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转plfp和hrap辣椒抗青枯病的初步研究

2017-12-20 22页 doc 72KB 34阅读

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转plfp和hrap辣椒抗青枯病的初步研究转plfp和hrap辣椒抗青枯病的初步研究 9个富贵竹栽培品种遗传多样性的RAPD分析 袁慧明 指导老师 袁长春教授 湛江师范学院 生命科学与技术学院,湛江524048 摘 要:利用RAPD技术分析9个富贵竹栽培品种的遗传多样性~从100个10bp长的随机引 物中筛选出8条多态性引物~共扩增出46条RAPD带~其中多态性带39条~占总带数的84.8%。 利用软件PAUP4.0b10计算各个品种间的遗传距离~并进行聚类分析。结果表明~各品种间遗传距 离在0.00295-0.23580之间~平均为0.07986。9个富贵竹...
转plfp和hrap辣椒抗青枯病的初步研究
转plfp和hrap辣椒抗青枯病的初步研究 9个富贵竹栽培品种遗传多样性的RAPD分析 袁慧明 指导老师 袁长春教授 湛江师范学院 生命科学与技术学院,湛江524048 摘 要:利用RAPD技术分析9个富贵竹栽培品种的遗传多样性~从100个10bp长的随机引 物中筛选出8条多态性引物~共扩增出46条RAPD带~其中多态性带39条~占总带数的84.8%。 利用软件PAUP4.0b10计算各个品种间的遗传距离~并进行聚类分析。结果表明~各品种间遗传距 离在0.00295-0.23580之间~平均为0.07986。9个富贵竹栽培品种可以分成2类~第一类包括湛江 青叶富贵竹和湛江莲花竹,第二类包括湛江金边富贵竹、广州青叶富贵竹、高州莲花竹、高 州青叶富贵竹、吴川莲花竹、吴川青叶富贵竹和东莞青叶富贵竹~其中~吴川青叶富贵竹与 另外6个品种之间的亲缘关系相对较远~而湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹两个品种间的 亲缘关系最近~二者与高州莲花竹又构成姊妹类群。 关键词:富贵竹栽培品种;RAPD;遗传多样性;聚类分析 The Genetic Diversity among Nine Cultivars of Lucky Bamboo Based on RAPD Analysis Yuan Huiming Life Science and Technology School, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang, Guangdong, China 524048 Abstract: The genetic diversity of nine cultivars of lucky bamboo was analyzed by using RAPD method. 8 polymorphism primers (10bp) were selected from 100 random primers. 46 DNA bands were generated, of which 39 (84.8%) bands were polymorphic. The genetic distance between any two different cultivars of lucky bamboo were calculated by using the software PAUP4.0b10, and a cluster analysis was constructed based on the RAPD data. The results showed that the genetic distance between any two different cultivars of lucky bamboo ranged from 0.00295 to 0.23580, with an average 0.07986. The lucky bamboo cultivars could be divided into two groups. Group 1 included Zhanjiang green-leaf lucky bamboo and Zhanjiang lotus bamboo. Group 2 included Zhanjiang gilt lucky bamboo, Guangzhou green-leaf lucky bamboo, Gaozhou lotus bamboo, Gaozhou