毕业论文：纤维素酶产生菌的抗阻遏选育及其产酶条件优化（可编辑）

#毕业#：纤维素酶产生菌的抗阻遏选育及其产酶条件优化（可编辑） 毕业论文:纤维素酶产生菌的抗阻遏选育及其产酶条件 优化 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得直昌太堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的。与我一同工作的同志对本研究所做的 任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 ,。日 年 占月 学位论文作者签名手写:徘签字日期:文刃『 学位论文版权使用书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文的规定,有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和 借 阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行 检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名手写:覆霉修. 导师签名手写九羞留场 . , ’ 签字日期:劢、’年月?扫 签字日期:如’年月日摘要 摘 要 纤维素酶是一种多组分复合酶系,一般由内切..,.葡聚糖苷酶、外切 ..,.葡聚糖苷酶和.,.葡萄糖苷酶三种组分构成。纤维素酶自被发现以来就 受到众多学者的青睐,主要是纤维素酶具有非常广泛的应用领域,如食品工业、 纺织工业、畜牧业、能源等,但生产成本高限制了纤维素酶的工业化进程。提 高纤维素酶产生菌的产酶能力和优化生产菌的产酶条件是提高酶产量、降低酶 成本的重要途径。 本文从自然界筛选产酶能力较高的野生菌,通过紫外、微波诱变结合阻遏 剂筛选对其进行抗阻遏选育,获得抗阻遏效能和发酵产酶能力提高的变异菌 株, 利用响应面法对变异菌株的发酵条件进行优化,探讨了纤维素酶的部分酶学 性 质。本文的主要工作内容和研究结果如下: 从沂蒙山区的灌木枯枝、腐土中采样,用羧甲基纤维素刚果红培养基 初筛,然后通过摇瓶发酵测定各菌株的酶活进行复筛,筛选出一株和 相对较高的菌株,通过菌落形态、菌丝和孢子显微形态观察,依据《真菌 护娩 鉴定手册》和《普通真菌学》等书籍的参考,将其初步鉴定为绿色木霉 燃晟。 分别考察了不同浓度阻遏剂甘油、纤维二糖、葡萄糖对绿色木霉生长 和产酶的影响,结果表明:对菌体生长,在%浓度范围内,甘油、葡萄糖、 纤维二糖的浓度越高,菌体量也越大。对发酵产酶,当甘油在.%时能促进酶 的生产,而在%时阻遏酶的分泌;纤维二糖对酶的发酵没有呈现明显的影响; 葡萄糖除.%外,其他浓度均对酶的生产有阻遏作用。经紫外照射,微波 辐射,选育到的突变株相对于原始菌株在相同浓度的阻遏剂下其和 分别提高了%和.%。突变株在生长过程中,菌落由黄色逐渐变为绿 色,呈现黄色孢子。 采用响应面分析法优化绿色木霉变异菌株?的发酵产酶条件。 根据模型预测和实验验证,得到绿色木霉变异菌株.?产酶的响应面模型优 ,且 化发酵条件为微晶纤维素、麸皮和发酵时间分别为. /、. /和 /,。 酶活达. 研究了绿色木霉纤维素酶的部分酶学性质,包括最适温度、最适、 摘要 温度稳定性、稳定性以及甘油、葡萄糖、纤维二糖的影响等,结果显示:绿 色木霉纤维素酶的最适反应温度是?,最适是.左右,酶具有相对较 好的温度稳定性和稳定性;纤维二糖在低添加量下对绿色木霉纤维素酶活 具有促进作用,葡萄糖对纤维素酶的抑制作用明显。 关键词:纤维素酶:绿色木霉;抗阻遏选育;酶学性质 ?仃 鹊. 秒 ,一,. ?,.西肌,,一嬲, 嬲、巧、析眦 印,?. ’弱 ,, 仃, 鼬呵,血弱. 嘶 驴锄 : 嬲 . 】唱 ?时 仃咖嬲. , 曲 ?诵曲 玛 , 嬲也 : ?印 够船巧雠屺.,:删‰ ,锄 驴 肚:. 讹 舶 . 曲 ., ‖, ”, ’’ ”,、懈 乃砌比删口’,咖娩.附胁坶眈晟 . 虢 髓 曲眦璐 ,, . 妯 乃记而沈册口,护矗拓伊。硼锄 、, . , 趾 %,廿 蛐诵: 酉,百, . . ? 嬲.%, 玎位 即巧 , %, 、?弱 彘. 髓 臼. ;. .%, 仃加 印 锄目, . 阳泣 锄 廿鼬 印, 眈 硫嬲 % .%跳. 锄恤鳓池,恤 幽岫舶 眦. 玛也踺’璐 .?嬲冽尉 璐 犯锄. 佗飙 酬玛 舢? .册 .? .撕 眦也 唧 ?,觚 劬 淝圮 鹊.硒 /,. /觚 . /. 缸亿 , ,啪 脱 ,的】 姆,鼬时 ,,? 嬲. 吐廿:廿 懿 妇啪肼戤 弱?. 弱 .. 嬲 啪锄。吼 , 鼬时 鼬吼也.. 嬲 髂鼬 :勰,乃砌比册口护娩,觚?,啦, 目录 目录 第一章绪论.纤维素酶概述 ..前言“ ..纤维素酶的组成与结构 ..纤维素酶的性质 .纤维素酶的生产与用途..纤维素酶的生产 ..纤维素酶的用途??” .纤维素酶产生菌的选育概述 ..纤维素酶产生菌简述 ..纤维素酶产生茵的选育发展现状? .课题来源与研究意义??“ ..课题来源..研究意义.论文研究主要内容一 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定.材料与方法一 ..材料..方法 .结果与讨论” ..葡萄糖曲线的绘制..菌株形态及鉴定.