LPS致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素保护作用研究（可编辑）

LPS致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素保护作用研究（可编辑） 分类号: 墨?: 密级: 公珏 致胚胎着床障碍的分子机制及 槲皮素的保护作用研究 学位申请人:林燕燕 指导教师:钟秀会教授 学科专业:临床兽医学 学位类别:农学硕士 授予单位:;:农业大学 答辩日期:二。一三年五月二十六日独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过 的研究成果,也不包含为获得塑兰垦盎些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位敝储獭球垄势锢期:刀;年岁月诏日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规定,有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权 塑兰垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师繇 学位做储签名:琳趁表 , 一 签字日期:训弓年;月讴 ? , 签字魄劢?年土月沼日 学位论文作者毕业后去向: 电话: 工作单位: 邮编: 通讯地址:摘要 本试验旨在研究致胚胎着床障碍的分子机制以及槲皮素的保护作用研究。 本文采用体内和体外试验相结合的方法,研究槲皮素对细菌脂多 糖诱导小鼠 子宫内膜细胞./凋亡蛋白表达的影响,以及介导的小鼠子宫内膜细胞中 /..信号通路以及槲皮素的影响。 体内试验将只孕 昆明小鼠随机分为组,每组只。于孕 尾静脉注射 ,于孕 每天灌服不同浓度槲皮素。孕 剖取子宫,制备组织切片观察病 理学变化,免疫组化法检测子宫内膜细胞./凋亡蛋白的表达。结果表明, 可显著降低小鼠子宫内膜细胞中.的阳性表达,显著提高的阳性表达,明显 降低./的比值。中剂量槲皮素组小鼠子宫内膜细胞.的阳性表达显著高 于模型组,的表达显著低于模型组。这些结果提示,槲皮素可通过调节子宫内膜 细胞中./凋亡蛋白的表达,抑制子宫内膜细胞的凋亡,从而缓解对子宫 内膜细胞的损伤致胚胎着床障碍作用,起到保胎药效。 体外试验取孕. 小鼠,采用组织块培养法培养小鼠子宫内膜细胞,待细胞铺 、 、 、 、 板达%后,处理细胞 ,检测培养上清中. 和.【的含量变化;提取细胞胞浆和胞核蛋白, 检测胞浆 蛋白和胞核..蛋白的表达的变化。根据筛选出的剂量,将细胞分为组, 后,检测培养上清中. 补充不同浓度槲皮素、、 /处理 和.【的分泌变化;染色子宫内膜细胞;细胞免疫荧光检测..的跨膜表达; 检测胞浆蛋白和胞核.蛋白的表达的变化; 检测总蛋白中./蛋白表达的变化。细胞受到作用后,结果显示 降低了细胞中一的表达,增加了.【的表达,引起炎症反应,使/ 偏向于不利妊娠的方向;免疫荧光化学染色显示.蛋白表达由胞质向胞核 转位;胞浆中蛋白和胞核.蛋白的表达变化与作用时间呈正相关, 且两者表达变化具有同步一致性。补充槲皮素后,增加了细胞中.的表达,降 低了.仅的表达,抑制炎症反应,使/偏向有利于妊娠的方向;/ 的槲皮素明显降低了胞浆中蛋白和胞核。.蛋白的表达,有效地缓解了 对细胞的炎症损伤作用;槲皮素明显上调子宫内膜细胞中.蛋白 的表达,下调 蛋白的表达,抑制子宫内膜细胞的凋亡。 结论:可引起子宫内膜细胞受损,诱导子宫内膜细胞的过度凋亡;诱导 /免疫平衡偏向于不利妊娠的方向;有效激活子宫内膜细胞中 /.信号通路。槲皮素可明显对抗致子宫内膜细胞的损伤作用,抑制 诱导的子宫内膜细胞的凋亡;使/偏向有利于妊娠的方向:有效阻断 诱导的/.信号通路。 