green-leaf lucky bamboo, Wuchuan lotus bamboo, Wuchuan green-leaf lucky bamboo and Dongguan green-leaf lucky bamboo, in which the relationship between Wuchuan green-leaf lucky bamboo and six other cultivars was far. However, Zhanjiang gilt lucky bamboo had closer relationship with Guangzhou green-leaf lucky bamboo. They constitutes a sister group with Gaozhou lotus bamboo. Key words: lucky bamboo cultivar; RAPD; genetic diversity; cluster analysis 富贵竹(Dracaena sanderiana)为百合科(Liliaceae)龙血树属(Dracaena)植物。别名仙达 龙血树、万寿竹、距花万寿竹、开运竹、富贵塔、竹塔、塔竹等,原产于加纳群岛及非 [1]洲和亚洲的热带地区。富贵竹属常绿小乔木,茎干直立、粗壮,高可达2米以上,株 1 态玲珑,叶长披针形,叶片浓绿,生长强健,水栽易活;其品种有绿叶、绿叶白边(称 [2]银边)、绿叶黄边(称金边)、绿叶银心(称银心)和近年来兴起的莲花竹。 富贵竹性喜阴湿高温,耐阴、耐涝,耐肥力强,抗寒力强;喜半荫的环境。适宜生长于排水良好的砂质土或半泥砂及冲积层粘土中,适宜生长温度为20,28?,可耐2,3?低温,但冬季要防霜冻。夏秋季高温多湿季节,对富贵竹生长十分有利,是其生长最佳时期。它对光照要求不严,适宜在明亮散射光下生长,光照过强、曝晒会引起叶片 [2-3]变黄、褪绿、生长慢等现象。所以在大田栽植,应搭1.7—1.8米高的遮阳网荫棚,以75,遮光率为宜,创造半阴阳、散射光照的环境。尤其是4—9月,要避免强光照直射,曝晒或过干旱,否则易使叶面粗糙,枯焦,生势弱,叶片缺乏光泽,降低观赏价值。在生长季节应经常保持土壤湿润,并常向叶面喷水或洒水,以增加空气的湿度;遇大雨应排清田间积水,以防倒伏。冬季要注意防寒、防霜冻,温度在10?以下叶片会泛黄萎 [4]落。此时,土壤应干干湿湿为宜,但不宜干旱,也不宜过湿,要减少浇水和停止施肥。 富贵竹粗生粗长,茎杆挺拔,叶色浓绿,冬夏长青,不论盆栽或剪取茎干瓶插或加工“开运竹”、“弯竹”,均显得疏挺高洁,茎叶纤秀,柔美优雅,姿态潇洒,富有竹韵,观赏价值特高。一般用于家庭瓶插或盆栽护养,特别是台湾流传来的“塔状”造型,又 [5]名“开运竹” 。生产上常取富贵竹茎干为主材,将其剪切成不等长的茎段,将这些不等长茎段内长外短、逐层递减排列,捆扎成三、五、七层宝塔状;或将茎干弯曲别致的富贵竹扎成一把,插入高瓶观赏。用富贵竹加工的产品造型简洁、小巧,既富有竹韵,又充满生机,并寓有富贵、吉祥的含义,不仅深受我国人民喜爱,近年来在欧、美等国 [5-6]也大受欢迎,成为当地家庭和办公室常见的装饰植物。 我国富贵竹的种植与加工主要分布在广东、海南与台湾。目前,种植加工富贵竹最 [7]多的是广东省湛江市。地处南海之滨的湛江市属热带亚热带过渡气候区,海洋性气候带来温暖湿润的光热条件,极适宜富贵竹生长。富贵竹于20世纪80年代末引入湛江市,集中种植于麻章区。近年来全世界富贵竹市场中国占80%的份额,中国的富贵竹80%来自湛江,湛江是名副其实的富贵竹产业“王国”。湛江全市各地均有种植富贵竹,主要 [8]分布于麻章区,其次是遂溪县、东海岛和雷州市等。国内和国际市场需求量大,目前国内主要销往广州、深圳、珠海、北京、天津、上海、哈尔滨等全国大中城市,出口主 [9]要远销荷兰、美国、日本、加拿大、澳大利亚等。 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 技术,即随机扩增多态性DNA技术,是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的,又称任意引物 2 [10-11]PCR。这种技术以PCR为基础,但是不必预先知道DNA序列的信息,以随机引物扩增样品总DNA后,其产物通过凝胶电泳就可以检测出不同模板DNA扩增出的不同DNA片段带型,由于片段被引物选择性地扩增,扩增了的片段又可以在凝胶上清晰地显示出来,这样就可以通过同种引物扩增条带的多态性反映出模板的多态性。RAPD标记技术由于操作简便、快速、省时、省力、DNA用量少等特 [12]点,在农、林、医及植物和微生物学各领域中得到广泛应用。