【doc】 弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制

【doc】 弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制 弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制 巾闻寄牛虫学寄,虫病杂志2005年12月第23卷6期chinaJParasit0IParasitDisDec.2005,Vo1.23,NI1.6?449. 史章编号:l000—7423(2005)一06—0449—04【实验报道】 弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制 蒋守富,张述义,曹琳,潘彩娥,魏梅雄 【摘要1目的研制敏感,特肄的检测弓形虫lgM和lgG抗体免疫印迹试剂盒.方法收集人T感染RH株弓形虫 速殖_f昆【IJj系小鼠的腹腔液,提取j形虫}}色!质蛋白,采fH二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离弓形虫可 溶性抗原,许经电泳转印至硝酸纤维膜,以无毒敏的叫【}l基联苯胺(TMB)为底物分别俭测30份弓肜虫lgM干?28份lgG 性『f1【清.40份健人m清通过比较抗原制备方法和使川剂f}{=,封闭剂,洗涤和稀释剂,T作浓度,作IN,,/问以及反应 带jf{观.选择最佳聆条什,以敏感性,特异性,You(1en指数以及稳定性作为试剂盒评价结果_【_}j免疫印迹试 剂盒俭30份弓形虫lgM和28份lg(m性血清,敏感性分别为90.0%(27/30)和85.7%(24/28),40份健嚎对照者咀清 的弓形虫lgM和lgG抗体均为,特异性均为100%,Youden指数分刖为0.9和0.86.试剂盒_『4cc保存约6个川的检 测结一致结论发铯疫印迹试卉lj盒敏感性和特异性均较高,且操作 简便,快速 【关键词】肜虫;免疫印迹;试剂盒;敏感性;特异性 r{1Ig1分类lj:113825 DevelopmentofImmunoblotKitfortheDetection ofAnti-ToxoplasmaAntibodies JIANGSI1I)u—fu,ZHANGShu—yi,CAOLin,PANCai—e,WEIMei—xi ong (ShanghaiMunicipalCenterfo,DiseaseControlandPrevention,ShanghaiCenter ,o,ToxoplasmosisDetection,Shanghai200336,China) 【Abstract】 0bjectiveTo(1?I?l(„I1adiagn()sti(?kitfnrthelleteeti,mofanti—lbxopht~maa ntilm(1iesinhuum~lsera 1)yiIllllmnoHottel?hnique.Methodsl,l1(cytoplasmproteins(1fToxopla~m.gondiiwereextra(tedfronlel41e(„tPdas(,ites inKulnningstrainuli(„Pill[i1?tedl1tat?llzoites()f.7br),J(“gondii(RHstrai~1).Toxopltt~magondiisohl1)leantigens,~Pn separatedl?SI)S—lA(;Icele(tr(1pho~(SISall(1transle~Te(1tofl,roxylinUleln1)rau(.[!singnonpois~)nonstetramethyllJPnznP (TMB)ashorsel?a(1ishperoxi(1ast—SllbStl?ate?rimnluno1)l()t.theoptimalexpe~imentaleunditionswPIsele(„tellthr1)ngh („()nl1)aris(1nofantigenepal?atim1.1?eag(ntsfi)rIAo(king()rwashing,dihlti,)nc(nleentratiou,real:tiontime,and freltUenl?iesofrea(ringlland.Sen;it3.spelifildty.