胶原膜修复大鼠硬腭软组织缺损的实验研究

胶原膜修复大鼠硬腭软组织缺损的实验研究 胶原膜修复大鼠硬腭软组织缺损的实验研 究 ?1388?广东医学2011年6月第32卷第1l期GuangdongMedicalJournalJune.2011,Vo1.32,No.11 碱性成纤维细胞生长因子/胶原膜修复大鼠 硬腭软组织缺损的实验研究:{= 刘双喜,徐淑兰,钟星华,周敏,杨烁 南方医科大学附属口腔医院,广东省口腔医院种植中心(广州510280) 基础研究 【摘要】目的利用与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)特异结合的胶原膜修复大鼠硬腭软组织缺损,观察 其对大鼠创面修复的影响.方法48只6周龄雄性Wistar大鼠随机分成4组,每只大鼠硬腭第一磨牙近中至第 三磨牙远中的软组织作一直径为3mm的圆形缺损,分别植入结合bFGF/胶原膜,游离bFGF/胶原膜,胶原膜及不 植入任何修复块(空白对照组)每组大鼠分别在术后1,2周处死6只,HE染色测上皮组织间距离,比较创面愈合 率.结果1周时创面愈合率差异有统计学意义,结合bFGF/胶原膜组>游离bFGF/胶原膜组胶原膜组>空白对 照组;2周时创面愈合率差异无统计学意义.结论结合bFGF/胶原膜能加快大鼠硬腭软组织的修复. 【关键词l碱性成纤维细胞生长因子;胶原膜;软组织缺损;创面愈合率 Effectofcollagen—targetingbasicfibroblastgrowthfactorloadedcollagenmembraneonsofttissuerepairmenof rathardpalate.L/UShuang—xi,XUShu—lan,ZHONGXing—hua,ZHOUMin,rANGShou.Implantation Center,AffiliatedStomatologicalHospitalofSouthernMedicalUniversity,GuangdongPro vincialStomatologicalHospital, Guangzhou510280,China Correspondingauthor:XUShu—lan,Tel:020—84408890,E— mail:xushulan@Vip.163.com 【Abstract】ObjectiveToevaluatetheeffectsofcollagen— bindingbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)loaded collagenmembraneonsofttissuerepairmenofrathardpalate.MethodsForty— eightmaleWistarratsof6一week—old wererandomlydividedinto4groups.A3mmdiametercircularsofttissuedefectwasproducedinthecenterofhardpalate ofrats.Thedefectswerecoveredwithcollagen— targetingbFGF/collagenmembrane,freebFGF/collagenmembrane,col— lagenmembraneandnomembrane(controlgroup)indifferentgroups.Each6randomratsweresacrificedonthe7thand 14thdayineverygroupaftertheoperation.Thewoundhealingwasrecorded,andthedegreeofre—epithelializationwas detectedbymeasuringthelengthofepithelialgapinhematoxylin— eosin(HE)staining.ResultsOnthe7thdayafter