目前尚未见到有关富贵竹栽培品种之间亲缘关系的研究报道。鉴于从形态上分辨富贵竹栽培品种存在一定困难,本研究利用RAPD技术对广东5个地区的9个富贵竹栽培品种之间进行遗传多样性分析,为富贵竹栽培品种的鉴定和开发利用提供分子生物学上的依据。 1 试剂与仪器 1.1 主要试剂 (1) 2×CTAB缓冲液: -12% (w/v) CTAB(hexadecy-ltrim-ethylammonium bromide,Sigma),1.4mol?L氯化 -1-1钠,25mmol?L EDTA,100m mol?LTris-HCl pH8.0,0.2% (v/v) β-巯基乙醇; (2) 氯仿-异戊醇 [ 氯仿:异戊醇(V:V=24:1)]; (3) 3M 醋酸钠; (4) 异丙醇; (5) 70%乙醇,无水乙醇; (6) 溴化乙锭(EB); (7) 5×TBE缓冲液: -1-1-1445mmol?LTris碱,445mmol?L硼酸盐,10mmol?LEDTA,灭菌双蒸水; (8) 琼脂糖(北京鼎国生物技术有限责任公司) (9) Taq-DNA聚合酶 (5U/μL,北京拜尔迪生物公司) (10) RAPD引物(北京鼎国生物技术有限责任公司) (11) dNTPs(北京鼎国生物技术有限责任公司) (12) 1Kb DNA ladder Marker (D016-2,北京鼎国生物技术有限责任公司) 1.2 主要仪器 (1) PCR仪(T-personal,Biometra) 3 (2) 稳压稳流电泳仪(DYY-5型,北京六一仪器厂) (3) 台式高速离心机(TG16A-WS,湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司) (4) 快速混匀器(SK-1,常州澳华仪器有限公司) (5) 微量移液器(Eppendorf,德国) (6) 电热恒温水槽(DK-8D型,上海精宏实验设备有限公司) (7) UV-2600型紫外可见分光光度计(北京六一科学仪器有限公司) (8) 凝胶成像分析系统(UVP GDS-8000pc,美国) (9) 数显鼓风干燥器(GZX-9140 MBE,上海博讯实业有限公司医疗设备厂) (10) 立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-75S11,上海博讯实业有限公司医疗设备厂) 2 材料和方法 2.1 实验材料 本研究的富贵竹栽培品种共9个,分别采自湛江、吴川、高州、广州和东莞5个地区,每种材料采集新鲜的、健康的叶片,经硅胶干燥备用,并采集相应的凭证标本,材料的详细采样情况见表1; 表1 用于本研究的9个材料的详细信息 Table 1 The detail informations of 9 materials used in this study 样品名 采集地点 采集人 采集日期 凭证标本 Sample name location Collector Date Voucher 2008.12.08 08120801 湛江青叶富贵竹 湛江市 韩跃 2008.12.08 08120802 湛江莲花竹 湛江市 韩跃 2008.12.07 08120701 吴川青叶富贵竹 吴川市 陈海英 2008.12.07 08120702 吴川莲花竹 吴川市 陈海英 2008.12.08 08120803 湛江金边富贵竹 寸金公园 梁海群 2008.12.05 08120501 高州莲花竹 高州市 张杏球 2008.12.05 08120502 高州青叶富贵竹 高州市 张杏球 2008.12.15 08121501 广州青叶富贵竹 广州市 李泳研 2009.03.09 09030901 东莞青叶富贵竹 东莞市 袁慧明 2.2 实验方法 2.2.1 总DNA的提取 4 [13-14]采用改进后的2×CTAB法提取总DNA,具体步骤如下: (1) 称取干燥后的叶片约0.15,0.2g,置于干净且灭过菌的瓷研钵中,剪成小片,加液氮充分研磨成细粉,约10min,自至粉末成浅灰绿色; (2) 将磨碎的粉末近等量地分装于2个1.5mL的离心管中,然后各加入1mL预热(约 50?)的含0.2% ,-巯基乙醇的2×CTAB缓冲液,充分摇匀,65?保温1.5h,每隔10min摇匀一次。然后室温放置5min,其间摇动1,2次; (3) 10,000 rpm离心5 min,弃沉淀,取上清液移至新管,加氯仿,异戊醇(V:V=24:1)至满管,用力摇匀; (4) 10,000 rpm离心5 min,弃沉淀,取上清液移至新管,加氯仿,异戊醇(V:V=24:1)至满管,用力摇匀; -1(5) 10,000 rpm离心5 min,弃沉淀,取上清液,加1/10体积的3mol?L NaAC(4?)