利用脂解酵素进行三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药合成

利用脂解酵素进行三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药合成 利用脂解酵素进行三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药合成 The synthesis of aromatic fatty acid triglyceride prodrug via lipase 张春生 南台科技大学 生物科技研究所 NSC 92-2214-E218-002 摘要 芳香族脂肪酸之苯基丁酯能够促进好几种不同之肿瘤型式之细胞停滞及分化此种药物疗效取决於在体内是否能长期维持在药物之最低有效浓度但此类药物代谢很快导致无法在血液中达到适当浓度。因此以三酸甘油酯方式进行投药经体内吸收后再利用体内酵素切断酯键将药物释放出来除可延长体内药物之半生期且提高体内有效药物浓度并减少投药剂量增加患者之接受度。 经酵素筛选利用Candida antarctica 之固定化脂解酵素催化可合成三苯基丁酸甘油酯glyceryl triphenylbutyrate前驱药。比较有机溶剂与无溶剂系统在无溶剂系统下可得到较高的转化率并有利於后段产物分离纯化。在开放环境下有利酯化反应之副产物水分移除且最适反应温度为65 ?。当甘油与苯基丁酸之莫耳比为1 / 3时其酯化程度最佳甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之转化率可达88 。若在反应过程中进行抽真空可更有利水分迅速移除真空度压力愈小所得的三苯基丁酸甘油酯转化率则愈高当将真空度降至1 torr时三苯基丁酸甘油酯转化率可高达93 。 关键字脂解酵素、酯化、芳香族脂肪酸、三酸甘油酯、前驱药 Keywordslipase、esterification、aromatic fatty acid、triglyceride、prodrug 1. 前言 芳香族脂肪酸之苯基乙酯phenylacetate与苯基丁酯phenylbutyrate可治疗以下几种疾病 一 尿素循环失调 健康者能够将身体代谢蛋白质所产生含氮有毒的物质快速转换成尿素并排出体外但对肾脏功能及天生在尿素合成有问者将会因含氮有毒代谢物无法代谢而造成疾病产生甚至死亡。苯基乙酯为美国食品药物管理局FDA所新核准治疗此疾病之有效药剂可以与氮形成phenylacetylglutamine然后经由身体排出1。但由於苯基乙酯味道刺鼻造成患者使 用意愿不高因此以苯基丁酯作为苯基乙酯之 前驱药利用体内代谢之β-oxidation pathway一次移除两个碳而产生苯基乙酯且因苯基丁酯分子量较高所以没有苯基乙酯的刺鼻味。 二肿瘤及癌症 芳香族脂肪酸之苯基乙酯与苯基丁酯其疗效在於可以诱导细胞终止分化或引导分化成为具正常功 能之成熟细胞或者触发不正常细胞之凋亡2。值得注意的是苯基丁酯在一些体内评估效果比苯基乙酯好2至10倍3。 三老化 组蛋白去乙醯酵素Histone deacetylase HDAC核小体nucleosomes中组蛋白histone的乙醯化acetylation 及去乙醯化deacetylation在调节基因现扮演重要角色。组蛋白胺基末端因被乙醯化或去乙醯化所产生之结构修释能够调节转录因子及RNA聚合酶键结至DNA进行转录之能力。 利用HDACs抑制剂研究改变组蛋白乙醯化程度所导致动物生理学上的改变。最近证实属於HDAC抑制剂的苯基丁酯不仅能延长果蝇之平均及最长寿命同时也能保持生理上之活力4。 四血红素病 镰刀型贫血症sickel cell anemia及地中海贫血症β-thalassemias皆属於血红素病初步临床试验显示可以使病患相对提高红血球生成素水准因此在临床研究上苯基丁酯钠搭配 –OH可使某些患者提高血红素之水准5。 此种药物疗效取决於在体内是否能长期维持在药物之最低有效浓度但此类药物代谢很快。以三酸甘油酯方式进行投药可延长体内药物之半生期能提高体内有效药物浓度可减少投药剂量且甘油本身即为生物体代谢之正常产物。文献中指出三酸甘油酯若用化学法合成产率偏低且纯化较复杂而以脂解酵素催化进行合成则可克服化学法的问题6此外酵素在无溶剂系统下进行催化不仅可以避免溶剂的毒性问题且可减少纯化的步骤7。另外文献中也指出1莫耳酸酯化会产生1莫耳的水为了有利反应进行避免水解产生可以藉由开放系统或抽真空的方式将水分 移除8。