DNS比色法测定还原糖及总糖 实验报告

DNS比色法测还原糖标准曲线绘制及测定Tr21培养液中初始和最终还原糖及总糖含量实验报告 1. 研究背景 木霉菌在发酵过程中，利用碳源导致发酵液中糖含量的变化，其中还原糖是一个主要的反映参数。还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）在碱性条件下生成棕红色物质（3-氨基-5-硝基水杨酸），在一定范围内，棕红色物质颜色深浅的程度与还原糖的含量呈一定的比例关系。糖含量的不同变化一定程度上体现着Tr21不同的生长阶段，从而为控制及优化发酵过程提供科学依据。 2. 实验目的 3，5-二硝基水杨酸比色法测定Tr21发酵液中还原糖含量，利用糖含量这个参数，控制发酵过程。 3. 实验原理 在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 黄色                    桔红色 4. 实验材料 发酵液（5天）：Tr121（A2） 实验材料：3，5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，葡萄糖，蒸馏水 实验器材：可见分光光度计，电子天平，真空干燥箱，数显恒温水浴锅，离心机，移液器，枪头，500ML容量瓶，试管，500 ml 烧杯，1000ml量筒 5. 实验方法 5.1试剂配制 （1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。 （2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。 （3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 （4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。 （5）0.1% 酚酞指示剂。　 （6）6 mol/L HCl溶液 5.2 、葡萄糖标准曲线制作 取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 葡萄糖含量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。 λ=540nm处测定吸光度 0 0.077 0.2 0.319 0.424 0.543 0.655 0.761 0.856                     以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，如图一： 5.3 .1 培养液中初始总糖与还原糖的测定 准确量取5ml培养液，定容至50 ml，作为还原糖测定样品液。 准确量取1ml发酵液并加蒸馏水定容至10ml放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml，用于总糖测定。 试剂 空白 还原糖 总糖 样品溶液(ml) 0 1.0 1.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.0 1.0 水杨酸(ml) 1.50 1.50 1.50 将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。 λ=540nm处测定吸光度 0 0.311 0.228 样品溶液中还原糖和总糖 0 0.594 0.44         5.3.2 发酵液中最终总糖与还原糖的测定 发酵液2500rpm离心20min，取5 ml，作为还原糖测定样品液。 准确量取5ml发酵液悬液放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 5ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到50ml，用于总糖测定。 试剂 空白 还原糖 总糖 样品溶液(ml) 0 1.0 1.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.0 1.0 水杨酸(ml) 1.50 1.50 1.50 将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。 λ=540nm处测定吸光度 0 0.15 0.014 样品溶液中还原糖和总糖 0 0.299 0.05         测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。 6. 结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的浓度： 还原糖浓度（g/ml）= m /V*稀释倍数/1000 总糖浓度（g/ml）= m /V*稀释倍数*0.9/1000 式中：m──反应液中还原糖或总糖的质量：mg； V──反应液的体积：ml； 1000──mg换算成g的系数。 得： 初始培养液中： 还原糖浓度（g/ml）=0.594/1*10/1000 =5.94/1000 总糖浓度（g/ml）=0.44/1*50*0.9/1000 =19.8/1000 最终培养液中： 还原糖浓度（g/ml）=0.299/1*1/1000 =0.299/1000 总糖浓度（g/ml）=0.05/1*10*0.9/1000 =0.45/1000 图一：