抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响

抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响 抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀 伤细胞的影响 第l5卷第1期 2005年2月 江苏大学(医学版) JournalofJiangsuUniversity(Medicine) Vo1.15No.1 Feb.2o05 抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响 蒲骁麟,束永前,张锦英 (南京医科大学第一附属医院中法肿瘤生物治疗中心.南京210029) [摘要]目的:研究树突细胞(DC)负载不同形式的抗原对其成熟和功能的影响,及DC对细胞因子诱导的杀伤细 胞(CIK)增殖和功能的影响.方法:外周血单个核细胞(PBMC)经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,将Bel 7402细胞制备成肿瘤细胞冻融物,坏死肿瘤细胞及正常生长的肿瘤细胞,并作为不同状态的肿瘤抗原刺激DC,以流 式细胞仪检测DC表面分子的表达.应用MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激的CIK对肿瘤细胞的杀伤力.结果: 负载肿瘤细胞冻融物的DC其表面CD1a,CD80,CD83,HIJA.DR高表达,促进CIK增殖和杀伤力的功能最强;与正常肿 瘤细胞共培养的DC细胞成熟程度受到抑制;负载Bel7402抗原的DC刺激的CIK对Bel7402有较强杀伤力,而对 HerpG2杀伤力弱.结论:肿瘤细胞冻融物预刺激的DC成熟程度最高,诱导抗原特异性CIK细胞的功能最强,为临床 DC瘤苗和CIK的应用提供了实验依据. [关键词]树突细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK);肿瘤抗原 [中图分类号]R392.12[文献标识码]A[文章编号]1671—7783(2005)0l一0006—04 TheEffectofDendriticCellsPulsedwithAntigenson CytokinesInducedKillerCells PUXiao?lin,SHUy0ng?qian,ZHANGfin—ying (China— FranceCancerBiotherapyCenter.No.1AffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity.Nanjing210029.China) [Abstract]0bjective:Toresearchtheeffectofburdeningdifferentantigensonthematurationandfunc— tionofdendriticcells,andtheeffectofDCsoncytokinesinducedkillers'(CIKs)proliferationsandfuBe— tions.Methods:Humanperipheralbloodmonocyte(PBMC)wereculturedintoDCsandCIKswithdiffe卜 entcytokines.ThetumorcelllineBel7402preparedintocarcinomacelllysates,necrotictumorcellsand normallygrewtumorcellswereburdenedonDCsasdifferenttumorantigensandtheDCswereusedtostim— ulateCIKs.ThroughtheanalysisofDCs'surfacemoleculesthedetectionoftheproliferationandanti—tumor functionofCIKsactivatedbyDCs,weresearchedtheinfluenceofdifferentantigensonDCs'maturationand