再加异丙醇(4?)至满管,将离心管轻轻翻转几次(约5s),,20?放置0.5h以上或过夜; (6) 10,000 rpm离心5 min,弃上清液, 沉淀用70%乙醇洗脱2次,再用无水乙醇洗脱一次; (7) 晾干,溶于50,100μL 1×TE缓冲液中,,20?保存备用。 2.2.2 总DNA的检测 (1)定性分析采用凝胶电泳的方法。取提取出的总DNA 5μL与6×loading buffer混匀后点样于ρ=1%且含有GV核酸染料的琼脂糖凝胶,以1Kb Ladder DNA(北京鼎国生物技术有限公司)作为分子量标记。在1×TAE缓冲液中电泳,稳流80mA,电泳约40 min后紫外光下检测。 (2)DNA含量测定用紫外分光光度法。总DNA 10μL,用TE稀释250倍后置于石英比色杯中,并以TE作为空白对照,用紫外分光光度计测定其260nm波长 -1下的OD(光密度)值,根据OD值计算样品DNA浓度,稀释至25ng?μL备用。 260 2.2.3 PCR扩增的优化 本研究为选出较理想的反应体系及扩增程序,采用分相梯度分析的方法。设计一个因素为变量,分别对TaqDNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA等因素的浓度进行试验。经过试验后,筛选出对富贵竹栽培品种进行RAPD分析较理想的反应体系及扩增程序。 (1) 优化后的反应体系:PCR反应采用20μL体系,加样顺序见表2。 5 表2 PCR反应体系 Table 2 The PCR reaction system 成分 加入量 Composition addition amount 10×buffer μL 2.0 -1dNTPs(2 mmol?L) 1.5μL -10.4μL TaqDNA聚合酶(2.5U?μL) -10.5μL 引物(8pmol?μL) -11.6μL DNA模板(25ng?μL) 14μL 双蒸水 20μL 总体积 空白对照用双蒸水代替模板DNA。 (2)优化后的扩增程序 将配制好的PCR反应体系,按如下程序进行扩增: 40 个循环 97?,3min ? 94?,50s ? 42?,1min15s ? 72?,1min ? 72?,7min ? 4? (3)电泳检测。去PCR产物10μL加点样Buffer混匀后点在ρ=1.2%的琼脂糖凝胶(加适量GV)中,以1×TAE为缓冲液电泳1.5,2h。电泳结束后,于凝胶成像分析系统中观察并拍照保存图像。 (4)筛选引物。9个富贵竹栽培品种总DNA分别稀释一定倍数(DNA浓度约为 -125ng?μL)。然后再与100个引物进行扩增,筛选出能扩增清晰条带的引物作为正式扩增用。 2.2.4 遗传距离及聚类分析 从100个10bp的随即引物中筛选出8个能扩增出清晰条带的引物。根据各引 [15]物RAPD带的有(计为1)或无(计为0),建立0、1矩阵。根据Nei-Li公式计算出 [16]9个富贵竹栽培品种之间的遗传距离,运用UPGMA法对9个富贵竹栽培品种的亲缘关系进行聚类分析。 3 实验结果 3.1 总DNA的琼脂糖凝胶电泳的结果 从9个富贵竹栽培品种总DNA琼脂糖电泳检测图(图1)可见,9个样品的总DNA纯度均较高,但是均有少部分DNA降解。但RAPD扩增的优点之一是DNA模板的需要量少,这9个样品的总DNA都适合进行RAPD扩增。 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 图1 9个样品总DNA琼脂糖电泳检测图 Fig.1 The electrophoresis map of total DNA from nine samples 1. 湛江青叶富贵竹;2. 湛江莲花竹;3. 吴川青叶富贵竹; 4. 吴川莲花竹;5. 湛江金边富贵竹;6. 高州莲花竹;7. 高州青叶富贵竹; 8. 广州富贵竹;9. 东莞青叶富贵竹;M: 1Kb DNA ladder Marker. 3.2 总DNA的OD值及浓度 用紫外分光光度法分别测定9个富贵竹栽培品种总DNA的OD值,根据 260 -11 OD=50ng?μL计算出总DNA浓度,见表3。 260 表3 9个品种总DNA测得的OD值及相应浓度 260 Table 3 The OD values and concentrations of DNA extracted from nine cultivars 260 -1样品名 OD值DNA浓度(ng?μL) 260 -1Sample name ODvalue DNA concentration(ng?