芳香族脂肪酸如苯基乙酸、苯基丁酸之三酸甘油酯由Brusilow於2000年获得以三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药用於治疗上述提过疾病之美国专利9经进一步文献及专利资料库调查发现并无相关此类前驱药物之制程研究因此本计画将利用酵素催化酯化反应开发三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药合成制程。 2. 研究方法 2.1 药品 Novo 435 lipase from Candida antarctita购自丹麦NovozymesLipase CC Type VII from Candida rugosa购自美国SigmaLipase A from Aspergillus niger、AK from Pseudomonas fluorescent 、PS from Pseudomonas cepacia皆购自日本Amano PharmaceuticalLipase MY from Candida rugosa、OF from Candida rugosa、QLG皆购自日本名糖产业株式会社。甘油glycerol购自美国POCH苯基丁酸4-phenylbutyric acid购自瑞士Fluka。 2.2 反应系统 基质甘油glycerol与苯基丁酸4-phenylbutyric acid先加热至60 ?使其溶解之后加入Novo 435之固定化脂解酵素进行酯化反应之催化产物包含单苯基丁酸甘油酯glyceryl monophenylbutyrate、双苯基丁酸甘油酯glyceryl diphenylbutyrate、三苯基丁酸甘油酯glyceryl triphenylbutyrate及水分。 2.3 HPLC分析条件 HPLC分析管柱使用RP-8 columnUV波长为216 nm内标物为2-Nitrotoluene流动相A为acetonitrileH2O 0.01 trifluoroacetic acid 6535 v/v 流动相B为acetonitrile各分析物之滞留时间如表一所示。 3. 结果与讨论 3.1 酵素筛选 选用八种不同菌种来源之酵素其中Novo 435 lipase与lipase QLG属固定化酵素另外自制lipase CC、MY冷冻乾燥之固定化酵素在无溶剂反应系统中催化甘油与苯基丁酸进行酯化反应筛选出最有利合成三苯基丁酸甘油酯之脂解酵素。结果如图一所示在相同条件下只有Novo 435 lipase可合成出最高含量之三苯基丁酸甘油酯其余的脂解酵素都仅能合成出单苯基丁酸甘油酯与双苯基丁酸甘油酯及极少量之三苯基丁酸甘油酯因此在日后酵素的选择上将选用Novo 435 lipase来当做酯化反应之催化剂。 3.2 反应系统之筛选 探讨反应系统对酯化反应平衡之影响包括不同有机溶剂系统筛选及无溶剂系统筛选对苯基丁酸甘油酯转化率之影响并考虑后段产物分离之可行性。在此选择三种不同的有机溶剂作为反应之介质并与无溶剂状态下做一比较结果如表二所示。在有机溶剂系统下经168小时反应时间苯丁酸有60 以上会转化成单苯基丁酸甘油酯只有少量转化成双苯基丁酸甘油酯其中仅有二氯甲烷dichloromethane能合成出三苯基丁酸甘油酯但转化率只有1.91 若在无溶剂系统下三苯基丁酸甘油酯转化率可达4.19 。因此将选择无溶剂系统作为本实验之适当反应系统除可解决极性甘油在非极性溶剂溶解度偏低的限制且能有利於后段产物分离纯化且无毒性溶剂使用之问题。 3.3 最适反应温度 反应温度会关系到酵素活性及稳定性表现也可能与水移除有关联。在此选择五种不同的反应温度分别为60 ?、65 ?、70 ?、75 ?与80 ?在开放系统下进行酯化反应结果如图二所示。当温度从60 ?升到65 ?时三苯基丁酸甘油酯转化率会随温度而提升但当温度到达70 ?以上三苯基丁酸甘油酯转化率则快速下降。可能是70 ?的反应温度会造成酵素失活其可能原因有一、酯化反应之副产物水在70 ?下使酵素失活其二则是在较高温度下由於无溶剂之甘油系统黏度较高无法使水分快速移除造成局部水分太高导致逆反应之水解发生才会造成转化率无法提升。因此开放系统下反应温度为65 ?时最有利酯化反应的进行此时三苯基丁酸甘油酯转化率可达68 。 3.4 基质间比例 探讨甘油与芳香族脂肪酸之莫耳数比对酯化程度之影响。一个甘油利用酯键至少可携带三个脂肪酸若将脂肪酸比例增加是否可提高三苯基丁酸甘油酯转化率。在此将苯基丁酸莫耳数固定调整甘油莫耳 数甘油与苯基丁酸之间莫耳比分别为1 / 3、1 / 4、1 / 5与1 / 6结果如图三所示。