function.Results:DCspulsedwithcarcinomacelllysateshadthestrongestpowerofpromotingtheprolifer— ationandanti— tumorfunctionofCIKsandhadthehighestexpressedsurfacemoleculesasCD1a,CD80, CD83,HLA—DR;whiletheDCsCO— culturedwithnormallygrewtumorcellshadthelowestmaturationdegree andfunctionofstimulatingCIKs;CIKsstimulatedbyDCsburdeningonBel7402antigenshadrelatively stronganti—tuvf~orpowerOnBel7402whiletherewasweakpoweronHerpG2.Conclusion:DCspulsed with carcinomacelllysateshadthehighestmaturationdegreeandthestrongestpowerofinducing CIKs,andit providedanexperimentalbasisfortheclinicaluseofCIKs. [Keywords]Dendriticcells;Cytokinesinducedkillers:Tumorantigen 树突状细胞(dendriticcell,DC),是体内惟一能 激活幼稚T细胞(na'fveTcel1)的抗原递呈细胞,其 抗原处理,递呈功能较其他专职抗原递呈细胞强10 , 100倍….在DC细胞的体外培养中,对抗原的 负载既是DC成熟的必要条件,又是其递呈抗原的 前提.DC负载肿瘤抗原的形式较多,包括肿瘤相关 [基金项目]江苏省卫生厅医学科技发展基金重大课题资助(H200211) [作者简介]蒲骁麟(1974一).男.硕士研究生.束永前(联系人).硕士生导师,主任医师.shuyq@medmail,con.cn 第1期蒲骁麟,等.抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响7 抗原,全肿瘤抗原,肿瘤RNA,DNA,DC一肿瘤融合 细胞等.DC对不同形式抗原的递呈能力不同,本研 究就肿瘤细胞冻融物,坏死肿瘤细胞及正常生长的 肿瘤细胞为抗原刺激DC,比较不同形式的肿瘤抗原 对DC的刺激效果.细胞因子诱导的杀伤细胞(cy— tokine.inducedkiller,CIK)是目前对体内肿瘤细胞 产生非MHC限制性杀伤活性最强的过继免疫杀伤 细胞之一,主要由CD3CD8和CD3CD56两个 细胞亚群组成,其抑瘤效果远高于淋巴因子激活的 杀伤细胞(1ymphokinesactivatedkiller,LAK)L2,3j. 本实验将抗原预刺激DC细胞与CIK细胞共培养, 产生具有抗原特异性杀伤功能的CIK细胞,并对其 杀伤效果进行比较. 1材料和方法 1.1材料 rhlL-2,rhlL-4,GM—CSF均购于美国PEPRO TECH公司;CD3mAb,鼠抗人PE-CD1a,PE.CD80, FITC.CD83,FITC.HLA.DR购于美国BDBioscience 公司;淋巴细胞分离液(Ficoll-泛影葡胺为上海生化 试剂二厂产品;IFN-r,TNF-Or.购于美国StemCell Technologies公司;培养基AIM-V,DMEM,胎牛血清 (FCS)购于美国Gibco公司;四氮唑盐(M1Tr),二甲 基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司;肿瘤细胞系 Bel7402,HerpG2购于上海细胞研究所;流式细胞仪 为美国Coulter公司产品;6孔,96孔细胞培养板购 于德国GreinerBio.one公司;CO,孵箱为美国The- moform公司产品;恒温离心机为德国Sorval1.Legend 公司产品;生物操净台为美国Baker公司产品. 1.2方法 1.2.1DC细胞的诱导成熟及表型分析取正常志 愿者外周血100ml,加入抗凝剂后置于Ficoll-泛影 葡胺分离剂上,2000r/min离心20min,取低密度 (云雾层)细胞,用PBS洗2遍,AIM-V洗1遍.以 AIM.V重悬细胞为5×10./ml,加入6孔培养板中 (每孔3m1),于5%CO,37%孵箱内培养2h.再轻 轻洗出悬浮细胞,加入含GM.CSF800U/ml,IL-4 50ng/ml的AIM.V每孔3ml,置5%CO,,37.