联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响 联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基 质干细胞成骨作用的影响 rf1华创伤骨科杂志2006{r10』J第8奄第10期ChinJO~hopTrauma.October2006.Vo1.8.N0.10?9l9? ? 组织工程与细胞生物力学? 联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓 基质干细胞成骨作用的影响 孙源林红吴子征陈瑜董健 【摘要】目的探讨fIJ骨髓基质}细胞(BMSCs)诱导的内皮细胞(EC)与自体BMSCs共培养时对 BMSCs成骨作用的影响.采用密度梯度离心法分离免BMSCs,培养细胞分为四组:A组(BMSCs组), B组(BMSCs成骨导组),C组(EC诱导组)及D组(BMSCs和诱导的Ec联合培养组),通过干细胞形态,免 疫荧光,细胞增殖,碱性磷酸酶活性及骨钙素含量从酶学,组织学及生化等不同方面观察诱导的Ec对BM— SCs成骨活性及K情况的影响.结果细胞免疫荧光染色证实c组培养诱导的细胞为Ec.倒置相差显 微镜,HE染色均示ECjBMSCs混合生长良好.Mr不检测结果:各组细胞增殖差异无显着性意义(P> 0.05).碱性磷酸酶活性和骨钙素含量检测结果:D组明显高于其它各组,差异有显着性意义(P<0.05). 结论由BMSCs的Ec能够增强BMSCs的成骨活性,提高BMSCs的增殖能力. 【关键词】组织J程;骨髓基质细胞;成骨细胞;内皮细胞;联合培养 Osteogeniceffectsofinducedautologousendothelialcellsonbonemarrowstromalcellsofra bbitsin CO'cultureconditionSUNYuan,LINHong,WUZi— zheng,eta1.DepartmentofOrthopaedicSurgery. ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationl30271262)andFundsofMinistryofEducationforReturned OverseasScholarsl2003.4o61 Correspondingauthor:D0NGJian 【AbstractJ0bjectiveTostudytheosteogeniceffectsofinducedendothelialcell(EC)0nbonemarrow stromalcells(BMSCs)ofrabbitsinCO— culturecondition.MethodsBMSCswereobtainedfromrabbitsbydensitv gradientcentrifugation.Theadhesivecellswerepreservedtopassageinculture.Theculturedcellsweredividedint0 fourgroups:groupA(BMSCs),groupB(BMSCsosteogenicinduction),groupC(ECinduction)andgroupD (CO— cultureofinducedBMSCsandEC).Thecellmorphology,immunofluorescence,cellproliferation,alkaline phosphatase(ALP)activity,osteocalcinsynthesiswereobservedtodeterminetheeffectsofinducedautologousEC ontheosteogenicpotentialandcellularcompatibilityofBMSCs.ResultsTheimmunochemicalstainingshowed thattheBMSCswereinducedintoECingroupC.ThecellularcompatibilityofBMSCsandECwasgood.TheALP activityandosteocalcincontentwereobviouslyhigheringroupDthaninanyothergroups(P<0.05).Thecell proliferationdifferencewasnotobviousbetweengroups(P>0.05).ConclusionsThecellularcompatibilityof inducedosteoblastsandinducedECisperfect.TheECscansignificantlyincreasetheviabilityandALPactivityof inducedosteoblasts. 