μL) 260 0.023 287.5 湛江青叶富贵竹 0.022 275.0 湛江莲花竹 0.021 262.5 吴川青叶富贵竹 0.017 212.5 吴川莲花竹 0.025 312.5 湛江金边富贵竹 0.027 337.5 高州莲花竹 0.026 325.0 高州青叶富贵竹 0.022 275.0 广州青叶富贵竹 0.019 237.5 东莞青叶富贵竹 3.3 多态性引物筛选结果表 从100个引物中共筛选出8个能扩增清晰条带的引物,每个引物的序列见表4。 表4 用于本研究的引物序列 Table 4 Primer sequences used in this study 引物名称 序列(5’- 3’) 引物名称 序列(5’- 3’) Primer name Sequence ( 5′—3′) Primer name Sequence(5′—3′) N20 GGTGCTCCGT M2 ACAACGCCTC M11 GTCCACTGTG O7 CAGCACTGAC M7 CCGTGACTCA M13 GGTGGTCAAG M8 TCTGTTCCCC N15 CAGCGACTGT 7 3.4 多态性引物扩增结果表 对表5中8个引物的扩增结果进行统计,统计结果见表6。不同引物扩增出的 DNA条带在3,8条之间,其中扩增条带最多的是引物M11为8条。8个引物共 扩增出46条带,其中多态性条带有39条,占总扩增带的84.8%。图2是4个随机 引物(O7、N15、M8、M13)的RAPD扩增图谱。 表5 8个引物扩增的RAPD带 Table 5 The RAPD bands generated from 8 primers 样品名 8个引物扩增的RAPD带 Sample name RAPD bands generated from 8 primers 0001000000011100111101000011111101000001110100 湛江青叶富贵竹 0000000000000100011100100001100010100000100100 湛江莲花竹 1110000000000011110011111110111111111110101110 吴川青叶富贵竹 0000011011100011110011111110111111111111101111 吴川莲花竹 0000011011100011110011011110111111111110100110 湛江金边富贵竹 0100011011100011110011011110111111111110101110 高州莲花竹 0000000000110011110011011110111111111110100110 高州青叶富贵竹 0000010011100011110011011110111111111110100110 广州青叶富贵竹 1111111111100011110011011110111111111110101111 东莞青叶富贵竹 表6 RAPD分析产生的单态带、多态带和特有带及多态性比率 Table 6 The number of monomorphic, polymorphic and unique bands obtained from primer, and the polymorphicor rates 单态带 多态带 特有带总数 多态性比率(%) 引物名称 Number of Number of Number Total Polymorphic Primer name monomophic polymorphic of unique numer Rates(%) bands bands bands of bands N20 0 4 1 5 80% M11 0 7 1 8 87.5% M7 1 6 0 7 85.7% M8 0 3 0 3 100% M2 1 5 0 6 83.3% O7 0 6 0 6 100% M13 1 5 0 6 83.3% N15 1 3 1 5 60% 4 39 3 46 合计 0.5 4.875 0.375 5.75 84.8% 平均 8 0 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 0 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C D 图2 4种随机引物的RAPD扩增图谱 Fig.2 Fingerprints of RAPD generated from 4 random primers A. 引物引物O7的扩增图谱;B. 引物N15的扩增图谱; C. 引物M8的扩增图谱;D. 引物M13的扩增图谱;0. 空白对照; M: 1Kb DNA ladder Marker;1. 湛江青叶富贵竹;2. 湛江莲花竹; 3. 