本章小结第三章绿色木霉的抗 阻遏选育 .材料与方法? 目录 ..材料??” ..方法 .结果与讨论..阻遏剂种类和浓度的影响..菌株的组合诱变与抗阻遏选育.. 变异菌株二?的生长形态与产酶能力变化?“ 本章小结第四章响应面法优化绿色木霉变异菌株.?的发酵条件?” .材料与方法? ..材料 ..方法 .结果与讨论? .. 甜.实验设计显著影响因子的筛选? ..显著影响因子的.设计实验优化..变异菌株发酵最佳条件的确定及其检 验? .本章小结第五章纤维素酶的部分酶学性质研究.材料与方法? ..材料 ..方法 .结果与讨论” ..酶的最适“ ..酶的稳定性..酶的最适温度 ..酶的热稳定性 ..葡萄糖对酶的影响?. ..纤维二糖对酶的影响 ..甘油对酶的影响?目录 .本章小结第六章展望? .结论“ .进一步工作的方向” 致谢参考文献 攻读学位期间的研究成果第一章绪论 第一章绪论 .纤维素酶概述 ..前言 纤维素是植物体最主要的组成成分之一,约占植物体干重的.%.%, 据估计,全世界平均每年大约可以生成近亿吨的植物纤维素类物质,被认 为是地球上最丰富的、可再生的有机物质【】。纤维素是由多个葡萄糖残基 以 .,.糖苷键相互连接而成的线性直链聚合大分子多糖,可以在多种水解条件下 如酸解、碱解、酶解等连续断键、解聚,最终分解成为最小单元的葡萄糖 【】。纤维素也可以通过现代生物技术转变为酒精、蛋白饲料等产品。有效开发 和利用纤维素类物质是解决能源危机、粮食短缺、环境污染等日益严重的问题 的最主要的措施和途径之一,也是各国研究机构和学者竞相研究的热点课题【。 纤维素酶嬲,又称纤维素酶系,属于糖苷水解酶,是指能够水解 纤维素并将其转化为葡萄糖的多种组分酶的总称【刮。它自年被 在蜗牛的消化液中发现至今已有上百年的历史,受到众多学者的广泛关注与研 究,纤维素酶的基础研究如酶的氨基酸序列与空间结构、基因的克隆与表达 等、生产研究如酶产生菌的开发、发酵培养及其分离等和应用研究如应 用在食品、纺织、能源等方面等领域均取得了显著的进展睁。。 ..纤维素酶的组成与结构 纤维素酶是由许多的起协同作用的多组分酶构成的体系。从宏观上讲,纤 维素酶可以分为水解酶、氧化酶以及磷酸化酶三大类吲。从微观上,根据纤维 素酶组分的不同功能分,纤维素酶包括以下三种酶类陋,见表.:第一章绪论 表.三种酶组分及特点 幻. 撇 ?巧 锄 名称 特点 也称酶,此类酶主要作用于纤维素分子内部的 非结晶区域,即无定形纤维素,也可以溶解纤维素衍生 内切一,一葡聚糖苷酶 物:此酶通过随机水解纤维素内部的,.糖苷键,将 长链纤维素分子在内部断开,从而形成大量的、具有非 ,一锄?,简称 还原性末端的小分子纤维素;此类酶对末端的敏感性远 小于对中间键的,且不改变产物的构型。 也称酶,此类酶组分主要作用于纤维素中分子 排列较整齐、紧密、难水解的结晶区,也对分子排列不 整齐、松散、无定形的非结晶区域起作用;此类酶与内 外切,葡聚糖苷酶 切葡聚糖苷酶不同,它对纤维素线性分子末端较敏感, 伊,一舔,简称 通过水解线性小分子纤维素的.,.糖苷键,可切下大 量的单个纤维二糖分子,故又称纤维二糖水解酶 觚. 此类酶主要是水解纤维二糖及短链的纤维寡糖,最 终生成葡萄糖,故又称纤维二糖酶笛,简称 ,一葡萄糖苷酶 。虽然此酶对底物特异性不高且含量较低,但却是 ,百弱,简称 “完全”纤维素酶系协同水解纤维素为葡萄糖不可或缺 的组分。 自年代后,纤维素酶分子的一、二、三级结构逐渐被研究者所关注、研 究,尤其是 年等【】利用木瓜蛋白酶处理里氏木霉乃五确如,.所彤嚣 的研究发现,加快了纤维素酶分子结构的研究。大多数纤维素酶分子是由催 化 ,、纤维素结合结构域 结构域如 氓 、连接桥词三部分组成,呈蝌蚪型,其结构模型如图.【.】: 第一章绪论 图.纤维素酶分子结构模型 :催化结构域:连接桥:结合结构域 们躬 盯 .. : : 伽 : 区所示,星球状,是“蝌蚪头部核 催化结构域:如图. 心区,包含了催化位点和底物结合位点;国内外诸多学者通过光衍射、结晶、 蛋白质工程等【.】手段对区进行了多项研究,如提出并验证了外切酶、内 切酶底物特异性的合理性解释,是因为它们的活性中心的位置及其构造等的 区 别;区的主要功能是催化功能,至于其催化机制,【】从化学机制角 度提出双置换机制,后来研究者通过大量的实验证明了此机制。 连接桥【:如图. 区所示,呈杆状,是“蝌蚪的中部区 域,连接“头”与“尾”,决定了“头’’与“尾之间的距离,在一定程度上也 决定了“头与“尾的几何构象,并且也有助于不同“蝌蚪’’间形成较为稳 定的聚合体;此桥高度糖基化,具有较强的韧性,利于“头”与“尾的灵活 运转,富含、、等氨基酸。 纤维素结合结构域【】:如图. 区所示,是“蝌蚪’’的尾 部区域,虽然位于尾部,但却是水解纤维素过程中最先起作用的部分,它可以 使整个纤维素酶分子结合到纤维素分子上,便于催化域对纤维素分子的水解 催 化,但是其连接的机制还有待于进一步的研究。 第一章绪论 ..纤维素酶的性质 纤维素酶是多组分的复合酶系,大致分为酶、酶和.,.葡萄糖苷 酶三种组分,各组分间的理化性质存在较大差异瞄洲,见表.: 表.三种酶组分及性质 曲. 巧 锄 名称 性质 分子量约为.,包括两种同工异构酶 和 ?。 的分子量约为,等电点约为.,末端具有引导肽; ?的分子量约为,等电点约为.,末端具有更多氨基酸 残基的引导肽,?