【Keywords】Fissueengineering;Bonemarrowstromalcells(BMSCs);Osteoblasts;Endothelialcell (EC):C0一CUIture 骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells, BMSCs)是骨组织工程最常用的种子细胞.近年来用 BMSCs复合生物支架修复骨缺损取得了较大成 就,但仍存在大块骨缺损无法修复,长期效果不理想 基金项}I:州家fj然科学基会资助项目(30271262);教育部留学 网围人员培金(2003—406) 作者位:200032f海,复I1大学附属中山医院骨科(孙源,林 红,陈瑜,萤健);J海交通大学附属上海市第一人民医院宝山分院骨 科(吴子征) 通汛作者:萤健 等缺点.其中一个重要原因在于组织工程骨修复骨缺 损的血管化问题尚未解决.故一些学者将BMSCs与 血管内皮细胞(endothelialcell,EC)联合培养以期望 加速组织工程骨的血管化进程. 但目前组织工程血管化所用EC多取材于大血管 或微血管的细胞,可供取材的血管供区来源有限,取 材过程常对机体造成新的创伤;更为重要的是来源于 成熟血管的EC多为终末分化细胞,体外培养扩增中 细胞易老化,扩增数量有限等.因此寻找初期分化细 www.cjot.org ? 920?中华创伤骨科杂志2006年l0月第8卷第l0期ChinJOdhop_rrauma,October2006.Vo1.8.No.10 胞来源的内皮种子细胞已成为组织工程骨血管化的 关键所在.本实验设想通过对自体BMSCs进行EC化 诱导并与其共培养,既达到了取得初期分化细胞来源 的内皮种子细胞,满足共培养血管化的需要,促进骨 质形成,又可以避免以往实验中所遇到的异体或异种 共培养免疫排斥的问题,且取材扩增方便,以期建立 一 种探索高效组织工程化骨的可行方法. 材料与方法 一 ,主要仪器与试剂 DMEM.LG培养基,胎牛血清(Hyclone公司), M199基础培养基(M199培养基10g,20%FBS, NaHCO2.2g,L.谷氨酰胺300mg,维生素c37.5 mg,青霉素10万u,链霉素10万u),地塞米松,维生 素C,B.甘油磷酸钠,M1Tr(美国Sigma公司),percol1 分离液(相对密度1.077)(美国Sigma公司),倒置相 差显微镜(日本Olympus公司),FK506(日本藤泽公 司),细胞检测用试剂:CD31,vWF抗体(康成生物公 司),碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)检测试剂 盒(南京建成公司),骨钙素(osteocalcin,OCN)试剂盒 (东亚放射免疫研究所). 二,BMSCs的原代培养 2,3个月龄健康新西兰大耳白兔(由复旦大学 附属中山医院实验动物中心提供),雌雄不限.2支 氯胺酮加1支安定肌肉注射麻醉,无菌条件下用16 号骨穿针于髂嵴处做骨髓腔穿刺,抽吸骨髓共6 mL,缓慢加入到含有等体积percol1分离液的离心管 中,以2000r/min离心20min,吸取中间乳白色云雾 状有核细胞层,PBS冲洗3次,1000r/min离心6 min,弃上清,加入基础培养液(DMEM.LG培养基, 10%胎牛血清,100U/mL青霉素,100I.zg/mL链霉 素),反复吹打制成单细胞悬液,接种于T.25培养瓶, 置于37?,5%CO饱和湿度孵箱内培养,4d后全量 换液,弃去悬浮细胞,每2,3d换培养液一次,待细胞 融合成单层后用0.125%胰蛋白酶与0.1%EDTA的 混合液消化传代. 三,BMSCs向EC诱导培养及鉴定 取细胞性状较稳定的第2代BMSCs消化,吹打 均匀,更换培养液为内皮诱导培养液[M199基础培 养基,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)10ng/mL,碱性成纤维细胞生长因子2 ng/mL】,2,3d换液持续诱导.