【doc】 硅酸修饰的抗体微阵列玻片对红细胞的血型抗体吸附能力的研究

【doc】 硅酸修饰的抗体微阵列玻片对红细胞的血型抗体吸附能力的研究 硅酸修饰的抗体微阵列玻片对红细胞的血 型抗体吸附能力的研究 1500 ? 论着? 重庆医学2005年10月第34卷第1O期 硅酸修饰的抗体微阵列玻片对红细胞的血型抗体吸附能力的研究 菅强,蒲晓允,黎儒清’,赵树铭 (1.第三军医大学西南医院输血科,重庆400038;2.第三军医大学临床检验教研室,重庆400038) 摘要:目的探讨用硅酸修饰的微阵列玻璃基片.对红细胞血型抗体的吸附能力.将玻片用硅酸钠溶液处理.经酸 化以形成硅酸,然后用抗红细胞血型抗体(抗一A,抗一B,抗一AB,抗一D)包被,以对应红细胞作反应指示物,以检测经硅酸修饰后的玻 片对红细胞血型抗体的吸附能力,以及血型抗体的免疫活性.结果抗红细胞血型抗体可以牢固的结合在硅酸修饰过的玻片上, 并且可以与其对应的红细胞抗原进行免疫学反应.结论经硅酸修饰的玻片对血型抗体有很高的结合效力,同时抗体仍保持很 高的免疫活性,因而可进一步充当蛋白质抗体微阵列基片. 关键词:蛋白微阵列;硅酸修饰;玻片 中图分类号:R446.112文献标识码:A文章编 号:1671-8348(2005)10—1500—03 Studyonabilityofantibodymicroarrayslidemodifiedbysilicic-acidabsorptiononRBCbloodgroupantibody qing,eta1. JIANQiang,PUXiao—yun:,L,Ru— (1.DepartmentofBloodTransfusion,Southzz,estHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity.Chongqing 400038,China;2.DepartmentofClini~’Laboratry,theThirdMilitaryMedic alUniversity,Chongqing400038,China) Abstract:0bjectiveTostudyontheabilityofantibodymicroarrayglassslidemodifiedbysilicateacidabsorptiononRBC bloodgroupantibody(Anti—A,Anti—B,Anti—AB.Anti—D).MethodsA fterformingathinfilmonthesurfaceofglassslidebydrip— pingsodium—silicatesolution,thefilmwasturnedintosilicic—acidbydrop pingacid.ThenRBCbloodgroupantibodywascoatedthe surfaceoftheglassslidemodified.Finally,theefficiencyoftheantibodyimmobilizingandtheactivityoftheantibodywastested byspecialantigenRBC.ResultsTheRBCbloodgroupantibodycanbestablycoatedonthesurfaceoftheslidemodifiedbysilieie- acid,anditcanbecombinedwithitsspecificantigenRBC.ConclusionTheglassmodifiedwithsilicic—acidhashighefficiencyfor RBCbloodgroupantibodyimmobilizationandthelaterhashighactivity.Ther efore,theglassmodifiedbysilicic—acidcanbeacted asthesupportsubstanceofantibodyproteinmicroarray. Keywords:antibodymicroarray;silieic—acidmodifying;glassslide 蛋白微阵列以其高通量,可平行检测,易于集成,易于自动 化等优点,以及试剂和标本用量少,检测快速,准确度高和 灵敏性好等特点,现已广泛应用于蛋白组学研究,药物研究以 及临床试验诊断..蛋白不同于DNA一般可以扩增.因此对 于样本来源极其有限的蛋白检测,微阵列这一技术显得尤为重 要”.