【=孵箱 内培养,每3d半量换液一次.培养的第6d将DC 分为4组,分别加入肿瘤细胞Bel7402的不同处理 方式的抗原,包括肿瘤细胞冻融物,坏死的肿瘤细 胞,和正常生长的肿瘤细胞,同时设未加入肿瘤抗原 的DC为空白对照(分别记为ly—DC,Be.DC,no- DC,CO-DC),继续培养.第7d在DC中加入TNF-Or. 1000U/ml.第9d收集各组DC细胞.从每组DC 细胞中各取2X10个细胞做直接荧光染色,以流式 细胞仪分析细胞表型CD1a,CD80,CD83,HLA—DR. 1.2.2CIK细胞的制备及激活将非黏附细胞以 AIM-V重悬为2X10./ml,加入IFN-r(1000U/m1), 于5%CO,,37?孵箱内培养24h,然后加入CD3mab (25ng/m1),IL-2(1000U/m1),再继续于5%CO2, 370(2孵箱内培养,每3d细胞计数并半量加液.第9 d收集经不同抗原作用的DC,加入CIK中(DC:CIK :1:20)共培养(分别记为ly-DC—CIK,Be-DC—CIK, no.DC.CIK,CO.DC.CIK),并设未与DC共培养的一 组CIK为空白对照(记为CO-CIK).共培养3d后收 集CIK细胞并计数. 1.2.3肿瘤细胞冻融物的制备消化,收集对数生 长期的Bel7402细胞,离心洗涤,再用PBS重悬为4 ×10/ml,封装入冻存管.置液氮内冷冻10min,取 出立即放入37qC水浴10min,重复3次.再经 10000r/min离心30min,取上清.一20?保存备 用. 1.2.4坏死肿瘤细胞的制备将正常生长的Bel 7402置于无菌蒸馏水中1h,显微镜下见细胞崩解, 坏死后离心洗涤,作为坏死抗原. 1.2.5CIK细胞对Bel7402的细胞毒作用将各 组CIK细胞重悬为5X10/ml,置于96孔平底板, 每孔100l,将Bel7402细胞重悬为1X10/ml,5 ×10/ml,2.5X10/ml,各取501分别加于各组 CIK细胞中,使效靶比为10:1,20:1,40:1,各浓度设 3个复孔,并设未与肿瘤细胞反应的各组CIK为效 应细胞空白对照,未与CIK反应的各浓度肿瘤细胞 为靶细胞的空白对照.培养12h后,每孔加入MTT 溶液(5g/L)20p.1;再培养4h,吸弃上清,每孔加入 DMSO100txl,于570nm处测A值,计算杀伤率. 杀伤率100% 依同样方法按效靶比为40:1测量各组CIK对 HerpG2细胞的杀伤作用. 1.3统计方法 利用SPSS10.0作分析,进行多样本均数比较. 2结果 2.1DC细胞形态学的观察 培养第一天的DC细胞均贴壁生长,胞体小,仅 见极少数胞体较大,有短突起,呈短梭形的细胞.培 养4,5d后,大细胞增多,突起增多,增粗.加入冻 8江苏大学(医学版)第l5卷 融抗原后,DC细胞普遍增大,出现较多指状突起,且 细胞呈多角不规则形或梭形,第8,9d时,细胞已大 部呈半悬浮生长.而未加入抗原或加入坏死,正常 生长的肿瘤细胞的DC上述形态学变化不明显. 2.2DC细胞表型变化. 经抗原刺激的DC细胞,其表面CD1a,CD80, CD83,HLA.DR的表达均有不同程度的升高(表1), 其中以负载肿瘤细胞冻融物的DC(1y-DC)表面分子 表达最高,与其他各组DC相比,差异有统计学意义 (P<0.01).负载坏死肿瘤细胞的DC(ne-DC)与未 经抗原刺激的DC(CO-DC)的上述指标相似(P> 0.05),均低于ly.DC.与正常肿瘤细胞共培养的 DC(no.DC)上述标志物水平最低. 2.3DC对CIK的促增殖作用 表1DC细胞表面分子的表达%,?s ly—DC与ne—DC,coDC和no—DC相比,{:P<O01;ne—DC,co—DC与BO-DC相比,#:P<O.01 在DC细胞与CIK细胞共培养前,CIK细胞增2.4CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 殖较慢,每3d增加l一2倍,第9d加入DC后,ly-同一组CIK中,随效靶比的增加,对Bel7402 DC.CIK增殖速度加快,3d增加3,6倍,其余各组肿瘤细胞的杀伤作用增强,效靶比40:1时杀伤作用 CIK增殖速度无明显变化(图1).明显高于10:1(P<0.01).但经不同DC作用的 CIK细胞其杀伤能力不同,在同一效靶比下,ly-DC- CIK的杀伤作用强于其他CIK(P<0.01),其余各 组CIK的杀伤作用相似(P>0.05)(表2). 