浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其对模拟固态发酵的影响

浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其对模拟固态发酵的影响 浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其对模拟 固态发酵的影响 第37卷第3期 2010年05月 酿 LIQUOR 酒 MAKING V1.37.?.3 May,2010 文奄编号:1002—8110(2010)03-0037—05 浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其 对模拟固态发酵的影响? 姚惟琦,陈茂彬,镇达,郭艺山 (发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北工业大学生物工程学院,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068) 摘要:从发酵酒酷中分离得到21株产乳酸菌株,其中16株为芽孢杆菌.利用梅里埃微生物鉴定仪鉴定,得 到干燥棒杆茵(Corynebacteriumxerosis),耳葡萄球菌(Staphylococcusauricularis),枯草芽孢杆菌(Ba删us subtilis),巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium),腊状芽孢杆菌(BacillusceFeusgroup), 浸麻芽孢杆茵(Paerdba础us macerans)6种产乳酸茵.将6株产酸茵进行模拟固态发酵,结果显示所有乳酸茵都不同程度的抑制了己酸,己 酸乙酯以及乳酸乙酯的产量,其中浸麻芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌属的2株产乳酸茵严重抑制了乙醇和己酸乙 酯的生成量,巨大芽孢杆菌的一株还严重抑制了己酸的产量. 关键词:糟醅;乳酸茵;分离纯化;模拟发酵 中图分类号:TS262.31;TS261.1;TS261.4文献标识码:A IsolationofLactate-producingMicrobesFromFermentedGrainsof Luzhou-flavorLiquorandTheirEfiectonSimulativeSolid-state FermentatiOn YA0Wei—qi,CHENMao—bin,ZHENDa,GUOYi—shah Abstract:Samplesweretakenfromthefermentedgrains,21strainsoflactateproducerwereseparated.16onesofthemareBacillus.Sixof themwereidentifiedasCorynebaeteriumxerosis,Staphylococcusauricularis,Bacillussubtilis,Bacillusmegaterium,Bacilluscereusgroup, Paenibacillusmacerans,whichwereincorporatedintothesimulativesolid— statefermentation.Theresultillustratedthatallofthelactate producersrestrainthecaproicacid,ethylcaproateandLacticacidethylesterindifferentextent .Amongthem2onesofPaenibacillus maceransandBacillusmegateriumreducedthelevelofethanol,ethylcaproateseriously,especiallyoneoftheBacillusmegateriumrestrain theproductivityofthecaproicacidseriously. Keywords:fermentedgrains;Lactate-producingmicrobes;isolation;simulativefermentation 收稿日期:2010-01—30 基金项目:湖北省教育厅科学技术研究项目(B20091405)资助 作者简介:姚惟琦(1986一),女,湖北武汉人,在读硕士研究生,研究方 向:食品与工业微生物. "通讯作者:陈茂彬(1965一),男,湖北麻城人,教授,博士,主要从事 酿酒微生物发酵及分析研究;hgchenmaobin@163.con. 