相对于 ,具有产量低、特异性低、活性 孵 高的特点。来源于不同微生物的纤维素酶的分子量是不同的,如阎伯 旭、高培基乃测得 和? 鲋.的 的分子量分别为和,李宪臻等【测得 . 的的分子量为.。的最适温度为?。 分子量约为.,一般认为真菌的也包括两种同工异构 酶 和?。 的分子量约为,其等电点约为., ?的分子量约为.,其等电点为..., 和的末 酶 端均有引导肽,只是前者稍长。的最适温度为?,比 稍高,且具有较好的热稳定性,最适为.。某些金属离子,如 、等对酶具有明显的激活作用。 分子量约为,但是不同微生物来源的其分子量是不同 的,如曲音波等测得斜卧青霉中的分子量约为,杜鹃等【】 测得棘孢曲霉的分子量约为.。的等电点为...,最适温 争,一葡萄糖苷酶 度为.?,最适为左右,在.范围内较稳定。某些金属离 子如、等对具有较强的抑制作用。 纤维素酶对纤维素类物质的降解是一个多组分酶相互协同作用的过程【】。 各组分酶之间是如何起作用的,具有怎样的作用机制,大致有以下几个观点: .观 【】等最早提出了纤维素酶降解纤维素的作用机制,具体的作用机理尚 不清楚,也没有在实验中得到证实,但是它却是对纤维素降解机制提出的最 早 概念,对以后的研究具有重要意义,其基本的作用模式为: 第一章绪论 酶 酶 足糖苷岛歪因 劬 图..作用模型.. ” 顺序作用观 【.等人为代表,提出了顺序作用假说,也没有在实验中得到证实, 其模式为: 图.顺序作用模型.. 协同降解观 纤维素酶降解纤维素的各种作用机制中,目前普遍接受的是协同降解机制, 并且这种降解机制得到了部分的实验证实,其基本的降解模型为:第一章绪论 图.协同作用模型 . ? .纤维素酶的生产与用途 ..纤维素酶的生产 纤维素酶是应用非常广泛的工业酶之一,普遍存在于动、植物体内及微生 物细胞。微生物相对动植物体来说,具有生长繁殖快、生长周期短、生存要求 的条件简单、发酵产物易于分离等优势,受到广大研究者的青睐并对此做了众 多的研究工作。运用微生物生产纤维素酶的过程主要包括微生物发酵产酶和酶 的提取纯化两个关键环节。 微生物发酵产酶过程中,除了需要选择合适的发酵菌株,还要考虑发酵的 原料、发酵的方式、发酵的工艺条件等诸多因素。 第一章绪论 发酵的原料 纤维素是一种具有高聚合度的多糖,一般包括排列整齐的结晶区和排列松 散的非结晶区。纤维素在自然界的含量非常巨大,如秸秆、甘蔗渣、酒糟等 物 质,可通过微生物降解成小分子物质再利用,不仅提高了资源的利用率,而且 还减少了环境污染,具有很大的发展潜力,但因其特殊的结构需要对其进行 发 酵前的预处理。目前对纤维素原料进行预处理的方法主要有物理法、化学法、 生物法及其物理化学法等【?,具体见表.所示。 表.纤维素原料的预处理方法 ’ . 廿 讯砷 特点 预处理方法 物理法是不改变纤维素原料的化学成分,通过 改变其物理结构,来达到降低纤维素原料聚合度的 物理法【?】 一种方式。物理法最主要的是机械粉碎,此外还有 球磨、剪切、挤压等手段。 化学法是使用较多的一种预处理方式,它是利 用一些化学试剂,通过一系列化学反应来影响纤维 化学法【】 素原料的聚合度的。化学法所用的化学试剂有: %的盐酸等稀酸、等碱试剂、氧气等氧化 剂及有机溶剂等。 物理化学法是物理法和化学法联合处理纤维 素材料的一种方法。这种联合处理法具有作用时间 物理化学法【加】 短、处理效率高等优点,主要包括蒸汽爆破自动 水解、氨纤维爆裂、爆裂等手段。 生物法即通过微生物或者酶对纤维素材料进 行处理,其优点有反应条件温和、能耗低、无污染 生物法【】 等,但是微生物的生长周期长,从而处理时间也长, 酶的生产成本也高,因此生物法也有待于进一步的 研究。 发酵的方式 通过微生物产生纤维素酶的过程中,发酵方式的选择是提高纤维素酶的质 量和产量的一个重要因素。目前,微生物发酵生产纤维素酶的方式,主要有液 态发酵【】和固态发酵两种生产方式【,具体见表.所示。 第一章绪论 表.纤维素酶的生产方式 . 刚 躐 生产方式 特点 又称为液态深层发酵骤 ,,是 采用较多的一种发酵生产方式。在长时间研究的基础上,液态 发酵又被优化成补料 咖州切缸发酵、分批。 咖发酵、连续锄 珊锄发酵等 液态发酵】 多个分支。 液态发酵具有发酵原料利用率高、发酵条件易控制、不易 被污染、生产效率高、产品质量更稳定等优点,但缺点是设备 要求高、投入资金多、排除大量的污水等缺点。 固态发酵. 姗咖牡。是指微生物在含 痕量水的固态物料中生长发酵的过程。相对于液态深层发酵 ,,固态发酵具有如下优点:发 固态发酵弓】 酵基质来源广泛、设备要求低、投资少、后续处理污染小等, 但也有如下不足:发酵条件不易控制、易被污染、工人劳动强 度大、产物不易分离提取等。 发酵的工艺条件 优良的发酵工艺条件不仅可以作为微生物正常生长的一个保障,也有利于 提高纤维素酶的产量和质量。因此有众多的研究者对微生物的发酵条件做了 研 究和优化。刘颖等【】对绿色木霉乃砌。虎朋口俯娩.的液态发酵条 件进行了研究,结果表明,当培养基成分为麸皮%、玉米粉%、硫酸铵.%、 磷酸二氢钾.%、吐温. .%,按%的接种量接种,经?培养,测 定其酶活为.,,。王生慧等【】对康宁木霉乃办如朋口切刀喇 .的固态发酵条件进行了探讨,结果表明,当培养基成分为秸秆:麸 皮:、料水比为:、初始为.、.%的尿素,经?培养,测定其 酶活,与基础发酵条件下相比,酶活提高了.%,.葡萄糖苷酶提高了 .%。 