operation,thedegreeofre—epithelialiazationwascollagen— targetingbFGF/collagenmembranegroup>freebFGF/col— lagenmembranegroupcollagenmembranegroup>controlgroup.SignifieantlYlessimprovementofre—epithelialazation wasobservedincontrolgroupthanthatintheother3groups,whilesignificantlybetterimprovementwasobservedincolla— gen— targetingbFGF/collagenmembranethanthatinfreebFGF/collagenmembraneandcollagenmembranegroups(P< 0.05).However,therewasnosignificantdifferenceinre— epithelializationbetweenfreebFGF/eollagenmembraneand collagenmembranegroups(P>0.05).Moreover,therewasnosignificantdifferenceinre —epithelializationamongthe4 groupsonthe14thday(P>0.05).ConclusionThebFGF/collagenmembraneaccelerates woundhealingofsofttissue defectinrathardpalateviaimprovementofre—epithelialization. 【Keywords】basicfibroblastgrowthfactor;collagenmembrane;softtissuedefect;thedegreeofre—epithelializa— tion 目前,临床上对于口腔黏膜缺损时多采用自体游 离皮瓣,肌皮瓣,局部转移黏膜瓣等移植修复缺损,以 保证移植物在口腔特殊环境中成活,但这些方法的缺 点也是不容忽视的:如移植后组织能否存活,组织量过 大导致供区畸形,存活后的组织瓣保留供区的特性如 毛发,汗腺等,二次创伤增加患者痛苦和病程等问. 随着组织工程学的发展,胶原膜因为其较好的生物相 容性和可降解性越来越被广泛应用,已经广泛地用作 广东省医学科学技术研究基金立项项目(编号:A2009099) ?通信作者.电话:020—84408890;E—mail:xushulan@Vip.163 eom 口腔黏膜缺损,牙龈缺损以及牙龈萎缩等的修复. 研究认为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能促进创 伤愈合.本研究2010年4月至2011年1月通过利用 与bFGF特异结合的胶原膜修复大鼠硬腭软组织缺 损,促进软组织缺损的修复,为临床软组织缺损修复方 法提供理论依据. 1材料与方法 1.1实验动物的选择与分组选用48只雄性SPF级 6周龄Wistar大鼠,重约160,200g(从中山大学实验 动物中心购买,动物质量合格证号:SCXK(粤)2009— 0011).将实验动物随机分为4组.结合bFGF/胶原 广东医学2011年6月第32卷第l1期GuangdongMedicalJournalJtlrle.2011,_nl_3 【1.1.1389. 膜组:l2只,大鼠腭部软组织缺损用结合bFGF/胶原膜 修复;游离bFGF/胶原膜组:12只,大鼠腭部软组织缺 损用游离bFGF/胶原膜修复;胶原膜组:12只,大鼠腭 部软组织缺损用胶原膜修复;空白对照组:12只,大鼠 腭部软组织缺损不植入任何修复块.所有大鼠由中山 大学实验动物中心SPF级屏障环境饲养,自由摄食,饮 水.适应性饲养1周后进行实验. 1.2植入材料胶原膜为异种脱细胞真皮基质,主 要成分是天然I型和?型胶原蛋白(牛源化:,,厚度约 1mm,长×宽=5lllnl×7mm.