浓香型白酒的生产是采取传统固态发酵法,一般认为固 态白酒发酵中的乳酸主要是由乳酸菌产生的.在发酵前期,乳 酸菌产生的乳酸可以抑制窖池中的杂菌生长,维持窖池内一 定的酸度,这也是很多文献中已经报道过的"以酸制酸"的原 理.发酵中后期,由乳酸菌代谢产生的乳酸与酵母发酵生成的 3总结 据报道,pI不同香型不同品牌的名优白酒具有各异的微观 形态,从图三到图七,在五种川产浓香型白酒的AFM扫描图 中可以观察到,不同厂家生产的浓香型白酒,由于其所用原料 不同,生产条件不同,生产工艺和勾兑措施有差异,使得产品 的口味和质量不同,因而所含呈香呈味微量物质在乙醇一水 体系中形成不同的微观形态. 与图1图2名优品牌浓香型白酒的AFM扫描图相对比, 虽然各有不同程度的差异,但大部分白酒的AFM扫描图中或 多或少显示出了球型颗粒状微观形态. 【参考文献1 [1】郑洁,欧仕益,蔡继业,等.原子力显微镜在食品科学中应用[J].食品 研究与开发,2005(5)138—142 【2】吴士业.浓香型白酒微观形态研究[J].四川食品与发酵,2007(5) 9—10 [3】吴士业.不同度数五粮液成品酒的微观形态研究fJ].食品与发酵科 技,2009(4)3—5 【4]吴士业.冯治平几种白酒的微观形态【J】.中国酿造,2008(3)64—65 黪 第三期西良酒2010 酒精生成乳酸乙酯.乳酸乙酯含量的多少在一定程度上决定 浓香型白酒的质量,如果乳酸乙酯含量过高,造成乳己失衡, 酒味苦涩,影响白酒的品质.要酿制优良的白酒就必须了解窖 池发酵过程中乳酸菌体系,特别是在窖池发酵过程中产乳酸 菌的生长代谢情况,以更好的协调白酒发酵过程中微生物体 系的平衡,提高酒质.本文从酒厂窖池酒醅中分离出数株产乳 酸菌并对其进行鉴定分析,利用酒厂生产大曲及直接来源于 窖池的酒醅,进行实验室模拟固态发酵,分析了菌株在酒醅固 态发酵过程中对主要发酵产物的影响,为"降乳"的深入研究 提供一定的依据. 1材料与 1.1材料 1.I.1某酒厂酒窖酒醅内分离菌株数株:由某酒厂窖池内取 样,从原料入窖1天,4天,7天,l4天,24天,34天,44天(出 窖)共七批窖池的不同方位取样,分离得到数株菌株,由本实 验室自行保藏. 1.1.2培养基 MRS乳酸分离培养基:蛋白胨1%,牛肉膏1%,酵母浸膏 0.5%,K2HPO0.2%,柠檬酸二铵0.2%,乙酸钠0.5%,葡萄糖 2%,吐温80O.1%,MgSO40.058%,MnSO4"4H200.025%,pH 6.2—6.4. 产酸性能培养基:葡萄糖2%,酵母膏1%,蛋白胨l% pH6.0,灭菌115qC,30min.在培养液中加入数滴1.6%溴甲酚 紫指示剂. 生理生化试验培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基,淀粉培 养基,蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基. 1.2仪器设备 超净台,高压灭菌锅,恒温培养箱,显微镜,电子天平,旋 涡混合器,pH计,VITEK32菌种鉴定仪,气象色谱仪. 1.3方法 1.3.1分离纯化 对本实验室自行分离得到的数株菌株进行产酸性能试 验,并对上述产酸产气菌株进行液态发酵,对发酵液产物进行 纸层析,可对乳酸进行定量即可筛选出乳酸菌株. 1_3.2产酸性能测定 将产酸性能培养基分装于试管中,每管lOmL,放人杜氏 管,35~C发酵培养7d观察生长状况,颜色变化以及产气情况 并记录. 1.3-3乳酸菌液态发酵 将上述得到的产酸产气菌株接种于MRS液体培养基试 管中,35?