不同微生物发酵工艺条件的探讨因素是大体一致的,一般包括碳源、氮源、 发酵基料初始值、表面活性剂、瓶装量、接种量、发酵温度、发酵时间、 通气量等。纤维素酶是一种诱导酶,在培养基中添加适当的诱导物,如纤维二 糖、槐糖、山梨糖等,可诱导纤维素酶的合成,有利于提高纤维素酶的产量【。】 第一章绪论 纤维素酶是一种多组分酶系,是微生物的一种代谢产物,存在于微生物细 胞内或细胞外的培养基中,因此需经提取、分离、纯化等处理后才能获得较 高 纯度的纤维素酶‘删,其处理流程如图.: 析 图.纤维素酶的分离纯化流程图弱 砸撕 .. ..纤维素酶的用途 自年被发现以来,纤维素酶之所以受到广大研究者的兴趣与关注,在 很大程度上,取决于纤维素酶重大的实用价值。目前,纤维素酶被广泛应用于 食品、纺织、畜牧、能源等领域【舵。 纤维素酶在食品工业的应用 纤维素酶应用的一个重要方向就是食品工业领域,且应用非常的广泛,它 可被应用于果蔬、茶叶、油料作物等的加工过程,也可被应用于酒类、醋、 酱 第一章绪论 油等的酿造过程。 纤维素酶之所以能被广泛的应用于食品工业的多个加工、生产过程,原因 可能有:纤维素酶可以减少果蔬加工过程中风味和营养的流失,并能部分地软 化植物组织,便于消化、吸收【】;纤维素酶预处理茶叶,有利于茶叶的浸提过 程,也有助于微生物的发酵,缩短发酵时间,提高茶叶的风味唧】;纤维素酶不 仅能够提高油料作物的产油率,也能因温和的酶反应条件而提高了产品的质量 【;纤维素酶添加到酒类的生产中,既提高了原料的利用率和酒的产出率,又 提高了酒的口感和香味【删;纤维素酶应用于醋和酱油的生产中,除了提高利用 率和产出率,还可以加快发酵速度,缩短发酵时间,提高产品的色度、香味等 风味【。 纤维素酶在纺织行业的应用 纤维素酶是近十几年在纺织品的后加工过程中引入的一种非常有效的生物 酶。适量纤维素酶的添加,大大改善了纺织品的外观和手感,使其更光洁、柔 软,从而大大提高了纺织品的性能和附加值;纤维素酶是一种生物酶制剂,它 的添加不会产生环境污染,也就不会增加纺织品生产的环保负担,具有广泛的 应用前景,也越来越受到重视【醴删。 纤维素酶在纺织行业有着较为广泛的应用,它主要应用在:纤维材质的改 性,增大纤维素的无定形区;真丝的脱胶,增加丝织品的柔软手感;染整的精 炼等过程,提高染色的效果和产品的档次。 纤维素酶在畜牧业中的应用 纤维素酶如何广泛有效地应用于畜牧业中,众多的学者做了很多的实验研 究,大多集中于将纤维素酶作为饲料添加剂对各种牲畜进行饲喂实验,结果表 明:添加适量的纤维素酶,可提高奶牛的产奶量和饲料的利用率,可提高绵羊 的体重和羊毛产率,可提高梅花鹿的鹿茸产量和粗蛋白、酸中性洗涤纤维 的含量等【。 纤维素酶可作为饲料添加剂饲喂牲畜,并有非常积极地效果,原因可能有: 补充动物体内纤维素酶的量,促进其对纤维素原料的酶解和吸收;改善消化道 内的菌群关系,促进有益微生物的生长;提高某些蛋白和脂肪的消化以及对矿 物质和营养物质的吸收等【。纤维素酶对牲畜影响的机理、纤维素酶饲喂牲畜 的方式及条件等深层次的问题需要进一步的研究。 纤维素酶在新能源领域的应用 第一章绪论 随着世界性工业化程度的逐步提高,能源成为当今社会赖以生存和发展的 一个重要基础;石油是最符合能源需求的资源,但是石油资源是非常有限的, 有科学家预测,到年,全社会原油的生产将由目前的每年亿桶下降到 亿桶【】;石油的形成需要特殊的环境条件和漫长的年代,当今不再具备其形成 的条件;石油作为燃料被燃烧后会致使大量氮氧化物、硫化物等有害气体以及 碳氧化物、甲烷等温室气体排放,对人类生存环境造成污染。燃料乙醇作为一 种绿色、可再生资源,逐步受到世界各国的广泛关注和研究。 燃料乙醇是以玉米、薯类、糖类作物等为原料,经发酵、分离、蒸馏、脱 水获得的,在燃料乙醇中添加适量的变性剂,可与汽油按比例混合作为汽车的 燃料使用。燃料乙醇按原料来源的不同可大致分为粮食燃料乙醇和非粮燃料乙 醇,粮食燃料乙醇是指生产燃料乙醇的原料为玉米、甘蔗、小麦等粮食类物质, 非粮食燃料乙醇是指生产燃料乙醇的原料为农作物秸秆、各种来源的废料等纤 维素类物质。燃料乙醇的发展决不能与人争粮、与粮争地,因此非粮方向成为 燃料乙醇的发展趋判。 纤维素类物质在自然界中是最丰富、最廉价的可再生资源,纤维素类物质 的有效转化利用,不仅能够降低燃料乙醇的生产成本、提高燃料乙醇的发展进 度,更有助于解决粮食紧缺、能源危机、环境污染等重大世界问题。纤维素类 物质生产燃料乙醇的工艺主要包括以下三个阶段:第一章绪论 图.纤维素生产燃料乙醇工艺示意图 . .. 锄 .纤维素酶产生菌的选育概述 ..纤维素酶产生菌简述 纤维素酶在自然界的分布非常广泛,存在于微生物、某些脊椎动物,甚至 是高等植物体内。自然界中纤维素类物质的生物降解主要依赖于产纤维素酶的 微生物来完成的,能产生纤维素酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌等。 细菌类 在能够产生纤维素酶的细菌种群中,人们研究较多的有:纤维弧茵属 &肌汤,.幻、纤维单胞菌属&砌如川船甜、芽孢梭菌属?护砌甜掰等。 通常可以把产生纤维素酶的细菌分成三大类:厌氧性纤维素降解细菌、好氧性 纤维素降解细菌和嗜碱性纤维素降解细菌【.。细菌产生的纤维素酶一般是中性 第一章绪论 的,或者是碱性的,因此对天然纤维素的降解作用就比较弱,却可应用于纺织 业和洗涤剂业,也具有较高的经济价值和应用前景。