当甘 油与苯基丁酸之莫耳比为1 / 3时其酯化程度最佳甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之转 化率可达88 。若将苯基丁酸的量增加到1 / 4、 1 / 5、1 / 6时理论上甘油酯化率应会 升高但实际结果甘油酯化率反而下降其可能原因来自不同醇酸比例改变了溶液之亲 疏水性而造成平衡位置改变实际原因需进一步探讨因此在开放系统下保持甘油与苯 基丁酸的莫耳比为1 / 3可得最佳甘油酯化率。 3.5 真空度 由於酯化反应会伴随水 分生成将造成水解逆反应发生而降低酯化的程度此关系甘油是否可以完全醯化因此 藉由抽真空的方式看能否将水副产物移除以提高三苯基丁酸甘油酯转化率。在此选 择五种不同的真空度压力分别为常压状态760 torr及抽真空压力为380 torr、150 torr、 50 torr、1 torr结果如图四所示。当真空度压力愈小所得的三苯基丁酸甘油酯转化率 则愈高显示真空度之提高可有效移除多余的副产物水分使得三苯基丁酸甘油酯转化 率提升。若将真空度降至1 torr时三苯基丁酸甘油酯转化率可高达93 。 4. 结论 利 用脂解酵素催化酯化反应开发三芳香族脂肪酸甘油酯前驱药合成将得到以下几点结 论 1. 酵素筛选选用Novo 435 lipase from Candida antarctita来当做酯化反应之催化 剂。 2. 反应系统选择无溶剂系统作为本实验之适当反应系统且能有利於后段产物 分离纯化。 3. 反应温度65 ?时最有利酯化反应的进行。 4. 基质间比例甘油与苯 基丁酸之莫耳比为1 / 3时其酯化程度最佳甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之转化率可 达88 。 5. 真空度真空度压力愈小所得的三苯基丁酸甘油酯转化率愈高当将真空度 降至1 torr时三苯基丁酸甘油酯转化率可高达93 。 5. 参考文献 1Brusilow S. W. Maestri N. E. 1996. Urea cycle disorders: diagnosis pathophysiology and therapy. Adv. Pediatr. 43 127-170. 2Johnstone R. W. 2002. Histone-deacetylase inhibitors: novel drug for the treatment of cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 1 287-299. 3Pineau T. Hudgins W. R. Liu L. Chen L. –C. Sher T. Gonzalez F. J. Samid D. 1996. Activation of a human peroxisome proliferatior-activated receptor by the antitumor agent phenylacetate and its analogs. Biochem. Pharmacol. 52 659-667. 4Kang H. Benzer S. Min K. –T. 2002. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. 99 838-843. 5Pace B. S. White G. L. Dover G. J. Boosalis M. S. Faller D. V. Perrine S. P. 2002. Short-chain fatty acid derivatives induce fetal globin expression and erythropoiesis in vivo. Blood. 100 4640-4648. 6Anna M. F. Patrick A. Bo M. 1996. Glyceride synthesis in a solvent-free system. Jaocs. 73 1489-1495. 7Kim S. M. Rhee J. S. 1991. Production of medium-chain glycerides by immobilized lipase in a solvent-free system. Jaocs. 68 499-503. 