发酵培养7d观察颜色变化并记录. 1.3.4纸层析试验 选择大小合适的滤纸,在纸下方距边约3cm处划一横 线,隔2.5,3cm划一点,用0.3%一3%的乳酸溶液做对照. 点样后吹干放入展开槽展开时间约lh,待展开液完全风干, 喷撒显色剂,与标准样比较酸斑距离及大小,可判断产酸种类 及定量其浓度. 1.3.5形态学鉴定 运用革兰氏染色法进行光学显微镜形态特征鉴定. 1.3.6生理生化试量佥l2l 1.3.6.1过氧化氢酶反应 将菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平皿内, 30?培养24h后取出,将过氧化氢滴1—2滴于洁净的载玻 片,挑取菌落接于过氧化氢溶液中,观察产生气泡的为阳性反 应. 1.3.6.2淀粉酶试验 淀粉培养基2点接种,30?培养2,4d,平皿上滴加碘 液,以刚好铺满菌落周围为度,平皿呈蓝色,观察菌落周围出 现透明圈为阳性反应. 1.3.6.3吲哚试验 在蛋白胨水培养液中30~C培养2d后,加人10—20滴乙 醚,摇动数次,静止1,3min,待乙醚上升之后,沿试管壁徐徐 加入2滴吲哚试剂,在乙醚和培养物之间产生红色环状物为 阳性反应. 1.3.6.4V—P试验 在葡萄糖蛋白胨水培养基30?培养2d后,将培养物内 加入5—10滴40%KOH,再加入等量的5%一萘酚溶液,用 力震荡,再放入3O?培养箱内保温15,30min,以加快反应速 度,若生成红色化合物即反应为阳性. 1.3.6.5菌种鉴定嘲 表1鉴定卡选择列表 革兰氏阴性杆菌1McF革兰氏阴性菌(GNI+)Vitek35.50"C 标记:氧化酶 葡萄球菌O.5McF革兰氏阳性菌(GPI)?tek35.50? 标记:接触酶 凝固酶 链球菌O.5McF革兰氏阳性菌(GPI)Vitek35.50"C 酵母菌 非发酵杆菌 厌氧菌 芽孢杆菌 标记:b溶血 2McF酵母菌(YBC) 注:48h培养 1McF非发酵菌(NFC) 3McF厌氧菌(ANI) 0.5McF芽孢菌(BAC) 注:55?培养 其它培养箱30?, 24~48h Vitek35.50? 其它培养箱37'12, 24—48h Vitek35.50? 55?其它培养箱24h 运用法国BiosMerieumx(生物梅里埃)Vitek32菌种鉴定仪 对分离得到的乳酸菌进行鉴定.该系统是把3O个对细菌鉴定 必需的生化反应培养基固定到卡片上,通过培养,仪器对显色 反应进行判断,利用数值法进行判定.根据需要鉴定的微生物 第三期姚惟琦,等:浓香型白酒酒醅中乳酸茵分离及其对模拟固态发酵的影响 2010 的种类的不同,了不同的鉴定卡片,如革兰氏阴性菌卡, 革兰氏阳性菌卡,酵母菌卡等.根据需要做相应的定向试验以 确定卡的选择. 1.3.5.1嗜热定向试验 将芽孢杆菌接种于完全培养基,置于55?恒温培养18, 24h观察其生长状况. 1.3.5.2过氧化氢酶定向试验 用于革兰氏阳性菌的定向试验.方法参照1.3.4.1. 革兰氏阳性球菌 \e 葡萄球菌链球菌 0:阳性e:阴性 1.3.6模拟固态发酵研究 1.3.6.1模拟固态发酵工艺 按下列生产工艺流程进行发酵处理柳:. 加曲 l 预蒸原料—堆积—打量水_摊凉—搅拌,混匀一入池发酵一出窖 将原料高粱,大米糯米,小麦,玉米以粉碎度为4,6瓣粉 碎;将辅料糠壳清蒸30min,而后摊晾以除杂味;粮(糟的 25%),母糟,熟糠(粮粉的25%)混合后按照原料的80%打量 水(量水温度在80~C以上),摊凉后下曲粉,大曲粉碎程度以 未通过20目筛的占70%计,大曲粉用量为原料的20%【1】.将 原料,辅料以及曲粉,鲜糟搅拌混匀,平均填满装入250mL三 角瓶,每6瓶接人相同的实验菌株(上述鉴定用菌株),取余下 6瓶为空白对照.置于3O?恒温培养箱内发酵,发酵周期为 42天,每7天取样一次. 1.3.6.2发酵产物分析 取样品每瓶50g发酵酒醅浸于装有100mL纯水的三角 瓶中,充分混匀过滤,将样品浸提液按照l-3.2的方法进行乳 酸纸层析半定量,观测乳酸的变化量.以pH计直接测定发酵 浸提液pH,以直接用0.1mol/L的NaOH直接滴定法测定发酵 浸提液的总酸含量.