融合成单层的细胞用 0.125%胰蛋白酶与0.1%EDTA的混合液消化传 代.2周后,取细胞进行vWF及CD3l免疫荧光检测. 四,实验分组 1.A组(BMSCs培养组):取刚接种的第2代 BMSCs,加入基础培养基(DMEM.LG培养基,10%胎 牛血清),置于37?,5%CO的饱和湿度孵箱内培 养. 2.B组(BMSCs成骨诱导培养组):取刚接种的第2 代BMSCs,加入成骨诱导培养液(DMEM.LG培养基, 10%胎牛血清,10mol/L地塞米松,50I.zg/mL维生素 c,10mmol/LB.甘油磷酸钠,50nmol/LFK506),置于 37?,5%CO的饱和湿度孵箱内培养. 3.c组(EC诱导培养组):取按B组方法诱导所 得的成熟EC作为实验细胞. 4.D组(BMSCs与诱导的EC联合培养组):将第 2代BMSCs与诱导的EC按1:1的比例接种于培养 板中,加入成骨诱导培养液,置于37?,5%CO的饱 和湿度孵箱中培养.每2,3d换液一次. 五,观察指标 1.倒置相差显微镜观察:镜下观察细胞形态和生 长情况. 2.免疫细胞荧光染色:将向EC诱导的BMSCs分 别以2×10个/孔接种于内置玻片的6孔板,制作细 胞爬片.1d后细胞分别行血管vWF和CD31免疫细 胞荧光染色,鉴定EC. 3.组织学观察:将D组细胞以3×10个/孔接 种于内置玻片的6孔板,制作细胞爬片.3d后行HE 染色,观察两种细胞混合生长情况. 4.ALP活性检测:将A,B,c三组细胞分别以2× 1O个/-fL接种于96孔板,而D组每孔中放入2×10 个BMSCs和2×10个诱导的EC,置人37?,5%CO 的饱和湿度孵箱内培养.分别于第2,4,6,8,10,12天 收集细胞,采用对硝基苯磷酸盐法测定ALP活性,观 察诱导的EC对BMSCs的ALP活性有无影响. 5.M1Tr法检测细胞活力:四组细胞消化后,均以 1×10个/孔接种于96孔板,每组24孔.分别于l, 2,3,4,5,6,7及8d,每组取3孔进行M1Tr检测细胞 存活和增殖能力,酶标仪(Bio.Rad,Model550)读取 490nm吸光度(A)值,绘制细胞生长曲线. 6.OCN含量:将A,B,c三组细胞分别以1×10 个/孔接种于6孔板,而D组每孔中放入1×10s个 BMSCs和1×10个诱导的EC,分别收集培养至第7, 14天的各组细胞培养液,OCN放射免疫试剂盒 (鼠抗人)测量OCN量. 六,统计学处理 采用SPSS11.5统计学软件进行分析,数据以 元?s表示,组问比较采用方差分析和q检验,P< 0.05认为差异有显着性意义. WW-~N.cjot.org 中华创伤骨科杂忠2006年10』J第8卷第10期 ChinJO~hopTrauma,October2006.Vo1.8.No.10?921? 结果 一 ,倒置相差微镜观察 1.BMSCs的原代及传代培养:接种后BMSCs在 培养瓶底散在分布,呈圆形,与周围的红细胞和白细 胞相互混杂.5,6d细胞形成集落状,由10,20个细 胞组成,形态为长梭形及多角形,此后细胞集落迅速 增多,呈旋涡状排列.12,14d细胞长成单层,不发生 接触抑制(图1).传代后细胞形态更加单一,5,6d细 胞即可铺满瓶底,细胞排列仍有规则的方向性. 2.BMSCs的内皮诱导培养:原代诱导细胞培养3 d,可见细胞贴壁,但未完全伸展.5,7d后,明显集落 形成,细胞形态小,呈梭形;传代后,细胞逐渐变大,由 长梭形变为多角形(图2a)及典型"铺路石"样EC形 态(图2b). 二,免疫细胞荧光染色 C组细胞vwF(图3a)及CD31免疫荧光染色(图 3b)均为阳性.图3a示胞浆内可见大量发红色荧光的 棒状小体,提示诱导培养的C组细胞为EC. 三,HE染色 D组细胞HE染色可见两种细胞混合生长,细胞 相容性好,BMSCs体积较大,EC体积较小(图4). 四,ALP活性检测 D组细胞ALP活性明显增高(表1).共培养4d 后即可见ALP活性显着增高,随时间延长,ALP活性 增高更明显,10,12d达高峰,明显高于其它各组,差 异有极显着性意义(P<0.01).同时B组的ALP活 性也要高于其它两组,差异有显着性意义(P< 0.05).C组最低. 