~[oudenindexandsta1)ilityWereevaluatedastilestandardforthe kit.ResultsIn30Prawithanti一7bxoplasmafgMarltitlodiesanti28? ithlgGantibodies.thesensitivibfilrlgM anllIg(;antiblldydetel?ti(1nwas90.()(27/30)and85.7%(24/28)respeeti~eb?,thespeeifil:itywasall100Cl(inexamining 40heahhyeontrolsera.andthe,()lahtlinllexwas0.9anll0.86respe(„tivel}.Thekitwasstableat4~Cfi)r6m(1nths. ConclusionTheiI1llnlm1)bhltkitsh()nalleasyoperation.fast|.eaetionantil?elia1)leresult.andmaybepra(„til?a1. 【Keywords】Toxoplasmagondii:lmmunoblot:Kit:Sensitivity;Specificity 弓形虫寄牛于有核细胞内人体感染弓形虫后大 多呈带虫状态而不发病,当机体免疫功能受损或低下 时会出现弓形虫性脑炎等严重病状,孕妇可导致流 产,或i~1fiIL致畸.I大l此,对于弓形虫感染早期诊断 和治疗十分重要.目前,主要依据实验室检测感染者 血清中的抗弓形虫抗体(IgG,IgM)进行诊断--,我 同现有的弓形虫病诊断试剂盒检测方法不够稳定,敏 感性和特异性仍不理想.本文应州免疫印迹技术 作者单位:J海I{疾病预防控制叶1心.上海lfr,j形虫病检测巾心 f?海200336 (ELIB),将四甲基联苯胺(TMB)作为底物,优化实 验条件,研制出用于检测弓肜虫IgM和IgG抗体的免 疫印迹试剂盒. 材料与方法 1血清 人体抗弓形虫标准叭清.南WHO国际生物标准 化实验室提供(500IU/ml,批号:001031)弓形虫 病患者血清购自丹麦国立血清学研究所.测试前用2 种进口弓形虫诊断试剂盒(意大利Diesse公司和美 .450.It?1日寄虫学奇叶虫痫杂忠2005年I2月第23卷第6期ChinaJParasitolParasitDisDec.2005,V(I.23,No?6 同Sorin公司)筛选tt130份弓形虫IgM和28份lgG 抗体阳性ml_清.感染弓彤虫兔lflI_清,I十1本室人丁感染 RH株弓形虫速殖子47d的家免清,直接凝集试验 的抗体滴度为l:160000.40份阴性I『I【清为上海市汽 乍驾驶员常规体检健康人清, 2抗原制备 取常规接种RH株弓形虫速稍子(1×107/鼠)3dfl~,J 小鼠(昆明系)腹腔液(90只小鼠,每鼠ll1),l000~g 离心20lnin.夫j清,加0.83氯化铵溶液l00llll 处理3nlin,lO00~g离心20lllin,沉淀川磷酸缓冲 盐溶液(PBS)洗涤3次,加适舒泰蒸水,置液氮巾 冻融,裂解.超声粉碎5次,l1O00xg离心30lllill, t清液即为弓形虫胞质f1,分装保仔于一70备 3试纸条制备 果,L{Jf一烷磺酸钠一聚烯酰胺凝胶I乜泳 (SI)S,PAGE)及电泳转印法,分离胶浓度为l2.5%. 浓缩胶浓度为4%,交联度均为3%分圳加入l0l 低分子量标准蛋h和l00l弓形虫胞质蛋白,进行 电泳(条件为:300V,40mA,l0一,50ll/il1).取下凝 胶,覆以硝阪纤维膜(NC膜.孔f0.2m),置半f 式电泳转移仪(Hoefel一,炎Imlll(I1~11/1)内,15v转 印30nlin取tt{转印膜.对照标准赁n位置,切去相 对分子质造(Mr1>35000部分转印愤,保留的转印 膜分别川5组封闭剂封阻1h.切成3rnTn宽试纸条. 一 20冻存备,L}J, 4试剂盒操作方法 将上述制备的试纸条分别置于反应槽内,分别加 入1:100的弓彤虫阳性m清和健康对照清300l孵 育lh,洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的第 ::抗体(抗人IgG或lgM),窀温振荡培育lh后洗 涤.