将发酵浸提液样品离心8000r/rain,5min, 离心,膜过滤,气象色谱检测[61,以保留时间定性,采用内标法 对己酸乙酯,乳酸乙酯以及己酸进行定量,以外标法对乙醇含 量进行定量.测定实验菌株对己酸,酒精产量,己酸乙酯产量, 乳酸乙酯产量的影响. 2结果与分析 2.1乳酸茵的分离 表2酒醅中乳酸菌分离结果 通过对培养基颜色以及杜氏管的跟踪观察,通过MRS液 体培养基进行筛选,分离得到78株菌能够正常生长.上述78 表3部分乳酸菌株形态及生理生化反应 注:+代表反应为阳性;一代表反应为阴性 第三期西良酒2010 株菌在MRS液体培养基中培养7天后,利用纸层析法对其液 体培养基进行检测,比较样品层析斑与标准乳酸样品泳动距 离以及大小,计算产乳酸量,选取其中21株乳酸产量相对较 大的产乳酸菌(取产乳酸量在0.3%,0.5%之间的产乳酸菌)进 行进一步研究.乳酸菌液态发酵结果见表2. 由于乳酸菌代谢过程分为同型及异型,同型发酵乳酸菌 代谢仅生成乳酸,而异型发酵乳酸菌代谢除生成乳酸外,还产 生一定量的乙醇,t20:等物质.故可以推测从发酵过程中的酒 醅中分离得到的78株产乳酸菌中,大部分代谢途径为同型发 酵(即不产气),只有少数菌株进行的是异型发酵. 2.2形态学及生理生化特性 取2.1中21株乳酸产量较高的乳酸菌进行进一步研究. 其形态特征及生理生化结果见表3. 2:3菌种鉴定 上述21株从窖池酒醅中分离出的乳酸菌株,虽来自不同 发酵天数以及窖池不同位置,但有可能是相同的菌种,特别是 取自于不同发酵天数的菌株,有可能前后相同.故经过菌落形 态观察,镜检以及生理生化反应的对比和筛选(从相同菌落形 态,镜检结果,生理生化反应结果的数株菌株随机选取),选择 其中6株菌,采用Vitek32微生物鉴定系统鉴定.其中对于 芽孢杆菌,需要进行嗜热定向试验(见方法1.3.5.1),得到3株 耐55'12芽孢杆菌.对G+杆菌,球菌进行过氧化氢酶定向试 验,为阳性.鉴定结果见表4. 表4产乳酸菌菌种鉴定结果 2.4模拟固态发酵 模拟固态发酵每7天取样,分析样品中主要成分的变化. 见图1,7: 墨4.5 4.0 3.5 3.0 25 Ol020 图1 30405O 发酵时间,d pH变化趋势 对照 3 锰 孝z.52 1.5 ? 墅0.5 6O 崔 孝50 4o 30 蛔 抽20 甾 帕lO 01020 图2 304050 发酵时4间,dZu 总酸变化趋势 O1O2O 图3 304050 发酵时间,d 乳酸变化趋势 0102O 图4 304050 发酵时间,d 己酸变化趋势 O1O2030.4050 发酵时间,d 图5乳酸乙酯变化趋势 ; 1O2O30405 发酵时间,d 图6己酸乙酯变化趋势 +1号 +2号 +3号 4号 5号 6号 7号 十空白对照 对照 照 , 对号号号号号号号泊烤娉佴娉暗俜抽 }4}l{I{一 加:2m 锚 照 对号号号号号号号泊碍娟佴俜妯 }{f{}{一 照 对号号号号号号号咱烤娉俜拍 }{:}4一 加:.m 一sooH一.1蛔如龌fZ甾辞 号号号号号号号泊娉佴俜妯 }{}}}{一 52515O5 210O 一鏖?8_【一.1咖扣龃fZ潞叮 号号号号号号号咱空:}}}{一 第三期姚惟琦,等:浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其对模拟固态发酵的影响 2010 6 孝s4 {3 z ? 1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 空白对照 OlO2O3O4O50 发酵时间,d 图7乙醇变化趋势 2.4.1pH,总酸 一 定的酸度和pH是维持整个发酵过程中微生物正常代 谢的条件,白酒发酵过程是在酸环境下进行的,保持一定的酸 度可以抑制杂菌的生长,但过高的酸度对有益菌又会有一定 的抑制作用【IJ.在发酵过程中,所有样品(包括空白对照)的pH 都在3到4.5范围内,说明发酵过程中的微生物都可以较好 的适应酸性环境.在发酵前期(前20天)接入实验菌株的样品 pH变化趋势与空白对照基本相同,但在发酵中期30d左右, 多数实验菌株样品pH都处于最高值(6号菌样品与空白基本 相当). 一 般来说人窖酸度在1.5—2.2度左右(15?