结合bFGF/胶原膜:bFGF 与胶原结合域(collagen—bindingdomain)结合后,形成 具有靶向结合能力的生长因子,再与胶原膜结合,并冻 干.游离bFGF/胶原膜:bFGF与胶原膜简单物理吸 附,并冻干.以上材料均由正海生物公司制备与提供. 1.3手术方法以10%的水合氯醛,按照0.3IRE/|00g 体重行大鼠腹腔注射麻醉后,70%乙醇消毒,铺无菌 巾.实验中撑开大鼠口腔,于大鼠硬腭部第一磨牙近 中至第三磨牙远中的软组织中央用环形切龈刀作一直 径为3//1113的圆形缺损,并用探针剥离缺损边缘黏骨 膜瓣,前端止于第一磨牙近中水平,后端止于第三磨牙 远中水平,左右止于距两侧上颌磨牙腭侧龈缘约1Illnl 处,注意动作轻柔,勿损伤骨面.压迫止血后,植入5 mm×7mm的胶原膜,基底膜面向外面,粗糙面朝向骨 面,将胶原膜覆盖整个软组织缺损区并用探针将其展 平于缺损边缘黏骨膜和骨面之间,7—0带线缝合针缝 合胶原膜与黏骨膜瓣.术后连续3d给予青霉素G5 万u肌注,并于饮水中加入甲硝唑片剂预防感染.术后 1周内进软食L]内缝线任其自行脱落. 1.4标本制备分别于术后l,2周处死大鼠,每组6 只.标本创面大体观察.取其整个上颌骨,切取硬腭 部分,固定于4%多聚甲醛中24,72h.标本经固定后 于10%EDTA液中脱钙4,6周.梯度酒精脱水,石蜡 包埋.每个标本从矢状面中央切开,从中央向两侧作 ABioo ,光镜观察. 3m厚的连续切片,行常规HE染色 1.5纽织学切片观察及计量学指标的测定每个标 本行HE染色描述,每张切片利用hnageProExpress 6.0图像处理软件测量记录组织学切片中创面两端上 皮组织间的距离,利用公式计算出各组各时问段的 创面愈合率:0%相当于创面完全未愈合,100%相当于 创面完全愈合.其计算公式为:创面愈合率=(3一上 皮组织间距离)/3×100%. I.6统计学方法使用SPSS13.0统计软件,由于2 周时各组创面完全愈合,创面愈合率均为100%,无需 行统计分析,故只对1周时创面愈合率行统计分析. 用单因素方差分析(one—wayANOVA)比较创面愈合 率,预先用LeveneStest检验方差齐性,如方差齐则采 用样本均数间两两比较的LSD,方差不齐则采取校正 的Wekh法 2结果 2.I实验动物情况手术创口无炎症感染,均达到一期愈合,胶原膜无排斥反应,无动物死亡.术后1周见 部分缝线脱落,实验观察期问术区无红肿,无化脓.1 周时4组创面均未完全愈合,创缘少许红肿,无明显渗 出液.2周时,4组创面均完全愈合,肉眼观无差异. 2.2镜下观察1周时,结合bFGF/胶原膜组上皮层 未完全形成,大量炎症细胞浸润,大量成纤维细胞,大 量新生血管形成,见少量胶原膜;游离bFGF/胶原膜组 上皮层未完全形成,较多炎症细胞浸润,较多成纤维细 胞,新生血管形成,见少量残余胶原膜;胶原膜组较多 炎症细胞浸润,新生血管形成;空白对照组少量炎症细 胞浸润,少量新生血管.上皮组织间的距离见图1.2 周时,结合bFGF/胶原膜组上皮层形成,上皮钉突粗 大;游离bFGF/胶原膜组上皮层层次清晰,少量上皮钉 突形成;胶原膜组与游离bFGF/胶原膜组相似;空白对 照组上皮层形成,无明显上皮钉突形成.见图2. 一D A:结合bFGF/胶原膜组;B:游离bFGF/胶原膜组;C:胶原膜组;D:空白对照组;标尺 =100p.m;箭头为上皮组织两端的位置 图11周上皮组织间的距离(HE,×20) A一0.. A:结合bFGF/~原膜组;B:游离bFGF/胶原膜组;C:胶原膜组;D:空白对照组;标尺 =20m 圈22周上皮组织观察(HE.×200) ?1390?广东医学2011年6月第32卷第11期 GuangdongMedicalJournalJune.2011,Vo1.32,No.11 2.3各处理组1周创面愈合率各组间差异具有统 计学意义(F=30.49,P=0.00).两两比较:除游离 bFGF/胶原膜组与胶原膜组比较P=0.529,差异无统 计学意义外,其他各组两两比较差异均有统计学意义 (P<0.01),可以认为创面愈合率结合bFGF/胶原膜 组>游离bFGF/胶原膜组一胶原膜组>空白对照组, 即结合bFGF/胶原膜组愈合速度最快,见1. 