此外,蛋白微阵列的预处理比DNA微阵列更富有挑战 性_5j,这是因为二者生物物理属性的差异,导致了可以结合 DNA的支撑物并不一定适合于蛋白的吸附.阵列上的蛋白 要求以其天然结构固定在支撑物上,以维持其生物功能,但是 蛋白往往以非折叠的方式固定在支撑物上,从而使内部的疏水 副链以疏水键与支撑物表面结合,进而影响了蛋白的生物性 能.目前,微阵列以玻片为蛋白载体较为多见,对玻片进行的 修饰方法主要分两种:一种是在玻片表面包被一层凝胶,如: 聚丙烯酰胺和琼脂糖;另一种方法是用某些功能基团对玻片表 面进行修饰,如:醛基,环氧基团和以多聚赖氮酸为主要代表的 氨基团. 本试验尝试用硅酸钠溶液来处理玻璃,进而在其表面修饰 一 层硅酸,以使之成为抗体微阵列的理想基片. 1与方法 1.1试剂和仪器实验所用A型,B型,()型,Rh阴性抗一D 新鲜血清以及A型,B型,AB型和Rh阳性新鲜红细胞,均来 自于西南医院输血科,而且都已经纸卡式等方法定型;冰乙酸 通讯作者 溶液,0.2mol/INa!SiO.,磷酸盐缓冲液均为自配.所需制剂均 采自重庆北碚化学试剂厂.试剂配制用水为三蒸水.由PAII 产PUREIABCIASSIC机所制;所用玻片均为中国机械进出 口公司上海分公司所产;上海产DHG-9245A型电热恒温鼓风 干燥箱,OIYMPUs摄影显微镜. 1.2方法与步骤将Na!SiO.溶液覆盖在玻璃基片表面,加 酸后反应生成:具有多孔特性的,容易吸附蛋白的HSiO后, 用抗红细胞血型抗体包被,最后用与前者相对应的红细胞作抗 原抗体免疫反应指示物,即:在包被有抗红细胞血型抗体的 HSiO处,如有红细胞存在,则说明H.SiO.可以吸附抗红细 胞血型抗体;相反如果不存在红细胞,则说明HSiO不能吸 附抗红细胞血型抗体.具体步骤如下: 1.2.1玻璃片用清洁液浸泡过夜,经自来水冲洗2次,去离子 水冲洗3次,干净后,干燥备用. 1.2.2选取上述玻片1块并做好点阵标记,在玻片的反面,标 记点的正上方分别加0.2mol/INa:SiO.溶液,使之形成一直 径不大于0.6mm的Na!SiO液滴,放人干燥箱干燥以形成 Na2SiO3薄膜. 1.2.3加入新配制之冰乙酸溶液,并覆盖在涂有硅酸钠薄层 处,24C湿盒内静置约30min,以使Na:sj0在酸作用下生成 H4SiO4. 1.2.4按照去离子水一磷酸盐缓冲液一去离子水的顺序各冲 重庆医学2005年1O月第34卷第10期 洗3,4次后,烘干. 1.2.5分别加入B型,A型,o型,Rh阴性抗一D新鲜血清;阴 性对照1(经硅酸修饰形成硅酸层)不加血清;阴性对照2(未经 硅酸修饰)加生理盐水.然后放入湿盒,4C保存过夜. 1.2.6按照去离子水一磷酸盐缓冲液一去离子水的顺序各冲 洗3,4次后,室温干燥. 1.2.7分别加入可与上述血型抗体发生特异性免疫结合的 1的A型,B型,AB型,Rh阳性新鲜红细胞生理盐水悬液. 静置于室温,覆盖约10min后.缓冲液冲洗,显微镜下观察结 果. 1.2.8反应条件的优化用抗红细胞血型抗体包被经硅酸修 饰好的玻片,放入湿盒,4C保存过夜.然后用对应红细胞分别 在24?室温作用依次5,10min;37?作用依次3,5min(实验中 发现:37?作用10min,RBC很容易干结到玻片上,人为地照成 假阳性,故改为3min),所用磷酸盐缓冲液PB,pH分为5.7, 6.5,7.0,7.5,8.0五个不同的梯度,以上3个水平诸因素间总 共可形成2O种组合,每种组合作4次测试,以优化出最佳反应 条件. 1.2.9结果判定以阴性1与阴性2两处RBC数均值 为基准值.以2倍基准值及其以下为阴性,3,4倍基准值为弱 阳性(显微镜下判读,差别较为明显).以?5×基准值为阳性. 1.2.10统计学处理玻片对抗红细胞血型抗体的吸附力分 析采用!;反应条件的优化采用SPSS12.0中的General IinearModel中之Univariate方法进行比较分析. 2结果 在血型抗体包被的硅酸修饰处.可见大量红细胞.以抗一A 15O1 血型抗体包被为例,其他抗体同此;而在未包被血型抗体的硅 酸修饰的阴性对照处,则见不到红细胞.未经硅酸修饰的另一 阴性对照处同此. 表1不同方法处理的玻片对抗红细胞血型抗体的 吸附力分析 经分析?A法与B法及A法与c法间.均P<0.01,对抗红细 胞血型抗体的吸附能力,差异极其显着;而B法与C法间P>0.05, 差 异不显着. 表2经硅酸修饰的玻片对红细胞血型抗体的吸附能力 经分析,上述4组问相互比较.均P>0.05.