关键词:槲皮素;;子宫内膜细胞;凋亡蛋白./;/;和 .蛋白。 : :. : . ,//../ ?/’出. ,... ,, . ./ 一/. ., , 一. , 一/ ,, . . , . . . ,, , %,一仅,.,, / 一仅 ,, .??, ? .一/. , ? . ,釉. ?. ?. . ., 一 , . 厂 . / . . : / . . / .厂勉 , . / .:, ,一/ ,/, ? .缩写 词表 缩写词 英文全称 中文全称 自然杀伤细胞 大颗粒淋巴细胞 蜕膜巨噬细胞 . 粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素 . 肿瘤坏死因子吨 蜕膜基质 槲皮素 细菌脂多糖 . 核因子 ? 样受体 脂多糖结合蛋白髓样分化蛋白.诱导激酶 辅助型淋巴细胞 细胞因子 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶.一 子宫内膜腺上皮细胞 子宫内膜基 质细胞 主要组织相容性复合体 匣/. ’ :: 培养基 胎牛血清 丙烯酰胺 苏木素.伊红 ?? .亚甲基双丙烯酰胺 . 十二烷基硫酸钠过硫酸铵 匝 ??:?’.四甲基乙二胺 。.含吐温.的缓冲盐溶液 蛐 辣根过氧化物酶 增强化学发光法 氯化硝基四氮唑蓝溶液? .溴.氯..吲哚磷酸二钠盐溶 液 ’,? 。,.二脒基.苯基吲哚磷酸盐缓冲液 二氧化碳 二甲基亚砜 ; 乙二胺四乙酸目录 弓言??.. .着床期母胎界面微环境免疫调控. .着床期子宫内膜细胞的体外培养. .细胞凋亡与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展?.. .. 与细胞凋亡的相关研究? ..槲皮素与细胞凋亡的相关研究??.. . /.信号转导通路与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展 .. 介导,/和信号转导通路研究? ..槲皮素与/信号转导通路的相关研究? . /因子与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展 .. 与/因子的相关研究..槲皮素与/因子的相关研究一 材料与方法.试验动物?. .试验药品?. .主要仪器?. .体内小鼠胚胎着床障碍模型的建立??. ..试剂配制 ..动物处理..动物分组..胚胎着床率和子宫重量计算 . 检测槲皮素对作用小鼠子宫组织病理学变化的影响. ..试剂配制.. ..动物分组.. 染色小鼠子宫.免疫组化检测槲皮素对诱导小鼠子宫中./表达的 影响 ..试剂配制. ..动物分组??. ..免疫组化检测槲皮素对诱导小鼠子宫中./表达的影响?一 .着床期小鼠子宫内膜细胞的体外培养? ..试剂配制一 ..着床期小鼠子宫内膜细胞的分离?. .体外小鼠子宫内膜细胞炎症模型的建立 .. 致炎症作用剂量筛选试验??. .. 致炎症作用时间筛选试验??. .. 检测培养上清中炎症因子.、含量??.槲皮素对诱导小鼠子宫内膜 细胞病理学变化的影响..细胞处理. ..细胞染色? 。检测槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞/表达的影响? ..试剂配制..收集蛋白样品??.. ..蛋白定量?.. ..检测槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞中/蛋白表达的影 口甸 .槲皮素对介导小鼠子宫内膜细胞中/.信号通路的影响?. ..试剂配制 ..细胞加药处理 ..细胞免疫荧光染色? . . 检测槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞中和蛋白的影 响. 检测槲皮素对诱导子宫内膜细胞培养上清中.和的影响.. .。