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TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价

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TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价 TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方 法的建立及评价 ? 376? ? 检验技术与方法? 国际检验医学杂志2011年3月第32卷第3期IntJLabMed,March2011,Vo1.32,No.3 TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价 张志伦,蒲晓允?,吴杰红,傅灵媛 (第三军医大学新桥医院检验科,重庆400037) 摘要:目的建立一种高灵敏度,可见光比色的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定新方法,评价其临床应用价值.方法 以...
TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价
TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价 TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方 法的建立及评价 ? 376? ? 检验技术与方法? 国际检验医学杂志2011年3月第32卷第3期IntJLabMed,March2011,Vo1.32,No.3 TBHBA为色原的丙氨酸氨基转移酶分析方法的建立及评价 张志伦,蒲晓允?,吴杰红,傅灵媛 (第三军医大学新桥医院检验科,重庆400037) 摘要:目的建立一种高灵敏度,可见光比色的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定新方法,评价其临床应用价值.方法 以2,4,6一三溴一3羟基苯甲酸(TBHBA)为色原,在500nm处测定红色醌类化合物的吸光度,与血清中的AIT活性呈正比,并与 IFCC推荐的速率法测定ALT的结果进行比较.结果该方法线性范围为3.0,1000.0U/L,其高值,临界值和低值的不精密 度分别为3.82,4.17,0.32.结论该方法灵敏度高,可用可见光检测,为研制结构更为简单的检测仪器奠定了基础. 关键词:谷氨酸转氨酶;TBHBA;速率法 D0I:1O.3969/j.issn.1673—413O.2Ol1.03.042文献标识码:A文章编号:1673—4130(2011)03—0376—02 丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)被认 为是诊断肝脏损伤最灵敏的指标之一l1].本组根据丙酮酸氧 化酶反应即Trinder_2.]显色原理,建立了以2,4,6-三溴一3一羟 基苯甲酸(TBHBA)为色原测定ALT的新方法,报道如下. 1与方法 1.1仪器及试剂日本奥林巴斯Au一2700型全自动生化分 析仪,北京捷伦酸度计,德国Thermo微量核酸蛋白检测仪 ND20,杭州惠邦设备有限公司反渗透纯水机;丙酮酸氧化酶, 过氧化物酶(Sigma公司),L丙氨酸(上海康达氨基酸厂),酮 戊二酸(国药集团化学试剂有限公司),黄素腺嘌呤二核苷酸, 焦磷酸硫胺素(BIOBASIcINC),4氨基安替吡啉(4AAP,苏 州工业区亚科化学试剂有限公司),TBHBA为自行配制,磷酸 氢二钠(重庆博艺化学试剂有限公司),磷酸二氢钾(重庆北碚 化学试剂厂),校准血清(英国朗道校准品),质控血清(英国朗 道质控品). 1.2反应液的配制0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液内含L 丙氨酸500.0mmol/L,(1-酮戊二酸l0.0mmol/L,丙酮酸氧化 酶4000.0U/L,过氧化物酶4000.0u/L,4一AAP0.5mmol/ I,焦磷酸硫胺素15.0mmol/I,黄素腺嘌呤二核苷酸3O /,mol/L,TBHBA0.5g/100mL. 1.3方法 1.3.1以TBHBA为色原检测ALT反应管中加入200"L 反应液和2L血清,对照管中加入2I蒸馏水,混匀后水浴 10min,用蒸馏水调零,用对照管调试剂空白,取2I反应管 中的液体于Thermo微量核酸蛋白检测仪ND20中扫描最大 吸收峰. 1.3.2紫外酶偶联速率法测定ALT对OlympusAU一2700 全自动生化分析仪进行定标,计算各结果的均值,差和变 异系数(C. 1.3.3线性取ALT活性为1000u/L的血清,用生理盐水 梯度稀释后,分别取2/xL,按本法操作. 