再分刖加300l色液(F}1l:20的A,B两液调 配而成.A液为溶1二无水乙醇的四甲基联苯胺 (TMB)?:液,B液为pH5.0的柠檬酸一PBS,气溶胶 OT和H!O配制),5lllin后用dH!O冲洗以终止反应, 结果判读以}}1观蓝色反应条带判为阳性.阴性无反应 带 5实验条件的优化 影响试剂盒检洲效果的主要『大I素,包括抗原, 试纸条,洗涤剂,稀释剂,封闭剂,色剂以及反 应时间等.通过不同配比组合,选择最佳实验条件. 结果 1最佳实验条件的选择 1.1抗原制备方法和使用剂量比较用胰蛋白酶消 化法制备弓形虫可溶性抗原获得率较高,但不易破坏 宿主红细胞,川该抗原制备的试纸条,阳性反应条带 着色淡,不易辨别常规分离法(将弓形虫速殖子 经超低温冻融+超声粉碎可使速殖子内蛋白全部释放, 加氯化铵溶液使红细胞完全被破坏)所获的抗原制备 的试纸条.阳性反应条带着色明显,杂带少,易辨别 每…试纸条抗原量,根据蛋白含量进行比较,2,16g 共分8组,结果以12g/条最为适宜,低于8g色 带较浅,高于12g显色效果相差无几. 1.2封闭剂比较同时对5%脱脂奶粉,PBST (包括pH7.2的0.01mol/LPBS和0.05%Tween一20), l%酪蛋白,5%牛m清白蛋门以及3%明胶等5组封 『于J剂进行比较.结果,以5%脱脂奶粉的封闭效果最 佳,零底呈白色,反应带为蓝色.其他封闭剂的效果 差,如PBST和酪蛋白作为封闭剂,均出现较多的 非特异性条带;川牛清向蛋门和明胶作为封闭剂, 反应条带不够清晰 1.3洗涤剂和稀释剂以pH7.2的0.01Hiol/LPBS 为洗涤剂及再加入5%脱脂奶粉作为稀释剂,另以pH8.0 的TBST(包括0.01illol/LTris—HCI,0.15nlo1/INaCI. 0.1%Tween一20)为洗涤剂,再加入5%脱脂奶粉作为 稀释剂.两者比较,TBST明显优于PBS,背景与反 应带对比清晰,而用PBS则混杂一些非特异性反应 条带. 1.4底物显色剂比较川TMB和二氨基联苯胺 (DAB)为底物,检测感染弓形虫兔血清的IgG抗体滴 度分别为1:102040和1:25600,检测国际标准抗弓 形虫人I仉清的浓度分别为0.25IU/ml和1IU/m1.表 明TMB的检测灵敏度高于DAB.显色时间.TMB只 需5min即可显示最佳反应色带,而DAB需20min 以上.用TMB作为底物优于DAB 1.5工作浓度比较将弓形虫病患者血清稀释为1:50, 1:100,1:500及1:1000,分别与T作浓度为1”.50,1:100, 1:500及l:1000HRP标记的抗人IgG进行反应.与 1:l00,1:500,1:l000及I:2000的HRP标记的抗人 IgM进行反应.出现最佳显色效果的血清稀释度为 1:100,抗人IgG为1:100或抗人IgM为1:000.表 现为主带显色清晰.背景无色.40份阴性血清按 I:50稀释,在高分子量处出现浅色的非特异性条带. 按1:100稀释,背景清晰无色带. 1.6作用时间比较血清与试纸条的孵育时间分别 I5…irl,30l『1_『?,45_llll1,Ih技2Ii果.1nilli .…F”Lm消腹『,包t.以f随fllt!l~J闸的延f Ini逐渐nll深.frIll101h,包妓JLii;】InI差圳 佯,1Jfl凡一i屯订人JLI1I{I止几lg~?1一llRP)6蛘 秆l5111iI1.『:rifil{1.乜l{fk.LlJi茎inn探. 45?i--l包敢了Illh旧.摹圳r?B 包时IiI【_5nilii.…IIIll1”}.IJl1椿,影啊 }圳 I7反应带出现率jL较I—I.最仆骗条件下 ?川j虫患m晰|Il』互,{…腹f低舒J 处J七…I,JM…r{:l王l?P,1l35(H)【),22?f)【】相I I【)[)c]f)处.Ig{:…il-t”l-1.h-Mt32000n130(】(1I) 处.这JI匕fn…J一举刮4I臀,8lil1丁高{,r 处会?l}I;-条,>35000 抒.缩纸条(i25?1),j啦i式制.艾 便}?削断鲋粜-l】 ?iI2 „“——__;__{1l ,. g%12IRI,Il iz~.1-LIJliI??ly2Il.IhillH?lI 图I免疫郎迹试剂盒阳性反应带 Fig1I】itireacli?】nforanli一7J”manii1~3d3 I?ytheimmunabh)lkil 2检测效果评价 !.J敏感性免疫迹试制愉删30,弓形虫【M in【清,检17份.