各组CIK对HerpG2细胞的杀伤作用与相同效 靶比的CO.DC-CIK对Bel7402的杀伤作用相似(P >0.05),低于ly.DC.CIK对Bel7402的杀伤作用 图1CIK细胞增殖曲线(P<0.01). 表2CIK对靶细胞的杀伤活性%,x?s 相同效靶比下,ly—DC—CIK与其他各组CIK相比,{:P<0.01;效靶比为40:1与10:1,20:1相比.#:P<0.05 3讨论 DC是体内功能最强的抗原递呈细胞,在肿瘤特 异性免疫应答中具有重要作用.体外培养DC关键 一 步即选择何种形式的抗原来刺激DC.目前见诸 实验的负载抗原有:?已知肿瘤相关抗原,如黑色 素瘤相关抗原(melanolTla-associatedantigen,MAGE), tyrosinase,前列腺特异抗原PSA等.将人工合成的 上述肿瘤相关抗原肽在体外致敏DC,可诱导相应的 特异免疫应答.但其缺点也明显:负载在DC表 面的肿瘤抗原肽存在时间短,肿瘤基因变异快, 针对单一肿瘤抗原的治疗在肿瘤基因变异后会失 效.?肿瘤抗原编码基因或mRNA转染DC,及肿 瘤一DC融合细胞等,因技术复杂,不易推广.?全 肿瘤抗原,如肿瘤细胞冻融物,凋亡,坏死肿瘤细胞. 全肿瘤抗原含有多种肿瘤抗原刺激DC,可诱导多种 抗原决定的细胞毒性T淋巴细胞(eytotoxieTlym. phoeyte,CTL),无须提取和纯化肿瘤抗原.肿瘤细 胞冻融裂解物富含HSP(包括HSP70和gp96),而未 成熟DC表达CD91,是gp96和HSP70的受体,二者 结合可促进DC成熟,因而采用肿瘤细胞冻融裂解 物可以有效地促进DC成熟.本研究比较了肿 第1期蒲骁麟,等.抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响9 瘤细胞冻融物,坏死的肿瘤细胞,及正常生长的肿瘤 细胞刺激DC的效率.结果表明,负载肿瘤冻融物 的DC成熟程度最高,其表面标志成熟的黏附分子 CD1a,共刺激分子CD80,HLA—DR及DC成熟的特 异性标志物CD83均明显高表达,且该DC对CIK细 胞的促进增殖和促进特异性杀伤作用最明显;其次 为负载坏死肿瘤细胞的DC,而与正常生长的肿瘤细 胞共培养的DC,其成熟受抑,可能与肿瘤细胞分泌 的抑制因子有关.由此表明,DC能从肿瘤细胞冻融 物中摄取相应的肿瘤抗原,并将抗原特异性信号递 呈给CIK细胞,刺激CIK细胞的增殖和功能的活 化,但不能从正常生长的肿瘤细胞摄取肿瘤抗原. 人类PBMC经CD3单克隆抗体,白细胞介素2 (interleukin一2,IL-2),一干扰素(Interferon一,IFN一 )的共同作用,可产生大量CIK细胞,由CD3 CD8和CD3CD56两个细胞亚群组成.CIK细胞 中CD3CD56双阳性细胞增殖最快,细胞毒活性 最强.由于其同时表达T淋巴细胞的标志CD3分 子和自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK)的标志 CD56分子,因此CD3CD56双阳性细胞又被称为 NK细胞样T淋巴细胞(naturalkillerTceils,NKT), 兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的 非MHC限制性杀瘤优点.CIK细胞在体内外有 更高增殖能力和杀瘤活性,并且具有杀瘤谱广,对多 重耐药肿瘤细胞同样敏感的特点,是目前发现的杀 伤肿瘤细胞活性强,适合临床应用的一种理想效应 细胞.利用成熟DC的抗原呈递功能和其表面 高表达的共刺激分子,将负载抗原的DC细胞与 CIK共同孵育,通过DC提供的第一,第二信号,及 其分泌的多种细胞因子可促进CIK的增殖和活化, 增强其抗肿瘤活性川?.本实验结果表明,经负载 肿瘤抗原的DC刺激后的CIK对同种肿瘤有很强的 杀伤作用,强于单纯CIK;但是此CIK对其他的肿瘤 细胞杀伤作用很弱,与单纯CIK相似,表明这种杀 伤作用是抗原特异性的. 本实验结果表明,体外培养的PBMC来源的DC 在负载肿瘤细胞冻融抗原后,其成熟程度及刺激 CIK的功能都明显升高,经该DC作用的CIK的抗 瘤活性明显增强,为临床DC瘤苗和CIK细胞的应 用提供了实验依据. 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