表明:经硅酸修饰 的玻片.对不同抗红细胞血型抗体间的吸附能力.差异不显着. 表3多水平多因素多种组合不同条件的优化比较(因变量:RBC) a:R2—0.999(校正后R2—0.998). 砒lc佰 曲 RBC平均值 3讨论 实验证明:(1)经硅酸修饰的玻片和未经硅酸修饰的玻片, 对抗红细胞血型抗体的吸附能力.差异极其显着.而前者对抗 红细胞血型抗体有着很强的吸附能力;(2)经硅酸修饰的玻片. 对不同抗红细胞血型抗体问的吸附能力.差异不显着;(3)包被 在经硅酸钠修饰好的玻片上的抗红细胞血型抗体,在与其对应 红细胞抗原发生反应时.不同的酸碱度,温度以及反应时间对 抗原抗体的特异性结合.确实有着极其重要的影响作用.最佳 的反应条件应为:24C作用5min.并用pH8.0的PB作缓冲 液. 吸附在经过硅酸修饰后的玻片上的抗红细胞血型抗体.仍 能与其对应红细胞抗原进行有效结合.说明血型抗体仍保持很 高的免疫活性. 1502 经硅酸修饰后的玻片有足够多的红细胞吸附在上面.表 明:已包被的血型抗体主要以Fc端固定在硅酸修饰的玻片上, 而可与其对应的抗原发生特异性免疫反应的Fab端.则朝向外 面,并因与玻璃基片有一定的空间间隔,而减少了空间阻力,有 足够的有效空间可与红细胞进行结合.进一步提高了抗体与其 对应抗原物质的结合效率和效力. 文献表明.可用作微阵列支持物的,按其材质町分为两类: 一 类是以尼龙膜为典型的膜类材质,包括醋酸纤维膜,硝酸纤 维膜等.,另一类是以玻璃基片为代表的硬质材料.包含金 属,陶瓷,硅片等”“.由于尼龙膜等膜与蛋白有较强的结合 能力.因此可无需特殊处理.可直接使用.步骤简单,但不可忽 视的是:膜的高扩散性和高渗透性使得膜作为微阵列的基片选 材.在提高点阵密度方面受到很大的限制.同时背景的高污染 也是个巨大的障碍;玻片的疏水性使它在作为微阵列基片时, 必须事前经过特殊处理,这是其不便的地方.但经过修饰后的 玻片由于克服了膜的高扩散性和高渗透性等缺点,使得背景得 到极大净化,从而提高了信噪比,同时点阵的密集度也大为提 高,点间距可达0.4mm以下. 本课研发的献血筛查微阵列,采用玻璃作为固相支持 物.玻片是一种疏水性很强的材质,作为微阵列的基片,其表 面的化学处理非常重要.因为它直接影响到样品与基片的结合 效力以及更进一步的检测与鉴定的准确度和灵敏度. 本研究采用硅酸钠对玻片进行处理,即先用Na!SiO溶液 (俗称水玻璃)包被玻片,再以酸覆盖并与之反应生成具有多孔 特性的,较强物理吸附能力的,白色胶乳状物Hsi0沉淀在 玻璃基片上,而Hsi0化学性质不稳定,很容易脱水进而部 分的形成H:Si0,而后者所具有的,带负电荷的硅酸基(一SiO一 2)有着较强的化学吸附能力,可有效吸附水中的重金属,有机 物及细菌等微生物.上述两种硅酸可很好地与血型抗体结合. 实验结果表明:经过硅酸化处理的玻璃基片埘七述血型抗体有 较强的结合力,可较为牢固地结合在经硅酸纳处理的玻片一t2, 可以作为抗体蛋白质微阵列所需固相支撑物.本方法与上述 诸种对玻璃基片的修饰方法相比,具有较为简便的操作流程 工艺,同时具有潜在的价格及成本优势,尤其对探针集成度要 求不是特别高的,普通蛋白检测微阵列而言,成本优势更明显. 参考文献: [1]张克勤,靳凤烁.高琳.1】例人膀胱移千于细胞癌基因表达 谱变化的临床分析[J].重庆医学,2005,34(3):412 [2]刘同华,杨长英.基因芯片技术及其在肿瘤研究中的应用 [J].重庆医学,2003,32(9):1266 重庆医学2005年1O月第34卷第1O期 [3]LeeYS.MrksichM.Proteinchips:fromconceptsto practice[J].TrendsBiotechnol,2002,20:S14 [4]WilsonDS.NockF.Recentdevelopmentsinproteinmi— croarraytechnology,Angew[J].ChemIntEdEngl, 2003,42:494 E53ZhuH,SnyderM.Proteinchiptechnology[J].CurrOpin Cheml3io1.2003,7:55 [6]KusnezowW.HoheiselJD.Solidsupportsformicroarray immunoassay[J].JMolRecognit,2003,16:165 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