鼬感性为90【J:榆删18份 一 j形虫Ig(;阳性IIIL?i~J:,梳…14份,敏感?PL85.7% !.!特异性椅沁J40份健埭人In【清形虫J?f? lg(;抗体.均为.特勾I【H)%此外. 计3俐『幢虫摘4剜炎?濉…jm,!削丝虫痫 2倒蚌幔虫痫以驶!删鹱蚴10患ln清世行弓形 虫抗怍舱洲,.跟均尢交l芷li盹 2.3,(ILllleI/指数fj{“Y…llll指数=敏感rl+ 特r{?一I”„l暂:,龟螋印迎刹随删,JJ虫】g?机 体的Y(ILII[~?II指数勾(?.』世l】试剁惫洲结果『_10符 合牢为957*:髓测r肜虫I(:~,if?ki.?Lid?指数乃 ()86总甜舟94.1僵,均诊断衍随 24稳定性试制翕十一:rj【匕jifJcn:等{l{ i内4.彖瓶较J?f10I:f?刊盒i业lI【,flJ盒f符 啤匈7q吼,8q皤.牛l武并,{K血『2教Ig(:j J惫之州的?介.f匀5【)啊.博.):道2家IlJ {曲LjJ眵虫Igl【lJ=刺之川I的符卒匀769曙lm3 荻I『r瞎Ig~?l制盒I:i~J敞感r}均胝J:14叶.~1Oll-rl指 毁<c)J.琏书渗嘲价值 疫FIJ迹技术j集赁If堰凝脞电泳-西圩辨笨和『 龟崆定的岛特?l10一项眈崆:牲求.分子水 ,1M}{的压应糊涟r脆这社增r 反啦步骤,K了操干1]li,.fjill水殳悔T?Ij与气溶胶 0T按?定比削制.无须硫酸fl{j聚}j_jf处,接ej Hn)厦i乜,色彩弛黼.于削圳.擞高r灵敞 度术增JJll反应步骤书浊?I.?IT.的敞度较DAB增 ?41,I包时r闩J他I)Al{的l,4I1f同l『l_愉测弓肜 虫IM和Igq抗体.埘这I埘.Nqlc体检州的?~I)LII1指 数挺示有较高的诊断价值.尤蕻1市售IM试制 盒检删效不理的情况F,[!-4i应川价『ll:f术法 拇忭便,JI]l[~j-魉{全过程f15,宴fI]iI.强..?I.{ 搿摊广伍川 参考文献 ii.iM;11…IrIizilli,.r,lJf,…tII1rlfh_?IIIriII,.”quilI 7lL,【t……jiiltI……IJi…ll,hiFIiiI,iiiiliiII(:lTrl ?ii?l-l(I.3g:I79.Ig4 2】Moliii—l<ilLlIl,1)lIiIcrr{P,Illjnllhf_??…iI LLillt,…I-h…ri.I,hEI,t,llIjIiIIIli~rll”„ln,…t…:?Ihrm….”llIlllr ili~11]lIl”?iiIinI-|l1llIiI}?,wIllhql,11I?J【(IilIhapnLall Iiiii/itll~ll[2lI(XJ7料389 .452.rtlH寄生虫学J奇叶虫柄杂忠2(x)5年t2月第23替第6期ChinaJParasit,1ParasitDis1)?.2005,Vo!.23,No.6 31AuI1D.MaineGT.Villenal,etfd.1(-omhinanlantigens?tode?tee?t Tox()”Im”lgonspe(-iti(?imnmnoglohul|l1(:andimnmnoglobulin MinhunmnseraIn?,II1rinlnlunoassa. ~ ,J].JClinMicrobio], 2000.38:l】44一lJ50. 4]于恩庶.绍们.~,tId内儿种弓形虫lg(;机体检测试剂盒的再评 估IJ1.f{1I司人一共患病杂志200l,l7(4):l04一l08. f51牛安欧,冯友f:,刘义琦儿种弓形虫ELISA试剂盒初步检测结 果比较].巾同人共患病杂志,2000,l6(4):56—57. f6]蒋守富,张述义,潘彩娥,等.5种I打售彤虫抗体检测试刹盒 史章编号:l000—7423(2005)一06-0452—0 的评价lJ].中国人兽共患病杂志,2003,l9(1):97—99. 71Yflnlamo【(JYI.MineoJR.MeneghisseCS,eta1.Detectioninhuman seraotIgG,lgMandlgA1oexcreted/secretedantigensfromTox— oplcLsmgondiibvuseofdot—E1ISAandimmunoblotassayIJI.Ann TropMellParasitol,l998.92:23—30. 