在好氧条件下,细菌类对 纤维素的降解能力远低于真菌类,但是厌氧条件下,纤维素的降解主要依靠 细 菌类微生物【】。如在草食动物,尤其是在反刍动物的胃中就存在大量的厌氧 性 纤维素降解细菌,有助于草食动物对纤维素食物的消化吸收。 真菌 真菌类微生物的生长状态和降解纤维素的效果都比较稳定,所产生的纤维 素酶的酶系较全、酶活较高,受到人们的关注和重视,被认为是降解自然界中 纤维物质的主要菌群。人们研究纤维素酶产生真菌较多的有:木霉属 乃砌沈聊放、青霉属讲”、曲霉属彳印批等。其中研究较 多的菌种有:里氏木霉彤、绿色木霉,护娩、斜卧青霉只比“肌瑚、 黑曲霉么.,瓣,.等。 放线菌 放线菌是自然界分布范围较广的一类原核微生物,介于细菌和真菌之间。 今年来,人们对放线菌的研究比较少,其中产量较高的有:黑红旋丝放线菌 似砌。叼馏鲫所肠行 弦船、生二素链霉菌幻刀移,册加招瑚、玫瑰色 放线菌似巧托。叼,,旃傩幻打淞和纤维放线菌似舱?移,酷卯砌肠孵等【。 放线菌产生的酶活性较高,且为单细胞,结构简单,便于分析。因此放线菌具 有很大的潜在价值和研究意义。 ..纤维素酶产生菌的选育发展现状 纤维素酶自年被发现以来就受到广泛关注,人们致力于利用微生物发 酵的方式来生产纤维素酶的实验研究,其中研究最多的是纤维素酶产生茵的 选 育,这是降低纤维素酶的生产成本、提高纤维素酶的产量与质量、扩大纤维 素 酶的应用范围的基础性工作,也是关键性环节。 纤维素酶产生菌的自然筛选 通过一定的筛选方法从自然界中获得野生菌株,是菌株选育工作的最原始、 最基础的方法,也是构建菌种数据库的有效方法,因此很多的学者对此作了 大 量的工作。 年,等【刀首次从土壤中分离筛选到了一株降解纤维素的菌 第一章绪论 株。 年,广州省微生物研究所【】筛选到一株纤维素降解菌,鉴定为长梗木 霉删.,并对长梗木霉纤维素酶的产生和提取进行了研究和探讨。 年,杨礼富等【】从海南采集的份土样中筛选到降解纤维素和木质 素的菌株各两株,经初步鉴定,降解纤维素的菌株是木霉属乃纠娩硎口.、 青霉属刀缸肋姗.,其酶活分别是和;降解木质素的菌 株是链霉菌属黄色链霉菌勋印幻缈甜月删淞、毛霉目霉幻册印厅伽。胛秒 .。 .,其木质素酶活达到.和 年,江玉姬等【】从香菇地下土壤中分离筛选到株真菌,对其进行 了摇瓶发酵培养,测定了其吸光度并以吸光度的大小为代表比较了它们的酶 活 大小,其中真的酶活最高。 年,林远声等【】从污泥中分离筛选到株降解纤维素的真菌,根据 株菌的茵落、菌丝形态观察,初步鉴定为株赤酵母属的,株圆形酵母属的, 还有株黑曲霉。 年,徐昶等【】利用刚果红选择性培养基从腐土中筛选到一株产纤维素 酶能力较高的菌株,经菌株的形态特性和基因序列分析,鉴定为灰绿 曲霉彳印喇刀淞砌甜淞。 年,余永红等【】从豆渣分离到一株产较高纤维素酶的菌株,经菌落茵 丝形态特性观察,初步鉴定为面包串珠霉胁刀,口咖办妇腑脱。 年,魏亚琴等聊】从兴隆山国家自然保护区采样,经分离纯化最终筛选 到株纤维素酶产生菌,并初步鉴定了其中的株菌,分别为株青霉、株 木霉、株根霉、株放线菌。 纤维素酶产生菌的诱变选育 从自然界中分离筛选到的野生菌株往往存在一些缺陷,如酶活不高等,因 此人们借助某些诱变手段,如物理的紫外诱变、化学的亚硝基胍等,对筛选到 的菌株进行诱变选育,以期待获得更优性能的突变菌株。 年,中国科学院上海植物生理研究所【对筛选到的纤维素酶产生菌进 行选育,并研究了其固态发酵条件。 年,宋小炎等删以拟康氏木霉为出发菌株,采用紫外诱变结合含葡萄 糖阻遏剂平板筛选的方法进行了逐级诱变,获得了一株具有部分抗葡萄糖阻 遏 能力的突变株二?,其和分别达到./和./,分别是 第一章绪论 出发菌株.倍和.倍。 年,管斌等【】以里氏木霉.为原始出发菌株,运用紫外照射、亚 硝酸钠与紫外照射联合、亚硝基胍反复多次诱变的方法,以.脱氧葡萄糖为代 谢阻遏物来筛选,获得一株具有抗分解代谢阻遏的变异株,其、分别 达到. /,、./札,均比原始菌株提高了约倍。 年,董志扬等【黯】以康宁木霉为出发菌株,采用射线和亚硝基 胍交替处理,获得一株产纤维素酶能力明显提高的突变株,比出发菌株提 高了.倍,当稻草粉:麸皮为:、牛肉蛋白胨.%、为...,. ?培养天,其可达到/,具有较高的酶活水平。 年,王金华等【趵】采用紫外线对米曲霉.的原生质体进行诱变处理, 获得一株产酶较高的变异菌株,其纤维素酶活达一.血,相对于出发菌 株提高了.倍。 年,张年凤等凹】以黑曲霉为出发菌株,采用紫外和的对其 进行联合诱变,选育到一株.的变异菌,其达到.儋,是出发 菌株的.倍。 年,张强等【】以绿色木霉为出发菌株,采用核诱变对其进行诱 变,获得一株产酶能力较高且适合液体深层发酵的菌株.,当微晶纤维素 .%、麸皮.%、./,?培养天,测定其酶活达./。 年,兰时乐等【蚓采用微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂对绿色木 霉出发菌株进行逐级连续的诱变,筛到酶活最高的突变株,使其 、比出发菌株分别提高了%、.%。 年,侯红萍等【】为进一步提高筛选到的黑曲霉的酶活,对其进行 了微波诱变,获得的突变菌株的达到了./,比原始菌株提高 了.%。 年,陈淑丽等【】选用的激光波长对绿色木霉的原 生质体进行诱变,结合微晶纤维素的筛选,获得一株产纤维素酶较高的变异 菌 .