(1)荧光素类
Fluorescein
标准荧光素(Reference standard)之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。
Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线,有相对高的荧光吸收,较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。
与其他荧光素类衍生物一样,Fluorescein具有光淬灭率高,pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。
主要应用于聚焦激光扫描微阵列(Confocal laser scanning microscopy)和流式细胞计应用(Flow cytometry)。
FITC
异硫氰酸荧光素,Fluorescein isothiocyanate,是荧光素衍生物的一种,5-FITC较6-FITC更经常使用。
FITC的异硫氰酸基能与氨基反应,可用于标记氨基修饰DNA,一旦形成,产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线,Abs/Em=492/519nm(pH=9.0)。与蛋白的结合力也强。
FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏,不能长久保存。
FITC-Oligo 广泛用于杂交探针;FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序;FITC也经常被用于蛋白电泳检测(即使是毛细管电泳)和荧光能量激发转移测试。
FAM
羧基荧光素,Carboxyfluorescein,是荧光素衍生物的一种,5-FAM较6-FAM更经常使用。
Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester,即5-FAM(NHS)广泛存在于荧光标记试剂盒。
与FITC相比,FAM与氨基反应更快,产物也更稳定,但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。
FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线,Abs/Em=492/518nm(pH=9.0),具有荧光素衍生物的普遍特性,在水中稳定。
5-FAM主要应用于DNA自动测序中,标记其中的d/ddCTP(PE公司),也经常用于PCR产物定量,核酸探针等。
TET
四氯荧光素,Tetrachloro fluorescein,是荧光素衍生物的一种。
TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的,氯原子使FAM的Abs与Em值都产生一定的红移,并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ion Laser激发光源,Abs/Em=521/536nm 。
TET,HEX,FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中,其中TET用于标记d/ddATP,HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP(PE公司)
HEX
六氯荧光素,Hexachloro fluorescein,是荧光素衍生物的一种。
适用于Argon-ion Laser激发光源,Abs/Em=535/556nm。(请参见TET介绍)
JOE
羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素,Carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein,是荧光素衍生物的一种,6-JOE更被广泛使用。
JOE荧光产量高,pH敏感性弱,适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源,Abs/Em=520/548(pH=9.0)
常用于DNA自动测序,标记d/ddATP,也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。
(2)罗丹明类(Rhodamine dye)
R 110
标准荧光素(Reference standard)之一,在其基础上进行结构改造,即可产生一系列罗丹明类衍生物。
与Fluorescein类衍生物相比,罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性,更高的荧光产量以及更低的pH敏感性
罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸,但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭,故大多数不适宜用于标记蛋白。
R110被用于DNA自动测序。
TAMRA
全称羧基四甲基罗丹明,即Carboxytetramethylrhodamine,是罗丹明类荧光素衍生物,6- TAMRA被广泛使用。
TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的,6- TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源,Abs/Em=547/573nm(Ph=8.0),6-TAMRA(NHS)常用于荧光标记试剂盒中。
6- TAMRA主要用于DNA自动测序中。
Texas Red
Texas Red是一个长波长荧光素,与Fluorescein几乎没有波谱重叠,只适合于Ar-Kr Laser的568nm光谱线或He-Ne Laser的594光谱线,比Tetramethylrhodamine和LissamineTM Rhodamine B波长更长,荧光量更高。
Texas Red在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Third labels)。
(3)BODIPY类
BODIPY类荧光素是由分子探针公司开发,以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素,普遍具有荧光产量高,pH敏感性低(无离子变化),光稳定性强以及发射波谱窄的优点,故BODIPY类荧光素已被广泛用于核酸,,脂肪酸,磷脂以及各种受体。同时,由于在电泳过程中对序列片段影响小,故已被逐渐用于DNA自动测序。但相对而言, BODIPY类荧光素并不特别适合标记蛋白.
BODIPY FL可代替Fluorescein
BODIPY R6G可代替Rhodamine 6G
BODIPY TMR可代替Tetramethylrhodamine
BODIPY TR可代替Texas Red
这些BODIPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征,能共用同样的光过滤器与激发光源,但更具优点。
(4)其他荧光素
Cascade blue
Cascade blue是在芘 (pyrene)结构基础上改造得来的,即sulfonated pyrene,它是一种短波长紫外激发荧光素,与另一种常用的紫外荧光素Aminocoumarin相比,Cascade blue的Em与Fluorescein有更小的光谱重叠,有更高的荧光吸收和更大的荧光产量. Cascade blue在376nm处存在第二个吸收峰,水中不稳定。
Cascade blue 主要用于标记蛋白,作为极性示踪子(polar tracer)可进行膜蛋白定位等.但也能用于标记核酸和葡聚糖。Aminocoumarin
一种短波长紫外激发荧光素,通常使用的是7-amino-4-methylcoumarin, 红移现象明显,比Cascade blue有更长的发射波长,肉眼观察明显,更适用于confocal。
1:主要荧光激发光源
Excitation source
Principal spectrum lines(nm)
Mercury-arc Lamp
366,405,436,546,578
Xenon-arc Lamp
250-1000(continous)
Tungsten-halogen Lamp
350-1000(continous)
Cr:LiSAF Laser
430
Helium-cadmium Laser
325,442
Argon-ion Laser
488,514
Nd:YAG Laser
532
Helium-neon Laser
543,594,633
Krypton-ion Laser
568,647
表2:主要荧光素一览表
Dye
Abs/Em Max(nm)
Notes
Acridine orange
500/526
green fluorescence bound to DNA, and red shift to ~650 upon association with RNA, useful for flow cytometry.
FAM
492/518
Most widely used green fluorescein, absorption overlaps the 488 nm spectral line of the argon-ion laser, prone to photobleaching, pH sensitive between pH 5-8,is widely used for automated DNA sequencing
FITC
494/519
Subject to argon-ion laser, widespread use for hybridization, immunoreagent, protein sequencing and FRET
HEX
535/556
pH insensitive, used for automated DNA sequencing
JOE
520/548
Intermediate-wavelength spectra, important dye for automated DNA sequencing.
Lissamine rhodamine B
570/590
Optimal for 568 nm excitation photostable,used in confocal laser scanning microscope.easier to label protein than TMR.
Pyrene
340/378 Excimer:470
Long excited-state lifetime, spectral shifts due to excimer emission,used in protein comformation and oxygen sensors.
ROX
570/590
spectra between Lissamine rhodamine B and Texas Red, used in automated DNA sequencing.
TET
521/536
pH insensitive, used for automated DNA sequencing
Tetramethyl rhodamine
555/580
pH insensitive , photostable,Widely used for automated DNA sequencing
Texas Red
595/615
Suited for the Ar-Kr 568nm and He-Ne 594nm spectra, brighter and lower background than other red dyes as third label, used in confocal laser scanning microscopes
Dansyl Chloride
372/ND
Environmentally sensitive, large stokes shift for protei sequencing
Dabcyl
453/none
Broad absorption, no fluorescence, as a quenching group useful for fluorescence resonance energy transfer (FRET)
CR-6G
525/555
Spectral between fluorescein and tetramethylrhodamine, good photostable, preferred nucleotide off protein
Cascade Blue
400/420
Resistant to quenching upon protein conjugation, Water soluble.
BODIPY R6G
528/547
Substitute for rhodamine 6G,Useful for automated DNA sequencing
BODIPY FL
505/513
pH insensitive, narrow spectral bandwidth, useful for automated DNA sequencing, preferred protein conjugation.
Amino--coumarin
345/445
Widely used blue fluorescent dye, visibly brighter and easier for microscopes