免疫组化

免疫组化 申通单号:368453524959 免疫组化方法中关键环节及其原理概述 一、酶免疫组化的关键环节 1、标本固定:固定的目的是?防止标本从玻片上脱落;?除去防碍抗原-抗体联合的类脂，使抗原抗体联合物便于获患上良好的染色结果;?固定的标本便于生存。 二、脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇(由低到高)充实脱水、对于组织要纯粹浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。 3、脱蜡和水化:这是为了后面的抗体等试药可以容或充实与组织中抗原等联合反映。脱蜡可以先60度20min，之后当即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反映和浸洗不全，而产生非特异性违景着色。 4、抗原修复:由于组织中部门抗原在甲醛或多聚甲醛固定历程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掉去抗原性;通过抗原修复，使患上细胞内抗原决议族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料，大量的:中性的、高pH的等)。我们测试室一般用微波修复中火6min*4次，效验正确。注意微波修复后天然冷却30min摆布(只要你觉患上修复液的温度达室温便可)。 5、细胞通透:目的是使抗体可以容或充实地步入胞内进行联合反映。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质步入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为保举使用，如许抗体就能顺利步入胞内与响应抗原联合。在免疫组织化学(10um厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。 六、灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反映结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min摆布，而0。3%过氧化氢则可以适当延伸封闭时间，一般10~30min;用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能幸亏掩护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片;现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已经有"第二代即用型免疫组化试药盒"制止内源性生物素的干扰，保举使用。 7、血清封闭:组织切片上富余的位点可以与一抗非特异性联合，造成后续结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反映的位点发生联合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及与一抗来源相符。一般室温或37度10-30min。 8、一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反映中最重要，包孕孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度，此中4度效验最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要探索。二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要探索，而浓度一般有工作液，如果是浓缩液还要探索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，之后去探索一抗浓度和孵育时间。 九、抗体稀释液:实在许多测试室抗体稀释液就用一般PBS便可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠双氧水、BSA稳定剂等组份，匹敌体的多次回收利用较好。正因为这种缘故原由，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在改换新抗体稀释液时测试结果出现了阴性结果(提示可能一抗没有联合)，最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等缘故原由排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反映不佳，终而出现假阴性结果。 10、切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗):为了防止一抗、二抗等试药残留而引起非特异性染色，以是适当地增强清洗(延伸时间和增多次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。 注意:(1)独自冲洗，防止交叉反映造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗体式格局;(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去联合的物质。?PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果违景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分化;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分化) 11、DAB显色:违景的深浅和特异性染色的深浅都可以由DAB孵育条件决议。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时便可冲洗;DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这极可能申明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;此外，若很短时间就出现违景很深，还有可能你前边的封闭非特异性蛋白不全，需要延伸封闭时间;DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能申明你的抗体浓度太低或孵育时间太短(最佳一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。 1二、复染:目的是形成细胞轮廓，从而更好地对于目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染(胞核染布材料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以调停的。即:染色深则分化时间稍长些便可;染色浅则再置于苏木素中染色便可。 盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用差别。片子复染完后流水振洗，之后置于盐酸酒精中数秒(肯定是动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰便可。 13、封片:为了长期生存，我们一般用中性树脂等封片，制止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，之后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对于面的阿谁拐角，接近封片液近真个拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，如许一般不会产生气泡。 二、免疫荧光方法中的重要环节 1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织肯定是要冷冻程度适当等，防止裂片和脱片严重。 二、组织切片固定:切好片风干后当即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间生存的白片，肯定是要实时固定和适当生存。 3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的联合，需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源相符)封闭，减弱违景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4、一抗孵育条件:在免疫组化反映中最重要，包孕孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度，此中4度效验最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要探索。 5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要探索，而浓度一般有工作液，如果是浓缩液还要探索浓度，牢牢记住要避光反映。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，之后去探索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着生存时间的延伸，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配合制造时小包装和共进行适当的离心。 六、复染:目的是形成细胞轮廓，从而更好地对于目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。 7、封片:为了长期生存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。制止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，之后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对于面的阿谁拐角，接近封片液近真个拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，如许一般不会产生气泡。 8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试药残留而引起非特异性染色，以是适当地增强清洗(延伸时间和增多次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意(1)独自冲洗，防止交叉反映造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗体式格局;(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去联合的物质。?PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果违景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分化;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分化) 九、照相:有条件的话最佳当即照相，若不克不及实时照相，也要封好片和用指甲油封固，连结避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格根据荧光显微镜出厂仿单要求进行操作，不要随心改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对于秋水的损害，在调整光源时应戴上防备保护眼镜;检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯闪光强度逐渐降落，荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后，荧光也较着减弱或褪色;引闪光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象;以是最多不患上超过2~3h;荧光显微镜光源生存的年限有限，标本应集中检查，以节流时间，掩护光源。天热时，应加风扇散热降温，新换灯泡应从起头就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充实冷却后才能点燃。一天中应制止数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后当即不雅察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4?生存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无较着的自觉荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油;电源最佳装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的生存的年限，也会影响镜检的效验。