%、 株,进而优化了其发酵条件,当艮%麸皮%、吐温. 瓶装量时,达到.『,较出发菌株提高了.%。 年,高珍娜等【】筛选到一株具有较高纤维素酶能力的耐高温霉菌, 并以此为出发菌株,结合紫外和硫酸二乙酯进行诱变选育,最终筛到一变异 菌 株,其比出发菌株提高了.%。 第一章绪论 .课题来源与研究意义 ..课题来源 本课题属于导师自选课题。 ..研究意义 本课题旨在通过紫外、微波诱变结合阻遏剂筛选对绿色木霉野生菌株进行 抗阻遏选育,获得抗产物阻遏效能和发酵产酶能力提高的变异菌株。主要的 研 究意义有: 丰富纤维素酶产生菌的已知菌库 自然界中纤维素类物质的降解主要是由多种微生物共同完成的,这类纤维 素降解菌可能自身就具有较高的产生纤维素酶的能力。纤维素酶产生菌在自然 界分布极其广泛,且种类非常丰富众多,从大自然界菌库中筛选高产酶能力的 菌株是丰富人类已知菌库的重要途径和手段,也为进一步的实验研究提供实验 材料和打下物质基础。 为微生物代谢调控机制研究提供实验支持 从自然界筛选到一株野生菌株,经菌落菌丝形态学初步鉴定为绿色木霉 ,护妇瑚跋 ,研究了葡萄糖、纤维二糖、甘油等对绿色木霉产生纤 维素酶的阻遏效应。葡萄糖既是菌株生长的重要碳源,又是纤维素酶水解的最 终产物之一,对绿色木霉产生纤维素酶的发酵过程具有强烈的抑制作用;纤维 二糖作为纤维素酶水解的中间产物,对绿色木霉产生纤维素酶的发酵过程具有 一定的抑制作用,但又是菌株生长的碳源之一,能促进菌株的生长,从而促进 纤维素酶的分泌,因此纤维二糖对绿色木霉产生纤维素酶的发酵过程的影响具 有复杂性;甘油作为纤维素酶水解的竞争性抑制,又是菌株生长的碳源之一, 对绿色木霉产生纤维素酶的发酵过程具有一定的抑制作用。 通过诱变处理损伤菌体,用较高浓度阻遏物质的培养基修复受损细胞,以 提高绿色木霉对阻遏物质的抵抗性能。实验研究结果表明,绿色木霉变异菌株 二?对葡萄糖的抗阻遏能力显著提高,产纤维素酶的能力也相应的提高。即 从代谢调节途径对纤维素产生菌的发酵产酶过程进行调控,进而提高菌株的产 第一章绪论 酶能力。 降低纤维素酶的生产成本 纤维素酶自被发现之日即受到广大研究者的青睐,主要是由于纤维素酶具 有非常广泛的应用领域,如食品工业、畜牧行业、能源领域等,但是过高的生 产成本严重制约了纤维素酶的工业化进程。为提高纤维素酶的产量、降低纤维 素酶的生产成本,主要有以下途径:对纤维素类物质进行预处理、提高纤维素 酶产生菌的产酶能力、优化纤维素酶产生菌的发酵产酶条件和提高纤维素酶的 使用效率等。 本文实验研究对野生菌绿色木霉进行抗阻遏选育,提高了绿色木霉变异菌 株二?的产酶能力,进而对绿色木霉变异菌株?的发酵条件进行了优 化,最后研究了纤维素酶粗酶液的部分酶学性质,以提高纤维素酶的使用效率。 从三个方面研究降低纤维素酶的生产成本。 .论文研究主要内容 本课题旨在筛选产酶能力较高的野生菌,通过紫外、微波诱变结合阻遏剂 筛选对其进行抗阻遏选育,获得抗产物阻遏效能和发酵产酶能力提高的变异菌 株,并利用响应面法对变异菌株的发酵条件进行优化。本文的主要研究内容有: 利用纤维素酶产生菌的筛菌方法,从自然界中筛选到产纤维素酶能力 较高的菌株,并进行分类鉴定。 通过紫外、微波诱变结合阻遏剂修复筛选,对筛选到的野生菌株进行 抗阻遏选育,以获得抗产物阻遏效能和发酵产酶能力提高的变异菌株。 考察选育到的变异菌株的发酵产酶条件,并利用响应面法对其发酵条 件进行优化,以提高其产酶能力。 对绿色木霉发酵液离心得到的粗酶液的部分酶学性质进行研究。 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 纤维素酶具有广泛的应用领域,但过高的生产成本和较低的产量限制了纤 维素酶工业化进程【孵】。纤维素酶的生产过程主要包括微生物发酵生产纤维素 酶和纤维素酶组分的分离提取纯化,在第一个过程中,主要考虑的因素有纤维 素酶产生菌的选育、原材料的预处理及发酵工艺条件的研究。通过各种方法对 纤维素酶产生菌的选育而获得具有高产纤维素酶能力的菌株,是降低纤维素酶 的生产成本、提高纤维素酶的产量的重要手段和措施。 自然界中,纤维素类物质的生物降解主要是通过微生物来完成的。纤维素 酶产生菌的筛选鉴定工作是菌株选育中最基础的环节,也是从自然界丰富的微 生物资源中收集产生纤维素酶菌株的有效手段。 本文从沂蒙地区山村取样,经过初筛、复筛等过程,获得了一株产纤维素 酶能力较高的菌株,其测定其和分别是. /,和. ?,,经对其菌落和菌丝显微形态进行观察,并参考有关书目,将其初步鉴定 为绿色木霉 ,护娩船麟。 .材料与方法 ..材料 试剂 表.试剂名称、规格及生产厂家 . 锄协咖 枷,撕锄 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 ??一 . 金山县兴塔化工厂 硫酸亚铁 . 金山县兴塔化工厂 硫酸锰 . 上海勤工化工厂 氯化钴 . 天津市永大化学试剂开发中心 硫酸锌 . 远航试剂厂 刚果红 . 天津市博迪化工有限公司 磷酸氢二钠 . 金山县兴塔化工厂 硫酸铵 . 天津市大茂化学试剂厂 葡萄糖 . 国药集团化学试剂有限公司 羧甲基纤维素钠 . 江西科达精细化工厂 柠檬酸 . 中国医药上海化学试剂站 醋酸钠 . 天津市永大化学试剂开发中心 醋酸 . 湖州市生物化学有限公司 。?二硝基水杨酸 . 广东西陇化工厂 氢氧化钠 . 