收集培养上清 .. 检测槲皮素对诱导子宫内膜细胞培养上清中.和的影响.统计 学处理??。 结果?. .体内试验? ..不同浓度对胚胎着床率和子宫重量的影响?. ..槲皮素对诱导小鼠子宫病理学变化的影响?. ..槲皮素对诱导小鼠子宫中./凋亡蛋白表达的影响. .体外试验? ..着床期小鼠子宫内膜细胞的体外培养??.. ..体外小鼠子宫内膜细胞炎症模型的建立?。 ..槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞病理形态变化的影响??. ..槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞中./凋亡蛋白表达的影响 。.槲皮素对介导小鼠子宫内膜细胞中/信号通路的影响 ..槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞中.和分泌的影响? 讨论??:;:; .着床期小鼠子宫内膜细胞的原代培养? . 致胚胎着床障碍的分子机制. .. 对着床期胚胎和子宫的影响?。 .. 和着床期子宫内膜细胞凋亡的关系?.. .. 影响着床期子宫内膜细胞中/信号通路的研究.. .. 作用着床期子宫内膜细胞后/的变化。.槲皮素对子宫内膜的 保护作用研究 ..槲皮素与胚胎着床?. ..槲皮素对小鼠子宫内膜细胞凋亡的影响?. ..槲皮素对小鼠子宫内膜细胞中和蛋白的影响??. ..槲皮素对小鼠子宫内膜细胞中厂的影响?. 结论?. 参考文献? 在读期间发表的论文情况??一 作者简介一 致谢.致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 引言 .着床期母胎界面微环境免疫调控 胚胎着床是哺乳动物特有的生理现象,生理过程极其复杂。着床 又称“附植”或“植入”,在着 床期间胚胎与母体子宫内膜细胞表面通过定位、黏附、连接及侵入【】等一系列事件完成着床过程, 是妊娠建立的标志和首要环节。植入前,子宫为着床进行了充分的准备,如子宫内膜细胞增生和 分化,血液供应加强,对异物刺激,特别是对胚胎的化学刺激的敏感性增强等。胚胎着床期间, 胚体外滋养层细胞与母体子宫内膜上皮间建立紧密联系,胚胎和母体子宫壁结合,胚胎最有效地 与母体进行营养物质和信息的交换,从而保证胚胎的正常发育、着床和妊娠。因此,胚胎着床的 过程实质上是胚胎与母体间复杂、精细的多因子双向免疫调控的结果【。 母胎界面是母体组织与胎儿成分直接接触的界面,其局部的免疫应答在妊娠的建立、维持以 及临产的发动中均发挥关键作用。胚胎细胞相对于母体来说是一种半异体抗原,之所以能够正常 植入子宫内膜,得益于母体免疫系统对胚胎的免疫耐受。在母胎界面的免疫耐受调节网络中任何 一个环节出现问题都有可能引起母体对胚胎的排斥,导致胚胎植入失败。母胎界面免疫微环境由 两部分构成,其一是细胞成分,大致分三类:?免疫细胞,包括细 胞、巨噬细胞、细胞及 细胞;?免疫潜能细胞:包括蜕膜基质细胞及子宫内膜上皮细胞;?侵蚀至蜕膜的绒毛外细胞滋 养细胞。其二是细胞因子及其它生物活性物质【】,在胚胎着床期间,具有很重要的调控作用。 母体免疫系统尤其是子宫局部的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原,直接影响妊娠的建立与 ,为主的一系列免疫 维持,母体免疫系统对胚胎的免疫识别受自然杀伤细胞 细胞及细胞因子的调节。在人的子宫内膜中,白细胞约占总细胞数的.%,细胞约占内膜白 细胞总数的.%【,而大颗粒淋巴细胞 ,有突出的胞浆大颗粒, 是主要的自然杀伤细胞,占蜕膜免疫细胞的%%,可能与胚胎着床、发育及胎盘形成有关。 细胞来源于骨髓,细胞数量受到体内雌、孕激素水平的影响,能低水平地溶解细胞,根据其 表面特异性抗原标记.白细胞分化抗原和的表达,将细胞分为、 。