吴川青叶富贵竹;4. 吴川莲花竹;5. 湛江金边富贵竹;6. 高州莲花竹; 7. 高州青叶富贵竹;8. 广州青叶富贵竹;9. 东莞青叶富贵竹. 3.5 聚类分析结果 根据RAPD扩增结果,用Nei-Li的方法计算遗传距离(见表7)。结果表明,9 个富贵竹栽培品种间的亲缘关系十分相近,遗传多样性并不丰富,遗传距离在 0.00295,0.23580之间,平均为0.07986。其中湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹之 间的遗传距离最小,为0.00295,而湛江莲花竹和广州青叶富贵竹之间的遗传距离 最大,为0.23580,大多数富贵竹栽培品种间的遗传距离小于0.10000。利用各品 种间的遗传距离,对9个富贵竹栽培品种的亲缘关系进行聚类分析,得到UPGMA 聚类树(图3)。从图3的聚类树中能直观地了解到各个富贵竹栽培品种间的亲缘关 系,9个品种可以分为两大类,第一类包括湛江青叶富贵竹和湛江莲花竹,第二类 9 包括湛江金边富贵竹、吴川青叶富贵竹、吴川莲花竹、高州青叶富贵竹、高州莲花竹、广州青叶富贵竹、东莞青叶富贵竹,其中,吴川青叶富贵竹与另外6个品种之间的亲缘关系相对较远,而湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹两个品种间的亲缘关系最近,二者与高州莲花竹又构成姊妹类群。 表7 9个富贵竹栽培品种的遗传距离 Table 7 The genetic distance between any two Lucky Bamboo cultivars 样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sample numbers 1 - 2 0.11128 - 3 0.13500 0.17765 - 4 0.13355 0.19406 0.02939 - 5 0.13500 0.20422 0.03162 0.01113 - 6 0.14183 0.21265 0.02390 0.01077 0.00565 - 7 0.10944 0.19076 0.02273 0.02765 0.01591 0.02188 - 8 0.13149 0.19984 0.02871 0.01427 0.00295 0.00870 0.01284 - 9 0.14597 0.23580 0.02745 0.02026 0.02157 0.01542 0.03864 0.02489 - 1.湛江青叶富贵竹;2.湛江莲花竹;3.吴川青叶富贵竹;4.吴川莲花竹;5.湛江金边富贵竹; 6.高州莲花竹;7.高州青叶富贵竹;8.广州青叶富贵竹;9.东莞青叶富贵竹. 湛江金边富贵竹 广州青叶富贵竹 高州莲花竹 吴川莲花竹 高州青叶富贵竹 东莞青叶富贵竹 吴川青叶富贵竹 湛江青叶富贵竹 湛江莲花竹 图3 9个富贵竹栽培品种的UPGMA聚类树 Fig.3 Dendrogram of nine Lucky Bamboo cultivars generated by UPGMA cluster analysis 4 分析 10 4.1 扩增条件对扩增结果的影响 实验表明,扩增条件的变化会对扩增出的RAPD带的数量和强弱产生影响,从而影响RAPD分析的准确性,尤其模板DNA、引物和Taq酶的浓度不适宜时,会对分析结果造成较大的偏差。因此,为了获得重复性和可靠性强的可用于RAPD分析的扩增DNA片段,采用分相梯度分析的方法,筛选出较为合适的扩增条件, [17]并加以固定,是十分有用和重要的。 本研究对20μL反映体系中的模板DNA、引物和Taq酶的用量分别设置5个梯度进行了筛选。 -1(1)模板DNA(25 ng?μL)的量对RAPD带的影响 -1本研究对模板DNA (25ng?μL)的量设置了5个梯度(1.2μL、1.6μL、2μL、2.4μL和2.8μL),经实验得知,对于富贵竹栽培品种进行RAPD分析最理想的模板DNA的量为1.6μL,过低或过高浓度都会导致无带出现的现象。 -1(2)引物(8pmol?μL)的量对RAPD带的影响 本研究对引物(8pmol/μL)的量设置了5个梯度(0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL和1.25μL),经实验表明,对于富贵竹栽培品种进行RAPD分析最理想的引物的量为0.5μL,用量偏低,带的数目明显减少,用量过高,出现明显的引物带。 -1(3)Taq酶(2.5U?μL)的量对RAPD带的影响 -1本研究对Taq酶(2.5U?