天津市大茂化学试剂厂 酒石酸钾钠 . 广东西陇化工厂 苯酚 . 天津市大茂化学试剂厂 亚硫酸钠 仪器 表.仪器名称、型号及生产厂家 弛搭 . 觚 锄,勰 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 培养基 表.培养基名称及成分 曲. 名称 成分 羧甲基纤维素钠 . ,葡萄糖.,蛋白胨,州如 . . . . , , , ,? 富集培养基 . . . ,删 ,。 ,? , . ,蒸馏水,自然。 羧甲基纤维素钠 ,刚果红. ,琼脂 , . . . . , , , ,? 刚果红筛选培养基 . . . . ,‘ ,。 ,. , ,蒸馏水,自然。 羧甲基纤维素钠 . . , , , . . . . ? , ,? ,? 液体发酵培养基 . . . ‘ ,’ , , ,蒸 馏水,自然。 葡萄糖,琼脂,马铃薯汁,自然。 斜面培养基 以上培养基均在?下灭菌 溶液配制 表.溶液名称及配制方法 ’ . 廿 ? 帅柚 陀啪 名称 配制方法 准确称取.的磷酸氢二钠和.的柠檬酸,溶解 .柠檬酸缓冲液 于蒸馏水中,定容于。第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 准确称取.的羧甲基纤维素钠溶于蒸馏水中, 溶液 加的柠檬酸缓冲液,再定容至。 准确称取醋酸钠.,量取醋酸.,溶解于蒸馏 . .醋酸缓冲液 水中,定容至。 中, ,.二硝基水杨酸于 准确称取. 加入酒石酸钾钠的热溶液.瞻酒石酸钾钠溶于水 显色溶液 中,再加入.苯酚和.亚硫酸钠,溶解冷却,定容至 。 葡萄糖在?下烘至恒重,准确称取.,溶于 咖葡萄糖标准液 蒸馏水中,定容至。 ..方法 纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 筛选及鉴定的流程为:采样一富集一初筛一复筛一鉴定一保存。 ?采样:从沂蒙山地区的枯枝朽木、落叶腐土及作物秸秆堆中采样。 ?富集:将采集到的土样放在含有一定量生理盐水的三角瓶中,在眦/ 摇床中震荡,取一定量的菌液加入到富集培养基中,于/摇床中培养 。 ?平板初筛:取适量培养的菌液,涂布于刚果红筛选培养基平板上, 倒置于霉菌培养箱?下培养,并时常进行观察记录。 ?摇瓶复筛:对于在刚果红筛选培养基平板上具有较大水解透明圈的菌株, 经分离纯化后,接到液体发酵培养基中进行摇瓶发酵产酶测验,筛选出具有 产 酶能力较高的菌株。 ?菌株鉴定:经过初筛、复筛选取到产酶能力较高的菌株,考察其菌落菌 丝形态特性,再参阅文献或书目进行鉴定。 ?保存:鉴定好的菌株,经分离纯化后,接种到斜面培养基上进行保 存。 酶活的测定 和的测定,方法步骤参照国标、颜淑芳等文献?唧并稍加修 改。 ?葡萄糖标准曲线的绘制 取支洁净、干燥的具塞比色管,按下表流程进行严格的操作: 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 表.葡萄糖标准曲线绘制方法 ’袖. 甜 ? 删 西? 编号. . . 蒸馏水 . .. . 葡萄糖标准液 . . . 柠檬酸缓冲液显色液 沸水浴 冷却后定容至 ,摇匀,于 波长下测定吸光度 ?酶活的测定: 发酵结束后,发酵液经岫 离心后,上清液即粗酶液用来测 定酶活大小,其具体步骤按下表: 表. 忙和测定方法 ’ . 酏觚 测定 :测定 编号 实验管 对照管 编号 实验管 对照管 柠檬酸缓冲液 醋酸缓冲液 卜滤纸 粗酶液 粗酶液 ?水浴 ?水浴 粗酶液 粗酶液溶液溶液 沸水浴 沸水浴 冷却后定容至,摇匀,于姗波长 冷却后定容至,摇匀,于姗波长 下测定吸光度 下测定吸光度 酶活定义:在 内催化底物水解生成 葡萄糖所需的酶量第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 为 。其酶活计算公式为: . 酶活?×/ 其中:为实验管的葡萄糖含量, 为对照管的葡萄糖含量, 为酶反应作用时间。 .结果与讨论 ..葡萄糖标准曲线的绘制 . . 越. 蓟 . 葡萄糖含量/ 图.葡萄糖标准曲线 追.. 洳?她删啷 根据吸光度的大小随着葡萄糖含量的升高而增大,以葡萄糖的含量 为横坐标,吸光度的大小为纵坐标,绘制葡萄糖的标准曲线,如图.所示, 其值达.,说明吸光度的大小与葡萄糖的含量呈线性关系。葡萄糖标 准曲线的精确绘制是纤维素酶酶活测定基础环节。第二章纤维素酶产生菌的 筛选及鉴定 ..菌株形态及鉴定 经过刚果红平板的初筛和摇瓶发酵的复筛获得株产酶能力相对较高的菌 株,摇瓶发酵后测定其和分别是. ,,和. /。其 生长菌落初期、后期以及菌丝、孢子的显微形态如图.至.所示。 图.菌落初期形态图 图.菌落后期形态图 培. 圮?? 埘讪盯 .. ? 呻醪 图.菌丝形态图 图.孢子形态图 培. 啪印彰 舀. 帕珊呻口 从图.到.中看出,菌株生长比较旺盛,在菌株生长的初期,菌落呈白 色棉絮状,在菌落周围有变色水解透明圈,在菌株生长后期,形成多个孢子集 中环,且环的宽度是基本一致的,从外到内,颜色逐渐加深,由绿色到墨绿色; 菌丝和孢子的显微形态显示,分生孢子梗直立,顶端不膨大,且略呈弯曲状, 上生分生孢子团,一个或多个分生孢子,分生孢子球形至卵形。根据参阅:真 第二章纤维素酶产生菌的筛选及鉴定 菌鉴定手册》与《普通真菌学》,发现与绿色木霉的生长习性和形态最为相 近, 因此初步鉴定菌株为半知菌亚门,丝孢纲,丝孢目,丛梗孢科,木霉属,绿色 护沈尸,苫:, 【卜】。 