『8]McKitUn卜BreschkinJ1..Theuseoftetran1rthvlbenzi(1ineforsolid phaseimunoassavs『J.JlmmunolMethods,l990,l35:277—280. (收稿日期:2004—10—26编辑:富秀兰) 玉树县人体棘球蚴病流行病学调查 马俊英,马霄,吴献洪,张静宵,何多龙,刘王芳,刘巴睿,刘培运, 刘海青,赵延梅,蔡辉霞,王虎 玉树县地处青海吉I幸『部,青藏岛东南腹地,隶属玉树 藏族n治州,是以牧,l为主的地区.陔县辖l镇8乡,总人口 为75087人,主要以藏族为主(1fi9l%)按照《全国人体重要 寄生虫病现状渊金施细》的要求和方法,作者等于2002 年5月对树县结占镇和巴塘乡开展J人体棘球蚴病悯查.结 粜如F 1调查对象和方法 1.1调查对象根据《全I叫人体重要寄十虫病现状调查实施细 则》进行分层整群随机抽样,抽取2乡(镇)4个行政村作捌查 点,分别为结?镇的果青村,解放村和巴塘乡的上巴塘村,相 古村.调查对象为2岁以上的常住居民,每点凋查500人以上. 1.2调查方法B超检查肝,脾,双肾及腹腔和盆腔脏器等 (用AlokaSSD一500型B超机.日本,探频率3.5兆赫);用 ELISA检测l缸清抗棘球蚴lgG抗体『试刹盒购一珠海海泰生物制 药有限公一j(批号0203l0)1,以吸光度(4值)??3s为阳性判 定标准 2结果 2l患病率及血清阳性率B超共检查l070人.棘球蚴病检 }}1率为3.0%(32/1070),其f}l检查藏族1065人.32例阳性 血清学检查781人,阳性率为20.6l%(161/781).共检m细粒 棘球蚴病(CF)患者28例,泡球蚴病(AE)患者4例,患病率分别 为262%,0.37% 2.2性别分布男,女棘球蚴病检…率分别为2.1%(10/471) 和3.7%(22/599),两者差异无统计学意义(x=2.18,P>0.05); 男,女血清阳rk率分别为l6-3%(55/338)和23.9%(1061443), 女性高于男性(x=6.87,P<0.05). 2-3职业分布不同职业人群棘球蚴病检H{率,血清阳性率不 同牧民,农民,家庭妇女和其他职,的检llJ率分别为4.1%, 6.7%,3.5%和3.2%,牧民,农民,半农半牧,家庭妇女,学生, 学龄前儿童,行政干部和其他职业血清阳性率分别为24畅, 作者单位:青海省地方病预防控制所,西宁8ll602 【简报】 22.5%,2.2%,20.7%,29.4%,30.0%,28.6%和l1.1%? 2.4年龄分布除l0,l9岁组外.其他各年龄组均查见棘球 蚴病患者,以50,,60,岁两组人群检率为高,分别为 7.0%和7-4% 2.5地区分布结古镇和巴塘乡居民的棘球蚴病检出率分别 为4.8%和1.4%.血清阳性率分别为27.0%和l3.4%.结古镇 棘球蚴病俭率和血清阳性牢均高于巴塘乡(P<0.05) 3讨论 本次调查结果显示,玉树县为细粒棘球蚴病和泡球蚴病交 叉混合流行,但主要以细粒棘球蚴病为主,多房棘球蚴病为 辅.1994年曾报道玉树州囊型棘球蚴病患者自l980年以来高 达ll70例.牛,羊棘球蚴感染率分别为38-3%和47.0%, 本次渊查棘球蚴病患病率为30%,m清学阳性率为207%. 本次调查结果显示,人群中女性细粒棘球蚴血清阳性率较 高,职业中农,牧民血清阳性率较高,与该性别,职业人群参 加牛产劳动,接触犬的机会较多所致.棘球蚴病患者中最小年 龄者9岁,最大者84岁,而高年龄组出现较高的患病.可能 与当地缺医少药,不能及时诊治及棘球蚴病具有漫长的潜伏期 等有关. 与玉树县一河之隔的称多县分别于l992年和l997年 两次人群棘球蚴病流行病学调查,患病率高达5.0%和8.5%. 两县作为玉树藏族自治州及”三江源”的交通大动脉.经济贸易 频繁,人员流动性大,近年来随着经济贸易不断扩大,大量疫 区犬和家畜向省内外不断地输出,必会加重全省乃至其他地区 棘球蚴病的流行.应加强对该地区的棘球蚴病防治和控制,防 止再度蔓延 参考文献 [1]朱锦沁,袁生馨,主编.高原人畜共患病【M】.西安:陕西人民 出版社.I994.275. [2]何多龙.青海省包虫病流行与防治}JJ.中国人畜共患病杂志,2000, 16(4):67. (收稿日期:2005.O1.17编辑:盛慧锋)