μL)的量设置了5个梯度(0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL),经实验得知,对于富贵竹栽培品种进行RAPD分析最合适的Taq酶的量为0.4μL,用量过少,没有扩增产物出现,用量过高,带的清晰度下降。 同一实验室如果采用相同的RAPD流程(反应程序与反应成分),在同一型号的 [18]PCR仪上运行有很好的重复性。提高退火温度能降低引物与模板间的非特异性结合,也能抑制引物间的自连接。但有时过高的退火温度会影响引物与目的片段 [19]的匹配,从而降低PCR反应扩增效率导致产物量下降甚至得不到产物。适用于本研究的PCR反应程序中的退火温度是42?。 4.2富贵竹栽培品种亲缘关系分析 遗传距离(表7)和UPGMA聚类树(图3)显示,9个富贵竹栽培品种分为两大类。第一大类包括湛江青叶富贵竹和湛江莲花竹,并且湛江青叶富贵竹和湛江莲花竹之间的遗传距离为0.11128,比这两者分别与其他品种之间的遗传距离较小,表明湛江青叶富贵竹和湛江莲花竹之间的差异不大。从文献得知,富贵竹于20世纪80 11 年代从加纳群岛及非洲和亚洲的热带地区引入湛江,湛江是名副其实的富贵竹产业“王 [8]国”,由此推测湛江青叶富贵竹和湛江莲花竹可能是与其他品种的遗传背景差异较大,而且是由国外引进的品种,可能两者在分化上有共同特点,亲缘关系较近,在聚类树上聚为一大类。 第二大类包括湛江金边富贵竹、广州青叶富贵竹、高州莲花竹、高州青叶富贵竹、吴川莲花竹、吴川青叶富贵竹和东莞青叶富贵竹。其又可以分为两个亚组,第一亚组只有吴川青叶富贵竹;第二亚组包括东莞青叶富贵竹、高州青叶富贵竹、吴川莲花竹、高州莲花竹、广州青叶富贵竹和湛江金边富贵竹。 第二大类中吴川青叶富贵竹独立成一支,与第二亚组的六个品种间的平均遗传距离为0.02730,表现出与这一类的其他品种间的亲缘关系较远。第二亚组中,湛江金边富贵竹和广州富贵竹先聚成一小支,为第一个姊妹关系,且两者之间的遗传距离最小为0.00295,表明湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹之间差异性最小,亲缘关系最近。高州莲花竹与湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹的遗传距离次之,分别为0.00565和0.00870,可以看出湛江金边富贵竹、广州青叶富贵竹和高州莲花竹间的差异不显著,反映出它们之间有着很近的亲缘关系,高州莲花竹与第一个姊妹关系构成第二个姊妹关系。吴川莲花竹单独成一支,并与第二个姊妹关系构成第三个姊妹关系,吴川莲花竹与上述三个品种的平均遗传距离为0.01206,说明吴川莲花竹与湛江金边富贵竹、广州青叶富贵竹、高州莲花竹的亲缘关系较近。高州青叶富贵竹单独为一支,又与第三个姊妹关系构成第四个姊妹关系,平均遗传距离为0.01957,说明高州青叶富贵竹和以上四个姊妹关系的四个品种间的亲缘关系也比较近。东莞青叶富贵竹也是单独成一支,与第二亚组其他5个品种的平均遗传距离为0.02416,反映出它们之间的的遗传背景差异不大,有较近的亲缘关系。 综合对第二大类的分析,富贵竹类和莲花竹类都聚在同一个大类里面,说明富贵竹类和莲花竹类虽然在形态上有差别,但从分子上平上看,两类的亲缘很相近。湛江金边富贵竹、广州青叶富贵竹、高州莲花竹、高州青叶富贵竹、吴川莲花竹、吴川青叶富贵竹和东莞青叶富贵竹,两两之间的遗传距离都小于0.10000,差异性都不大,且得知近年来全世界富贵竹市场中国占80%的份额,中国的富贵竹80% [8]来自湛江,推测它们具有相近的分化来源。湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹的遗传距离最近,但与高州青叶富贵竹、东莞青叶富贵竹和吴川青叶富贵竹又稍远 12 一些,由此推测湛江金边富贵竹和广州青叶富贵竹具有更接近的分化来源。这两个品种的叶子形态和颜色都有较大的差别,仅仅根据形态来分辨它们的亲缘关系远近是有一定差异的,但本实验从分子水平上研究表明它们的亲缘关系却是最近的。 致谢: 本论文是在袁长春(博士)教授的悉心指导下完成的,同时得到了来自高州的张杏球同学、吴川的陈海英同学、广州的李泳研同学和湛江的韩跃、梁海群同学等的热心帮忙采集各地区的材料,在实验过程中,得到黄永莲老师、研究生实验室的各位博士生研究生和同班同学韩跃、邓家琪以及同组成员聂小金、陈海群、刘柳敏、匡文华和陈雅玲同学的热心帮助和支持,在此对他们表示衷心的感谢~ 参考文献: [1] 雪蓉花.室内几丛绿 富贵竹生春——富贵竹的家庭栽培与养护[J].花木盆景:花卉园艺, 2008,(3):22-23. 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