表1各处理组1周创面愈合率(?)% 组别创面愈合率 结合bFGF/胶原膜组 游离bFGF/胶原膜组 胶原膜组 空白对照组 89.05土5.17 84.O3?3.O8 83.1l?2.72 75.32?4.90 3讨论 3.1胶原膜修复软组织缺损的应用胶原膜即异种 脱细胞真皮基质(acellulardermalmatrix,ADM),采用 脱细胞技术,将异种组织经过生物学和生物化学的工 艺方法处理,完全脱除了组织中的细胞成分,仅保留了 非细胞成分,主要包括细胞外基质蛋白和胶原,有效地 解决了组织移植过程中的免疫排斥反应问题.胶原膜 中最基本的结构是胶原,它以支架形式为细胞和其他 细胞外基质成分提供结合部位.将胶原膜植入宿主体 内,宿主细胞在其三维支架上生长,增殖,同时分泌新 的细胞外基质成分,形成自身组织,从而完成对缺损组 织的修复和重建.胶原膜在口腔内科学,外科学中的 应用均暴露于口腔环境中,如修复前庭沟,舌,颊部,腭 部及牙龈等缺损,均取得了满意的口腔黏膜修复效 果.在口腔种植学中的应用,临床研究也认为应用 ADM充当骨引导生物膜并同时修复骨增量术后软组 织不足的临床效果满意.HARRIS报道了应用 ADM可以增加牙槽嵴软组织量.GRIFFIN等指出 ADM暴露于口腔中具有一定的愈合能力.NUNEZ 等动物实验研究认为ADM能明显增加口腔中软组 织的面积及角化龈的厚度.大量临床研究和动物实验 证实,胶原膜暴露于口腔中一样有良好的效果,是胶原 膜暴露于口腔修复软组织缺损的理论依据.本实验研 究中应用胶原膜修复大鼠硬腭部软组织缺损,同样取 得了较满意的修复效果,1周时大鼠腭部创面大部分 修复,植入胶原膜组创面愈合率大于空白对照组.笔 者认为,只要能将胶原膜固定于创面,保证细胞及时迁 入和胶原膜血管化的正常进行,就可有效地促进软组 织缺损的愈合. 3.2bFGF促进创面愈合的作用bFGF属于成纤维 生长因子(fibroblastgrowthfactor)家族.目前体内外实 验均证实,bFGF是一种重要的促创伤愈合因子,参与 多种组织修复过程.组织修复过程包括局部炎症反应 期,细胞增殖修复期和组织重建等阶段.动物实验证 明:bFGF对创伤修复的各个阶段均有促进作用,在局 部炎症反应期,bFGF对创伤细胞有明显的趋化活 性,诱导炎症细胞,成纤维细胞及血管内皮细胞等 向创伤部位移动.在本实验中,结合bFGF/胶原膜组 和游离bFGF/胶原膜组均有大量炎症细胞浸润,成纤 维细胞聚集.在细胞增殖修复期,bFGF促进成纤维 细胞迅速增殖,促进血管内皮细胞,血管平滑肌细胞增 殖和分化,促进新生毛细血管的形成,增加肉芽组织, 从而改善局部微循环及组织营养状况.实验中,结合 bFGF/胶原膜组和游离bFGF/胶原膜组亦有大量新生 血管形成,而空白对照组新生血管较少.在组织重建 期,bFGF促进上皮细胞增殖,使创缘上皮迅速向心爬 行,创面缩小,促进伤口快速愈合.本实验中,加了 bFGF的胶原膜创面愈合率大于不加生长因子的胶原 膜,也大于空白对照组.ODA等应用bFGF溶液注 射于大鼠腭部4mm圆形软组织缺损周围促进大鼠腭 部软组织缺损的愈合,本实验bFGF促进软组织修复 的结果与其一致. 3.3bFGF与胶原膜靶向结合的应用将bFGF单独 植人体内易在体液中快速扩散而被稀释,也容易被蛋 白酶分解,治疗浓度难以维持,不能持续刺激靶细胞以 充分发挥其作用.学者们""曾尝试通过提高bFGF 的使用剂量来促进其效应,然而,bFGF的剂量太高也 会产生一系列并发症,如血小板减少症,肾毒性,甚至 激活某些潜在的恶性细胞等.同时,bFGF与肿瘤的发 生,发展及预后密切相关.因此bFGF必须与合适 的载体结合,使之在限定的部位发挥作用,避免扩散才 能降低其使用量,减少并发症和提高使用安全性.中 国科学研究院戴建武等发现通过胶原结合域(collagen — bindingdomain)能将bFGF靶向定位在胶原膜上,从 而构建局部释放系统实现bFGF从胶原膜上缓慢释 放. 