五,M1Tr法检测细胞增殖活力 各组细胞的生长曲线见图5,第1,2天各组细胞 数量无明显增加,第3天开始细胞数量明显增加,A 组细胞在第6天达到最高峰,B组细胞在第7天达到 最高峰,而D组细胞在第8天时仍继续生长.各组细 胞的增殖能力差异无显着性意义(P>0.05).但后期 D组细胞增殖加快. 六,OCN的分泌量 培养第7天,C组OCN分泌量最低,只有0.12 ng/mL,B组OCN分泌量为1.45ng/mL,D组为2.03 ng/mL,后两者均明显高于A组,差异有显着性意义 (P<0.05);且D组高于B组,差异有显着性意义 (P<0.05).培养第14天,B,D两组的OCN分泌量 均略比第7天时有升高,分别为2.32ng/mL和3.17 ng/mL,两组比较差异有显着性意义(P<0.05),而 A,C两组OCN分泌量无明显改变.(图6) 讨论 临床上用骨移植修复骨缺损的三个基本过程是 移植物的血管化,骨再生及骨端融合.移植物血管化 是关键环节,其作用贯穿于整个移植修复过程,对骨 再生与融合的方式及效果起决定作用?,.为了达到 血管化的目的,有文献报道将成骨细胞与血管EC联 合培养,即促进成骨又能促进血管形成】.但成骨细 胞和血管EC有获取困难,不易分离培养且培养时容 易老化等缺陷. BMSCs是多潜能组织干细胞,在体外特定的诱导 条件下可分化为成骨细胞[61.最近有学者"利用 BMSCs诱导分化成EC,并证明该EC较终末分化EC 有更强的多向分化能力.在骨髓外,BMSCs可与其它骨 髓细胞共同形成血管,生成微环境.我们将BMSCs诱 导而来的EC与BMSCs进行联合培养,这样既可以获 得活性高,数量大及骨组织工程所需的成骨细胞和 EC,又可以避免同种异体或自体之间的排斥反应,疾 病传播等,为骨组织工程种子细胞联合培养提供了一 条新途径.本实验主要观察两种细胞直接接触是否具 有良好的细胞相容性,以及对成骨活性产生何种影 响.为下一步构建组织工程人工骨打下良好基础. 从本实验ALP,OCN检测结果看,D组ALP活性 和OCN含量明显高于其它各组,差异有显着性意义 (P<0.05).而C组本身的ALP活性和OCN含量均 很低,随着时间的延长并不发生改变,表明EC自身不 具有成骨能力,但能够显着增强BMSCs的成骨活性. 表1四组细胞在不同时间点的ALP活性(U/L,j?S,n=6) Tab.1TheALPactivitiesofcellsinthefourgroupsatdifferenttimeintervals(U/L.j?S,n=6) 注:L|jA组比较,P<0.05;与B组比较,P<0.05 ww3v.cjot.org 922 B lsc.] 口诱导B惦Cs 口诱导E(: 1日诱导旺+诱导 l— B~— SE— s—__j }刮1ftj昨f『『1{『JIMIt仰J打J堆I.做F1HaJ-】-JlI|MSL~}『lIheI4l11Il,_…"ril]]ilnI?】Jn【lI……IlIlm_.H1_ 髓.×20fl1hl?in__x200) 2I州?}监晴舒化.多蛐{f;ll{t々?.2rhl?lrich<,1"埘?lIin--llF,ChfM1,bMsL=!'…il_lh1.rlf1IaL 代l'蚍ri<J"iiJi路f""『h}(侧竹排7tl1t,lI【】rl'}ltJI?Iin(IKcIm…H?:strm.I' 层矾能x2001?lIJ…1P*igns?I1【JlIcI】h_|_…JIraqimii.ro~l,~jr?l_x200l 剖3?卦?1他,wFr地硅拔也jrlHg3Immu?ll_r?ltI"I'wFi【1LIL}I1u',nHt,l 1.1l(:l1坦瞳奄光染色…1I?l×400)一IIi…lIllCI)3lii-up(:il}1}.ix400 4『】lI橐包Jj种胞1台.J.K良好FJ4?[……lIsflI_f1#iwllkiIllk"f.grew川ilLIIt? 51地的IK帕MlrI法JFig5.lnItltlPs【IIsiIlIIgnmps{M?}. '割6川胞7.I4._?fl?fI(:fF'ig.6Ill…,t~!ttal一一l?'_.1I】tenI'0rIII"…thhIrH_uI.II?II'e…"…i I=3Iinll~r,-lIhe7tha,l,I14IhcIvf,=3I 这J~,:lld的机制l】J能rI7_以分泌骨形态发i=蛋门 1l?_l1r…IrlII1"_1I_lit?ll?i,i.f{?