而激活。该电流的功能是促进窦房结细胞和房 室结细胞钾离子外流,引起过度极化,使膜电位与阈电位水平差距加大, 心率减慢。动物实验发现持续刺激迷走神经可诱发持续性房颤。在 诱导的房颤动物模型中可以观察到,左右心房的主导频率随着浓度 增加而增加,而且左心房的频率始终处于主导地位,折返也更多发生在左 心房,同时发现密度以及组成蛋白.和 .水平在左心房明显高于右心房,提示左心房细胞数量 和密度高于右心房,因此左心房细胞对刺激更敏感。有研究发 现房颤患者的密度升高【,也有发现房颤患者电流密度减少,研究 论父 同时伴有. 表达下调】,提示房颤时密度和表 达基因的下调有可能是一种继发性、代偿性的反应,以对抗房颤时心房肌 有效不应期冲的缩短。迷走神经刺激通过的介导可以缩短动 作电位时程和有效不应期,增加心房中折返的发生,同 时由于迷走神经末梢在心房中呈不均匀分布,导致心房内迷走神经刺激所 致的.的激活亦不一致.从而增加了复极的离散度和快速心律失常的 易损性,有利于房颤的发生和维持,因此.可能是引发和维持房颤的 重要因素,故需进一步研究在心房颤动中的作用。 我们的研究首先验证在.细胞上是否存在有乙酰胆碱激活的内向 整流钾电流。我们发现在.细胞上存在内向整流钾电流,且用 州可明显抑制该电流.。.是将.中在有和 没有的情况下的两条电流曲线相减后所得到的对的电流成份, 可见该电流的电压一电流曲线有明显内向整流电流特征,记录到的反转电 的平衡电位相近, 位在. 附近,与公式计算得到的.. 说明以上记录到的基础内向电流是内向整流钾电流。 其次,我们使用了州乙酰胆碱作为激动剂,.是乙 酰胆碱激活的电流,此电流很快达到高峰,随后逐渐衰减,可被 州完全阻断。培所示为使用乙酰胆碱前后,以及在存在的情况 为对敏感乙酰胆碱激活的电流电 下得的电压.电流关系曲线, 压关系曲线,可见明显的内向整流特点,反转电位均在. 左右,接 近钾离子平衡电位。这些结果说明在.细胞存在乙酰胆碱激活的 。腺苷是另外一个常用的激动剂。可 以通过与敏感的蛋白偶联的受体激活慨。.所示为由 在.细胞诱发的电流。.是在.细胞上记录到腺 时的电流。像 苷激活的电流的时程图,所记录的电流是膜电位为. 乙酰胆碱激活的电流一样,腺苷激活的电流也可被州阻断。. 所示为使用腺苷前后,以及在存在的情况下得的电压.电流关系 曲 线,.为对敏感的基础和腺苷激活的电流电压关系曲线,可见 腺苷激活的电流有与乙酰胆碱激活的电流很类似的特点。 我们又观察了腺苷及激活的电流对特异性阻断剂?的 反应。.是目前所知的唯一对有特异性阻断作用的药物。研究论 文 .为此部分实验结果。腺苷激活的电流可被 .阻断. /,而且被阻断电流的翻转电位在. 左右.,接近 平衡电位相近。上述结果都说明,在.细胞存在电流。 乙酰 我们还观察.细胞的去敏作用.。发现 胆碱激活的很快达到最大值,并很快减小。第一次给乙酰胆碱州 后洗掉药物,分钟后第二次给予乙酰胆碱州,电流激活的幅度减 小, 比较两次的电流激活的幅度,经配对检验有统计学意义,说明“乙 酰胆碱引起的去敏作用明显。这可能是由于是非选择性胆 碱受体激动剂,出激活受体外,还可作用于受体,激活蛋白, 进而激活下游的,水解细胞膜上的,使水平下降,从而抑 。以同样的时间间隔给予 制通道的开放,导致去敏【 腺苷,比较两次的电流激活的幅度,经配对检验无统计学意义,“ 腺苷激活的没有去敏现象。 在记录的过程中,发现电流曲线出现两个内向电流,可能是矿电 流 附近出现 和电流,并对此进行验证.。记录过程中在. 一个内向电流.,可能是通道开放引起的电流。可利用 对通道的阻断作用,向细胞外液中加入终浓度为 阻 断该电流,因此可证实此处的内向电流是电流.。在. 附近出现一个内向电流,可能是通道开放引起的电流。在细胞 外液中加入终浓度为州,该处电流可被阻断,因此该处电 流为十电流.。 有文献报道, 电刺激.细胞小时以上,可观察到钙瞬变减 少, 电刺激犬类心房细胞,可使型钙通道电流减小且动作电位时 程缩短【】。因此我们想研究电刺激.细胞后的变化。实验采用 . 电刺激器,以电压 频率 刺激.细胞小 时,同时在另一个六孔板培养.细胞,但不给予刺激,同样条件培养 小时。采用膜片钳技术分别记录电刺激的细胞和未给予电刺激的细胞, 用乙酰胆碱和腺苷诱发,然后给予和.阻断电流。比 较刺激前后电流的变化,结果显示 刺激.细胞小时后由乙 酰胆碱和腺苷诱发的的电流密度要比未给予电刺激的细胞要小,存 在显著性差异..。这可能与细胞在电刺激后离子通道发生电研究论文 重构有关。 .细胞在分子生物学和电生理学特征都与成年小鼠心房肌细胞非 常相近,所以通过研究.细胞的,一方面可以进一步研究. 细胞的电生理特点,增加对.细胞的认识;另一方面.细胞可传 代培养,便于应用于其他的关于心房肌细胞的研究中。 结 论 .