本研究中1周时,结合bFGF/胶原膜组硬腭软组 织创面愈合率最大,创面愈合率为结合bFGF/胶原膜 组>游离bFGF!胶原膜组胶原膜组>空白对照组, 可能是由于结合bFGF/胶原膜组大量的新生血管为组 织的愈合上皮化带来了更多的营养和原料,为组织修 复提供了条件;而游离bFGF!胶原膜组与胶原膜组创 面愈合率没有明显差异,由于游离bFGF/胶原膜与胶 原膜微弱的结合力,容易被口腔唾液冲散,带走,保留 在胶原材料上的生长因子非常少,不能够促进细胞迁 移到材料中并增殖.HE染色见2周时结合bFGF/胶 原膜组上皮层上皮钉突多而粗大,空白对照组上皮层 形成,但未形成上皮钉突,是因为结合bFGF/胶原膜组 创面愈合速度最快,其大量的新生血管改善创面微循 环,为组织修复提供必需的氧及丰富的营养物质,使 上皮化速度加快.2周时各组创面均愈合,这可能与 大鼠硬腭软组织3mm的较小创面有关. 参考文献 [1]张伟,胡敏,王恩博.等.脱细胞异体真皮基质修复1:3腔黏膜 广东医学2011年6月第32卷第11期 GuangdongMedicalJournalJune.2011,Vo1.32,No.11 台邑,,, 缺损的临床研究[J].中华口腔医学杂志,2005(3):241— 243. 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(收稿日期:2011—03—01编辑:王冰) 果酸对肝星状细胞内活性氧产生的影响及与 细胞凋亡的关系米 李博,李溺民,何文华,刘志坚,张规和.陈江,刘戈云,张新华,朱萱 南昌大学第一附属医院消化内科(南昌330006) 【摘要】目的体外观察熊果酸对肝星状细胞内活性氧(ROS)的产生,细胞凋亡,NF—KB核易位及x一连 锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响,探讨熊果酸诱导肝星状细胞凋亡的机制.方法取对教生长期的肝 星状细胞(HSC—T6)进行分组,A纽:瘦素(100ng/raL)刺激组;B纽:瘦素+熊果酸(50Ixmo//L)组;C组:瘦素+ N一乙酰一L半胱氨酸(10mmol/L)纽;D组:空白对照组.检测DCF荧光强度(反映ROS水平),细胞凋亡率, NF—KB(P65)核移位率,XIAPmRNA的表达.结果(1)A组HsC—T6细胞内DCF荧光强度明显强于D纽,B, C组细胞内ROS水平明显低于A组(均P<0.001).(2)A组在48h的HSC—T6细胞凋亡率低于D组(P< 0.05);B组在48h的HSC一3"6凋亡率不仅明显高于A组(P<0.001),而且高于C,D组(均P<0.05).(3)A组 细胞NF—KB核移位率显着高于D组(P<0.001);B,C组的NF—KB核移位率均显着低于A组(均P<0.001). (4)瘦素作用Hsc一细24h的XIAPmRNA表达显着高于D纽(P<0.O1);B,c组在12,24h的表达均低于A 组(P<0.01或P<0.05)结论熊果酸能抑制瘦素刺激HSC—T6细胞引起的ROS产生,并能诱导HSC—T6细 胞凋亡,其机制可能与抑制ROS对NF—KB的活化,下调XIAP基因表达有关. 【关键词】熊果酸;肝星状细胞;活性氧;核因子一KB;细胞凋亡 肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的激活是肝 纤维化发病的关键,抑制HSC激活,诱导已活化的 江西省卫生厅科技计划项目(编号:20091008) ?现工作单位:广东省第二人民医院消化内科(广州510317) ?通信作者.电话:0791—8692505;E—mail:jyyfyzx@163.corn HSC凋亡是抗肝纤维化的主要策略之一本课题组 前期研究发现,中药单体成分熊果酸可以抑制HSC— T6细胞增殖,诱导其凋亡,并观察到Bcl一2/Bax比值 下降.Bcl一2家族,细胞凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosisproteins)等细胞凋亡相关基因的表达受核因 ]]]]]]】 l寸l