左右),发酵期 间的酸度波动在1.5度上下I-1.如图2所示,发酵过程酸度很 高且变化幅度较大,最大的达到l0左右,推测由于在实验中, 将发酵过程处于30'E恒温培养箱内进行导致发酵前期温度 过高("入窖"),致使杂菌增多造成.. 2.4.2乳酸含量 从图3中看到,乳酸的生成过程呈现倒钟罩型,在进入产 酯期后(20d后)乳酸含量菌达到最低值,且此时接入实验菌 的乳酸含量菌低于空白.可以推测在生酸期累积的乳酸,在此 阶段转化成酯而被消耗掉,除5号菌在发酵前期产酸能力较 弱低于乳酸含量的平均水平外,其他接入实验菌样品的乳酸 含量与对照差距很小. 2.4.3己酸含量 图4中可见,加入实验菌的所有样品的己酸含量在整个 发酵周期内均低于对照组.特别是在前期生酸阶段,其中4号 菌在前期己酸含量最低,接近于0点,5号菌样品己酸含量相 对其他样品略高,并呈现和对照类似变化趋势.各个乳酸菌的 加入抑制了己酸菌的正常生长,使己酸含量均偏低,其中4号 菌对己酸的产生造成了最大的抑制. 2.4.4乳酸乙酯含量 从图5中可以得出,乳酸乙酯的生成趋势类似于乳酸,但 变化幅度较小,且在产酯期乳酸乙酯呈现上升趋势,接入实验 菌的样品乳酸乙酯含量均低于空白对照.由于各样品乳酸含 量差距不大,乙醇含量除1,4,5号之外其余含量也差距不大. 我们推测其主要原因可能主要有二点,一是由于接入的乳酸 菌影响了白酒发酵中主要产酯微生物的活性(如:产酯酵母), 二是由于乳酸菌代谢过程直接抑制了酯化酶的催化作用. 2.4.5己酸乙酯含量 从图6中可得到,中期过后,己酸乙酯随着时间推移样品 基本均呈现上升趋势一(5号菌下降),但增加量低(不足 2L/lOOg酒醅),尤其4号,5号菌,其中4号菌己酸乙酯含 量接近于0己酸乙酯含量过低源于2个方面,一是由于接入 实验菌的样品己酸含量均大幅度低于空白,己酸的生成受到 了一定的抑制,二是由于接入的实验菌对酯化酶有一定程度 的抑制. 2.4.6乙醇含量 如图5所示,在发酵前期及中期,接入实验菌株的样品乙 醇含量均高于空白样品,这表明接人的菌株对于乙醇的产生 起到了一定的促进作用.从中期开始到发酵结束,1,4,5号菌 株发酵液乙醇含量明显降低且低于空白样品发酵液,推测其 原因可能是这3株菌的接入抑制了发酵中期酵母的代谢. 3结论' 酒窖发酵过程中乳酸产生菌大部分为芽孢杆菌属,但发 酵早期还存在球菌,杆菌以及酵母菌参与乳酸的产生,且酒窖 中存在的乳酸菌代谢种类多以同型发酵存在.由于一般观点 认为存在于大曲中的乳酸菌70%为球菌f】1,故可推测,窖池酒 醅中的产乳酸菌的主要菌群并非来源于大曲中,多数应来源 于发酵的粮醅,环境等途径. 所有乳酸菌株的接人均降低了乳酸乙酯的水平,不同程 度的抑制了酯化酶的催化作用,其中4号(入窖24天,中层边 糟,巨大芽孢杆菌Bacillusmegatedum),5号(入窖34天,中 层边糟,浸麻芽孢杆菌Paenibaeillusmaeerans)抑制了乙醇, 己酸乙酯的产量,并且使整个发酵过程pH与其他样品以及对 照相比都处于最低状态.特别是4号菌对己酸乙酯的生成产 生了极大的抑制作用,应该引起高度重视. 【参考文献】 [1】沈怡方.白酒生产技术全书【M】.北京:中国轻工业出版社,1998 [2】诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术【M埘E京:中国轻工业出 版社,1994:109,112 [3]ShettyN,HillG'RidhwayGLVitekanalyzerfor?u曲ebacterial identificationandSUSCe~tibihtytesting:protocols,problemsandpit— falls【J]-JCfinPathol,1998;5h316—323 f4】刘中华,张文学,张齐胜,等.模拟窖池发酵过程中各环境因子的变化 规律研究fJ1.酿酒科技,2006,150(12):17—20 [5】周恒刚,张讯,郭文在.乳酸,乳酸菌对白酒生产上的影响[J】.酿酒. 1996,114(3):17-22 [6】沈尧绅,曾祖训.白酒气相色谱分析(1版)【M】.北京:轻工业出版社, 1986 }{}}}{一