木霉 .本章小结 从沂蒙地区采样中,利用刚果红分离平板初筛和摇瓶发酵复筛,筛选到一 /和. 株产纤维素酶能力较高的菌株,其和分别是. ,护娩 /。经对菌株的菌落和菌丝显微形态观察,初步鉴定为绿色木霉 孓飞通 第三章绿色木霉的抗阻遏 第三章绿色木霉的抗阻遏选育 纤维素酶是一种诱导性酶,它的产生既受到某些诱导物的诱导作用,也受 到某些阻遏物的阻遏作用。近年来,纤维素酶的合成代谢调节受到人们的广 泛 关注,成为纤维素酶研究领域的一个热点,人们通常在培养基中添加某些诱 导 物,如槐糖、山梨糖等,来提高纤维素酶的产量;也会通过各种诱变手段来选 育能够抗阻遏的变异菌株,以提高菌株的产纤维素酶的能力。 有研究表明吲,某些代谢产物如葡萄糖、甘油等容易对纤维素酶的合成起 到阻遏作用,当培养基中含有一定浓度的葡萄糖、甘油等代谢物质时,菌株就 难以再进行纤维素酶的合成;纤维二糖的作用较有争议性,有的学者【】认为 纤维二糖是一种诱导物,对纤维素酶的合成起到促进作用,有的学者【】认为纤 维二糖作为纤维素水解过程中的中间产物,对纤维素的水解具有反馈抑制作用, 进而对纤维素酶的合成起到抑制阻遏作用。 本实验首先通过菌株酶活比较,选择阻遏剂的种类及其浓度;再利用紫外 和微波辐射诱变,结合阻遏剂平板的筛选,选育出产酶能力有所提高的变异菌 株;对选育出的变异菌株进行菌落、菌丝形态的观察及其产酶能力和抗阻遏能 力的考察。 .材料与方法 ..材料 菌株 绿色木霉协如尸册蹦。第三章绿色木霉的抗阻遏 试剂 表.试剂名称、规格及生产厂家 锄. ’曲. 锄,锄 一?????? 规格 生产厂家 名称 天津市大茂化学试剂厂 . 甘油 . 国药集团化学试剂有限公司 纤维二糖 . 湖州市生物化学有限公司 .?二硝基水杨酸 . 国药集团化学试剂有限公司 羧甲基纤维素钠 重堕蔓型 垒:垦 一. ... 塑墨塾 ????。。’’’’????????????????一 仪器 表.仪器名称、型号及生产厂家 锄曲盯陪 . 瑚 锄懿,觚 ????????一 生主窒 型呈 名称. ????????????????????????一一 上海顾村电光仪器厂 三用紫外分析仪. 上海精宏实验设备有限公司 霉菌培养箱. . 国营江西仪器总厂 生物显微生物镜 / . 苏静集团安泰公司 生物安全柜 上海精密科学仪器有限公司 电子天平 .垩耍垦璺堂堂垡墅叁里 翌竺:望旦 ????。。。。。。。。。?????????一一 童童墼主皇王旦篁 培养基 表.培养基名称及成分 啪 ’ . 锄 一?一???????????????????????????????一 成分 名称 ????????????????????????????????????????????????????一 ,琼脂 , 羧甲基纤维素钠 ,刚果红. . . . . , , ,. . ,’ ,。 ,? 阻遏筛选培养基 . . ,不同浓度的阻 , ,? 遏剂,蒸馏水,自然。第三章绿色木霉的抗阻遏 羧甲基纤维素钠 . . ,? , , . . . ,: ,’ , 发酵产酶培养基 . . . ‘ ,‘ ,? . , ,蒸馏水,自然。 葡萄糖,琼脂,马铃薯汁,自然。 菌种保藏培养基 以上培养基均在?下灭菌 溶液配制 表.溶液名称及配制方法 . 锄 名称 配制方法 准确称取.的磷酸氢二钠和. .柠檬酸缓冲液 的柠檬酸,溶解于蒸馏水中,定容于。 准确称取.的羧甲基纤维素钠溶于 溶液 蒸馏水中,加的柠檬酸缓冲液, 再定容至。 准确称取醋酸钠.,量取醋酸 . .醋酸缓冲液 .,溶解于蒸馏水中,定容至。 准确称取. ,.二硝基水杨酸于 显色溶液 中,加入酒石酸钾钠的热溶液 .酒石酸钾钠溶于水中,再加 入.苯酚和.亚硫酸钠,溶解冷却,定 容至。 ..方法 不同阻遏剂种类和浓度对菌株生长和发酵产酶的影响 分别在发酵产酶培养基中添加不同浓度的甘油、葡萄糖和纤维二糖,摇床 转速/,在?下培养天,测定菌株的、:及菌体的生物量。 菌株的诱变选育 原始出发菌株培养至长出孢子,将孢子洗下配制成适当浓度约个/ 的孢子悬浮液经紫外诱变、微波诱变【嗍,涂布在阻遏筛选培养基平板上初 筛, 划线分离到单个正变异菌株进而摇瓶复筛。第三章绿色木霉的抗阻遏 变异菌株的特性研究 分别考察变异菌株的菌落菌丝显微形态、产酶能力及抗阻遏性能。 和的测定 同第二章..。 .结果与讨论 ..阻遏剂种类和浓度的影响 为了考察不同种类、不同浓度阻遏剂对菌株合成纤维素酶的抑制程度,以 便更有目的、更有效果地提高菌株的抗阻遏能力和产酶能力,采用摇瓶发酵 实 /、 验,分别在发酵产酶培养基中添加鲈:、 酌:、 卧、 ‖,浓度的纤维二糖、甘油、 鲈、 眇、 咖、 酌:、 葡萄糖,考察了对菌株生长和产酶的影响,实验结果如图..所示。 雷 萤一沪 ? 孓 一?一 堇 塑吨广菌体量 长卜菌体量 溢 翘纤维二糖浓度/酌 图.不同浓度纤维二糖对菌株生长和产酶的影响 笛 彘 仃砌 妇.. 锄 从图.可以看出,在培养基中纤维二糖的浓度在.卧时,菌体生 物量随着纤维二糖浓度的升高而增大;随着纤维二糖浓度的升高呈现比 较明显的震荡规律;随着纤维二糖浓度的升高呈现出曲折上升的规律。纤 维二糖既可作为菌株生长增殖的碳源, 也是纤维素物质酶解过程中的中间产物 和纤维素类物质酶解终产物的反应物。 结果显示,纤维二糖对菌株生长具有促