1.3.4精密度测定取高值和低值血清标本,批内重复测定 lO次.批问重复,将标本存4?,每2天重复1次,连续测定3 周,共测10次. 1.3.5定值质控血清测定取卫生部I床检验中心定值质控 血清,其定值分别为77,132,50,153,41u/r,允许范围分别为 62,92,106,158,40,60,122,184,33,49U/L,采用本法 通讯作者,E—mail:puxiaoyong@yahoo.corn. 测定. 1.3.6酶反应试剂稳定性试验将酶反应液保存于4?,每 天用于检测质控血清4次. 1.3.7干扰试验维生素C干扰,在血清中加入5,5Orag/L 维生素C;溶血干扰,血清中加血红蛋白2,5g/L. 1.4统计学处理数据用百分率()及?5表示.2组间 比较用样本均数t检验,P<0.05为差异有统计学意义;2种方 法的相关性采用直线相关分析.所有数据统计分析均运用 SPSS统计软件处理. 2结果 2.1最大吸收峰以TBHBA为色原检测ALT,于Thermo 微量核酸蛋白检测仪ND20中扫描得到红色醌类化合物在 500nm处有最大吸收,空白试剂不影响测定. 2.2线性范围酶活性在3.0,1000.0U/L内呈线性(y一 0.9747X+2.1697,r一0.9996). 2.3方法相关性取ALT活性在6.O,1002.0U/L的标本 3o份,分别用本法和紫外酶偶联速率法测定血清ALT,2种方 法进行比较,相关系数r一0.998,y一0.941X一4.448. 2.4批内精密度测定结果测得低值,临界值,高值标本中 ALT活性分别为(32.5?1.24)U/L,(39.6?1.65)U/L, (1034.5?3.27)uN;CV分别为3.82,4.17,0.32. 2.5批间精密度测定结果测得低值,临界值,高值标本中 ALT活性分别为(30.8?1.40),(40.6?1.62),(1006.5? 4.69)U/I;CV分别为4.55,3.04,0.47. 2.6定值质控血清测定结果分别为80,129,54,15O, 45U/L,均在质控范围内. 2.7反应试剂稳定性反应试剂于4?保存,可使用2周. 2.8干扰试验结果在血清中加入5,50mg/L维生素C 后,测定结果与未加者结果差异无统计学意义(P>0.05).血 清中加入血红蛋白2,5g/i后,用本法测定差异无统计学意 义(P>0.05). 3讨论 目前测量ALT的手段包括紫外连续监测速率法,酮体粉 法,赖氏法,但这些方法的影响因素较多.紫外连续监测速率 法在标本出现脂血;,溶血时得出的结果不准确,而且仪器造价 较高,提高了检测成本;酮体粉法因没有严格的测定条件,干扰 因素多,判定结果的反应是定性反应,且误差较大,卫生部 国际检验医学杂志2011年3月第32卷第3期]ntJLabMed,March2011,v0】.32,No.3 1991年已经明令淘汰;赖氏法中酶反应的丙酮酸量和酶活性 之间不能呈现良好的线性关系,而且显色反应的工作曲线弯 曲,不能满足酶活性测定要求.而丙酮酸氧化酶法中,ALT催 化L一丙氨酸和"一酮戊二酸生成丙酮酸和L广谷氨酸,丙酮酸氧 化酶催化丙酮酸氧化生成丙酸和H0z,过氧化物酶再催化 Hz0z,4AAP和TBHBA生成醌亚胺和水,此即为着名的 Trinder反应.醌亚胺的最大吸收峰在500nm左右,通过监测 500nm处吸光度可间接反映丙酮酸的生成量,反映ALT的活 性.本方法具有较高的精密度,测定结果准确可靠,亦有很好 的重复性,ALT活性在3,1000U/L内有很好的线性,且标 本用量少,可相对减少溶血,脂血的干扰,5g/I以内的血红蛋 白对标本测定几乎不干扰,与速率法相比,主要性能指标相差 无几.速率法采用酚试剂作为色原剂,在H0及过氧化物酶 存在的情况下与4一AAP反应生成红色醌亚胺类化合物,此反 应中的摩尔吸光系数为6000,由于1个TBHBA分子比酚多 1个羧基和3个溴,用TBHBA代替酚反应,其摩尔吸光系数 可达到29400l4],因此大大提高了检测的准确性及精密度.丙 酮酸氧化酶法是目前较为理想的ALT检测方法,其结果比较 准确,线性范围宽,重复性好,而且反应生成肉眼可见的红色产 物,用半自动光谱仪检测吸光度时可以避免漏检,采用检测效 率高的可见光检测,大大降低了对仪器的要求,为便携式仪器 的发展奠定了基础刮.