细胞存在乙酰胆碱激活的内向整流钾电流,它可被阻断,.是特 异性阻断剂,因 和. 此可用来鉴定.细胞是否存在乙酰胆碱激活的内向整流钾电流。 同心房肌的一样,由乙酰胆碱激活的一细胞的也存在去敏 现象,即在乙酰胆碱持续存在的情况下胁逐渐衰减。电刺激可以 使 .细胞的电流密度减少。 参考文献 ?. ,: . ?? . .。 ,: . :? . ,, . ... .:. ., , 研究论文 , ,: . : .. ,:. , ., , .. .. . , .:. .. ,,:. , ,、,或, ? :. .。,. , ? ,: 一 ,,, .,... ,,:.. ... : : ..,, , , . : / ,.,,:. ., , , . ,,:, , . ?: . .,,研究论文. , ,或, ? :. .。.. , , ,: . . .:. . , , , ? :: . ., , .. ./ ? . ,,:.... .:. 综 述 综述 钾离子通道功能与心房颤动的关系的研究 心房颤动简称房颤,是一种临床常见心律失常疾病,风湿病、冠心 病、 心肌炎以及心衰都可以引发房颤,心脏病患者如果出现房颤,其死亡率比 未发生房颤的患者高至倍,心房颤动已成为严重威胁人类健康的疾病。 它可引起心肌细胞离子通道结构发生改变,表现为心脏动作电位时程 和有效不应期缩短【’。慢性心律失常的病人,其离子通 道发生重构表现为:.型钙离子通道电流密度减小,背景内向整流 钾离子电流】增加【‘。这些心房电生理特性的改变导致心房颤动发 生【】。近年研究者们对房颤时心房肌细胞膜上钾离子通道功能异常及基因 突变进行了深入探讨,为进一步阐明心房颤动的发生机制积累了丰富资 料。 内向整流通道?通道 目前发现的通道有个亚家族飚..,对维持可兴奋组 织细胞的兴奋状态和静息膜电位的稳定,体内神经信号传导、胰岛素释放 及心率、血流调控等方面有着广泛的作用。迄今为止,已发现人类心脏有 种重要的飚通道:经典内向整流十通道,敏感通道及乙酰胆碱激 活通道。 .经典内向整流通道通道 通道为瞄亚家族,在心脏中表达的编码蛋白是.,?., 它们在心肌细胞动作电位中的期复极化和维持期静息膜电位发 挥重要作用,它的激活依赖于细胞膜电位及浓度。当心房肌细胞的 .、.开放时,由细胞内流向细胞外,形成,其占总内向整 流钾电流的%以上,有乙酰胆碱激活的内向整流钾电流占%。 是心房肌复极末期的重要钾离子电流,也被称为背景电流。其内向整 流特性为:当膜去极化时对的通透性增高,反之,复极时对的通透 性减少【】。这一特性维持了平台期各离子流的稳定,并加快末期复极, 抑制.泵,可防止早期后除极和细胞过度超级化。通道电流增强 引起心肌细胞动作电位复极化时间缩短,从而导致心肌有效不应期冲综 述 和动作电位时程缩短,心房肌复极离散度增加,使心房更易产生 多环折返,从而诱发房颤。有学者认为认为通道基因突变,其编 码的飚.通道电流异常增强,导致家族性房颤即正,但是不排除此突 变是家族性房颤的罹患因子或者遗传标志但有学者认为房颤时快速心 房率可引起心房肌细胞离子通道电重构,很快引起电流代偿加大,导 致有效不应期和动作电位时程缩短,从而出现快速心率。房颤发生时 硒.表达升高,的电流密度增加是心房颤动时心房肌细胞电重 构和代偿的结果,即参与形成了“房颤连缀现象。 . 敏感通道通道 通道属鼬亚家族,在心脏表达的编码蛋白是.,其开放或 关闭受心肌代谢活动调节。浓度降低时,可激活敏感通道。但 正常生理情况下,心肌细胞内浓度较高,可使该通道关闭。但当各 种因素导致心肌细胞内浓度减少时,可激活通道,形成敏感 电流,使心肌细胞动作电位平台期缩短,复极化过程提前发生,动作 电位时程和有效不应期明显缩短,引起包括房颤在内的多种心律失常。糖 尿病、高血压、心衰患者发生慢性心律失常的几率较大,一定程度上是因 为这些疾病造成心肌代谢紊乱,能量供给不足,心肌内含量减少, 通道功能异常参与了心房电重构,形成并维持心房颤动?】。 .乙酰胆碱激活通道通道 其编码蛋白?.、?.主要存在于心脏的窦房结、房室结和心房 肌细胞等,在心室肌分布极少。迷走神经兴奋,释放乙酰胆碱与心 脏受体结合后,可激活细胞膜内的蛋白,蛋白的、亚单位 与亚单位分离后结合到./.上并使其激活,产生乙酰胆碱激活 电流。迷走神经张力过高可过度激活,使心房的和缩 短而离散度增加,导致房内折返的发生,成为可能的房颤诱发和维持机制。 在临床电生理治疗中发现肺静脉消融联合肺静脉口迷走神经消融更能有 效预防房颤复发列,提示使用胆碱能受体阻滞剂对迷走神经过度兴奋引起 的房颤应该有效。但基于房颤病因的复杂性,明确哪一个患者为单纯的胆 碱能房颤十分困难。在研究中发现,慢性房颤患者基础内向整流电流 的主要构成除了外,还存在相当数量的,阻滞这些异常的 电流,可成为一种有效的治疗靶点副。对心房颤动的作用。