『l1,进成分化,非 刺黻成骨胞分泌v?,IrlJvE(}IflL管发一}i}l成 过程r起f1川,if以促进EC增吼干?Iftt苻发,.缺 乏则敛严的m茕崎肜lf1l敞宪"I【'一k等i研 究发现Vb:rJ以叫?仳进肜成.J,机制-J'能:于 州:c?Vl-i(:F-I(it竹发过程t『i仃币fiqlJ.通 过州】?)m竹彩成情删m洪.从州泞JE; 成;c誊V1c('【Iu以接f1'?r成'flilJ~技jE柏休fitJ JI乜.魁\I七"Ie{71'{二糟{|【MlI1捻0li粜{11)鱼旧…i督 }L嘲增较悭.期埘州述J堕lIj{址尚 研究嵌[】』J.tt?s(:诱?米的:.BMSC 有良好的细胞Il=l=『镩'r.E能够埘强I{MsIl_lli肖^ . 这种伴外B?c坍导培养怕(:l宴J{J:秤 化骨的m锊化过程.从mfl{,t'提供j的营养, 神经干I_1体液nW挖J此,}{,1(坍的I-CiI]~,ISC联 台培养fI'JflllJJ~,h成为?【I..11帕种1-细胞 参考文献 ~>gearI一r~l[1lll1^llfIl1I?")11rlizi,ltfdf['htgi 中华创伤骨科杂忠2006年10JJ第8卷第10期 ChinJO~hopTrauma,October2006.Vo1.8.No.10 neeringbone:challengesandobstacles.JCellMolMed, 2005.9:72—84. 2DongJ,KojimaH,UemuraT,eta1.Invivoevaluationofa novelporoushydroxyapatitetosustainosteogenesisoftrans— plantedbonemarrow—derivedosteoblasticcells.JBiomedMater Res,2001,57:208—216. 3朱伟南,杨志lIJJ,事秀胖,等.兔骨膜成骨细胞与肾血管 内皮细胞问接』L培养的体外实验研究.叫l旧修复重建外科 杂志,2002,l6:307—3l0. 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(收稿日期:2006—0I一04)(本文编辑:聂兰英) 欢迎订阅2007年《中国矫形外科杂志》 ? 消息? 本刊是F1前fq内忖科期刊中惟一的半月『1J,多年来持面向临床,面向基层的办刊宗旨,突实用性强,信息广,时效性快等 特色,受到广大读行的青睐,2007年本刊继续保持办刊宗旨和主要栏目不变,并增加了"争鸣与探讨","国外信息摘"栏同.定价 变(铜版本每期l0,全年240元;胶版本每期6.25元,全年l50元).邮局只发行铜版本,邮发代号:24—097.本刚编辑部两种版 本均可发行,且常年办理订购,凡没有在邮局订到者,可随时汇款到本刊编辑部办理订购.我们承诺:只要您的收件地址佯细,保证 您按期及时收到.我们愿用热忱的服务,做广大读者的忠实朋友. ft:款地址:山尔省泰安If第88医院骨科研究所杂志编辑部邮编:27l000电话/传真:0538—62l3228E—mail:zgjxwkzz@ public.taptt.sd.cn: 欢迎订阅2007年《I临床骨科杂志》 《临床骨科杂志》(ISSNl008—0287,CN34一l166/R)是骨科专业学术性期刊,双月刊,国内外公开发行,为国家科技部中国科技 统计源期ru(即tft科技核心期刊),中围学术期刊综合评价数据库统计源期刊.本刊主要面向临J爪骨科和卡H关学科医生及研 究人员;宗旨足:以临J术研究为坫,以新技术,新方法,新思想为引导,普及与提高相结合,注重科学性和实川性,旨在解决临床实 际题,促进我旧,fIj'科事业的发展.设有临床研究,技术改进,临床论着,实验与临床,经验教训,方法与应HJ,病例报道,基层临床, 临床护理,综述,临床』}J药及研究动念等栏日.内容翔实,图文并茂,格式,可读性强,铜版纸印刷,A4,i:小,il-义96贞.创刊以 来得到国内外有_火々家的好千?支持,影响网子和被引频次逐年上升.本刊邮发 代号:26一l47,请在当地邮』IJj订.漏订者町直接 m本刊编辑部邮购.每本价9无,伞年价54元.电话:055l一2923l33传真:055l一3664966E—mail:gukezazh@mail.hr.ah.cn, gukezazh@yahoo.corn.cn. www.cjot.org