但本法也存在影响因素,如血液中的 还原性物质如胆红素,50mg/L以上的维生素C,尿酸可与色 原物质竞争H0,从而消耗反应过程中产生的H:0,使测定 ? 检验技术与方法? ?377? 结果偏低.但综合分析,以TBHBA为色原测定ALT活性 的方法操作简便,结果准确,影响因素少,对仪器设备的要求 低,适合用于临床标本的测量,并可以提高检测的灵敏度. 参考文献 [1]MorenoJM,FdgdinCO.Activityandstabilityofnativeandmodi— fiedalanineaminotransferaseincosolventsystemsanddenatur— ants[J].JMoleCataB:Enzy,1997,2(6):271279. E2]TrinderP,WebsterD.DeterminationofHDL—cholesterolusing2, 4,6tribromo3hydr0xybenzoicacidwith3commercia|CHOD- PAPreagent[J].AnnClinbiochem,1984,21:430—433. [3]倪星忠.临床生化酶试剂方法[M].上海:华东师范大学出版社, 1997:127—128. [4]王则宇,娄斌,班成超.3种丙酮酸氧化酶法试剂盒测定ALT比 较[J].医药论坛杂志,2007,28(1O):96—97. E5]信红霞,杨光,王成英,等.氧化酶法筛查献血者ALT的应用评价 [J].黑龙江医药科学,2009,32(1):50. [6]李学仁.丙酮酸氧化酶比色法测定血清ALT[J].中华医学检验杂 志,1994,17(3):148. [7]范加诚,刘绪华,陈秀丽.丙酮酸氧化酶法在血清ALT活性测定 中的应用评价[J].中国输血杂志,2004,I7(1):50—51. E8]李平,李耀峰.生化检验目前存在问题及对策[J].国际检验医学 杂志,2007,28(8):748,750. (收稿日期:201003—31) 干化学法检测钠离子的实验研究 吴杰红,蒲晓允?,傅灵媛,张志伦 (第三军医大学新桥医院检验科,重庆400037) 摘要:目的研究基于干化学试剂和微型光谱仪技术快速检测钠离子的方法.方法将所配制的电解质钠离子液体试剂 采用干化学法制备,运用速率法的反应原理,测定405nm处吸光度的变化,并对试剂的性能进行评价.结果电解质钠离子液体 试剂冻干后90d内反应稳定性良好,其批内CV%4,批间C<5,回收率为95,105;当血清内胆红素(TB)含量小于或 等于290.40mol/L,血红蛋白含量小于或等于10g/L,三酰甘油含量小于或等于11.20mmol/I时,测定结果未见明显干扰;测 定结果与全自动生化分析仪具有良好的相关性(一0.9543).结论以微型光谱仪干试剂法测定电解质钠离子结果准确可靠, 检测过程简便,仪器试剂携带方便,符合战地救治,基层医疗的需要. 关键词':光谱分析;电解质;钠离子;干试剂 DOI:10.3969issn.1673—4130.20l】.03.043文献标识码:A文章编号:16734130(20l1)03—0377-02 电解质钠离子的测定是临床诊治和抢救的常规及急诊检 测项目,也是军事医学中战地救治研究的重要内容之一.由于 目前适用于野战环境的便携式急救生化仪器非常少,而且与全 自动生化仪配套的电极价格昂贵],因此本组研究了基于干化 学试剂和微型光谱仪技术快速检测钠离子的方法,旨在研制适 合野战,基层等小型医疗机构的便携式检测设备. 1材料与方法 1.1仪器与试剂微型光谱分析仪(重庆大学研制),波长 405nm,吸光度线性范围0.000,3.000;AU一2700型全自动生 化分析仪(日本Olympus公司);ModulyoD-230冷冻干燥机 A通讯作者,E—mail:puxiaoyong@yahoo.COIll. (美国Thermo公司).试剂I:B半乳糖苷酶1.0U/mI,Tris 缓冲液400mmol/L,pH9.0;试剂1I:硝基酚半乳糖苷5.8 mmol/I,Tris缓冲液10.0mmol/L,pH6.0. 1.2方法 1.2.1试剂的干燥及密封取1套用于微型光谱仪的A制检 测杯(光径5ram),底部预置搅拌子,按比例加入试剂I,置于 7o?冰箱过夜,第2天加入试剂?,继续预冻,待2种试剂 结晶后,放入冷冻干燥机真空抽干6h,经过升华,解吸附,于 8.3kPa时取出,将干燥好的检测杯用塑胶加热密封,置于已 放人硅胶的密封袋内保存.
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