8Selmi B. Ergan F. Barbotin J. N. Thomas D. 1997. Lipase-catalyzed synthesis of tricaprylin in a medium solely composed of substrates. Water production and elimination. Enzyme Microb. Technol. 20 322-325. 9Brusilow S W. 2000. Triglycerides and ethyl esters of phenylalkanoic acid and phenylalkenoic acid useful in the treatment of various disorders. US6083984. 表一. 内标物、基质及其酯类产物之滞留时间 表二. 密闭系统下有机溶剂与无溶剂系统之筛选有机溶剂下甘油1 mM苯基丁酸3 mM无溶 剂系统下甘油1 mmole苯基丁酸3 mmoleNovo 435 lipase 0.3 g反应温度45 ?反应时 间168小时。Xmono、 Xdi、 Xtri 、XT分别为单苯基丁酸甘油酯、双苯基丁酸甘油 酯、三苯基丁酸甘油酯与总苯基丁酸甘油酯之转化率。solvent log P Xmono Xdi Xtri XT isooactane 4.5 0.7205 0.0039 0.0000 0.7244 cyclohexane 3.2 0.7963 0.0197 0.0000 0.8160 dichloromethane 1.25 0.6554 0.1929 0.0191 0.8675 free 0.6248 0.2134 0.0419 0.8801 free表示无溶剂系统。 附转化率计算方式如下 32tridimonoSmonomonoCCCCCX 322tridimonoSdidiCCCCCX 323tridimonoStritriCCCCCX tridimonoTXXXX compounds RTmin 2-Nitrotoluene 9.31 4-Phenylbutyric acid 6.72 Glyceryl monophenylbutyrate 5.55 Glyceryl diphenylbutyrate 12.16 Glyceryl triphenylbutyrate 25.52 符号说明CS、Cmono、Cdi、Ctri分别为基质苯 基丁酸、单苯基丁酸甘油酯、双苯基丁酸甘油酯、三苯基丁酸甘油酯之浓度。 图一. 选用八种不同菌种来源之酵素其中Novo 435 lipase与lipase QLG属固定化酵素另外 自制lipase CC、MY冷冻乾燥之固定化酵素在开放的无溶剂反应系统中进行酯化反 应。甘油1 mmole苯基丁酸3 mmole酵素量 0.05 g反应温度为60 ?常压反应时间为 144小时。 图二. 开放系统下反应温度对三苯基丁酸甘油酯转化率之影响。甘油5 mmole苯基丁酸15 mmoleNovo 435 lipase 0.3 g常压反应温度分别为60 ?、65 ?、 70 ?、75 ?、80 ?。 图三. 开放系统下基质比例对甘油酯化程度之影响。甘油 分别为5 mmole、3.75 mmole、3 mmole、2.5 mmole苯基丁酸15 mmoleNovo 435 lipase 0.3 gNovo 435lipase CC lipase A lipase AK lipase MY lipase OFlipase QLGlipase PS IME lipase CCIME lipase MYXmono Xdi Xtri0.00.20.40.60.81.0monophenylbutyratediphenylbutyratetriphenylbutyrateTime hr020406080100120140160Xtri0.00.20.40.60.81.0绻/荒 1 / 3绻/荒 1 / 4绻/荒 1 / 5 绻/ 荒 1 / 6Time hr020406080100120140160Xtri0.00.20.40.60.81.0常压反应温度为 65 ?。转化率以甘油酯化程度来计算。 图四. 真空系统下真空度对三苯基丁酸甘 油酯转化率之影响。甘油5 mmole苯基丁酸15 mmoleNovo 435 lipase 0.3 g反应温度为 65 ?真空度分别为760 torr、380 torr、150 torr、50 torr、1 torr。 Time hr020406080100120140160Xtri0.00.20.40.60.81.0760 torr 380 torr 150 torr 50 torr 1 torr