、个亚群,其杀伤活性依次降低。研究发现复发性早期自然流产患者 早孕期的蜕膜中,..细胞比正常妊娠显著减少,..细胞则显著增多【。 细胞对于母体子宫内膜蜕膜化及妊娠的维持均具有重要意义【】, 但湖胞过度激活却会引起 妊娠失败。蜕膜巨噬细胞 ,主要分布于蜕膜的细胞滋养细胞周围。在 早期胚胎植入点,巨噬细胞占蜕膜免疫细胞的%.%【】。母胎界面的表达.类抗原, 执行抗原递呈功能,能更有效地清除微生物和异常细胞,保护胎儿免受感染【】。可分泌多种 细胞因子,如粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子.、.、肿瘤坏死因子等,还能 产生一些生物活性物质,如一氧化氮、前列腺素、肾素等,并对局部信号有很强的反应能力,因 此被认为是胎儿胎盘单位细胞因子网络的关键性调节细胞【】。可通过所分泌的炎性细胞因子 诱导早产、流产等病理妊娠。细胞是执行特异性细胞免疫应答的关键细胞。成熟细胞是不均一 的细胞群体,按其表面分化抗原的差异,分为细胞和细胞,二者分别发挥不同的免 疫效应。细胞按激活后分泌的细胞因子不同可分为型和型两个功能亚群,在机体免河北农业大学硕士学位毕业论文 疫调节中发挥不同的作用。妊娠过程,细胞可能有两种作用:一种为免疫营养作用,免疫及 其相关的细胞因子、.等有利于妊娠及正常胎盘生长发育。另一 种为免疫杀伤作用,主 要通过免疫及其相关的细胞因子.、丫影响生殖功能,影响胚胎生长发育。大量的研 究表明:正常妊娠是一种现象,即妊娠母体趋向型细胞及因子介导的体液免疫,避免 型细胞及因子参与的免疫排斥与攻击【】。细胞是是介导体液免疫的主要淋巴细胞,研究发现: 子瘸前期患者、经阴道分娩的产妇蜕膜中细胞含量显著减低,提示其蜕膜局部体液免疫减弱, 细胞免疫相对增耐】。 蜕膜基质 ,是主要的蜕膜细胞,在维持正常妊娠上起着至关重要 的作用【】。子宫蜕膜细胞通过分泌多种细胞因子,具有营养胚泡、内分泌、调控滋养层细胞侵入, 防止胚胎被母体排斥,在保护胎儿生长发育以及妊娠的维持方面起着重要的作用。另外还分泌多 种激素,如催乳素、前列腺素、肾素等,在胎盘局部发挥着重要的生理功能。子宫内膜上皮细胞 具有分泌和营养作用。 母胎界面的滋养层细胞不表达典型的 、类分子,阻止了胎儿一半异体移植物的排斥, 但完全缺乏 类分子的胚胎细胞容易被:细胞杀伤。绒毛外细胞滋养细胞表面可特异性表 达非典型的 类抗原??.及.【】,抗原的表达能够保护胚胎免受细胞 。 介导的溶细胞作用的威胁【 根据细胞分泌物的不同,细胞可分为,和三个亚型。型细胞可 分泌干扰素,,,介导细胞免疫,如细胞介导的炎症反应、迟发性超敏反应 、自体免疫组织损伤以及对抗细胞内细菌与病毒的保护性炎症反应;型细胞可分泌. ,.,.,.,促进细胞增殖与分化、促进抗体尤其是的产生而介导体液免疫; 型细胞则可分泌与的分泌物【】。正常情况下,以为主的免疫应答可抑为主的免 疫应答,研究发现,妊娠中母胎间复杂的免疫应答和免疫调节机制改变了和间的动态平衡。 型免疫及其相关细胞因子,可引起母胎界面炎性反应,损坏胎盘,诱发胎儿流产;型免疫 反应及有关细胞因子有营养支持母体的作用,不足可能导致胎盘形成差,滋养层细胞凋亡甚至胎 儿死亡。研究发现正常的妊娠依赖于型细胞因子,体外诱导型细胞因子向型细胞因子 转换,对妊娠会产生不利影响【们。 在母胎界面免疫微环境中有很多其它生物活性物质与免疫细胞、免疫潜能细胞相互作用。在 妊娠期,胎盘可分泌大量激素,包括雌激素、孕激素、,而蜕膜羊膜分泌一定量的前列腺素 等。妊娠母体雌激素、孕酮、肾上腺皮质激素升高,胚胎或胎儿产生的甲胎蛋白、早孕因子、 、等物质均对妊娠母体细胞免疫功能有抑制作用。体内雌、孕激素的水平影响细胞 的数量。孕激素是维持妊娠的关键的胆固醇类物质,已经被证明是着床中一个重要 的免疫调节因子【】,它在免疫过程中可抑制细胞的增生及其细胞毒作用、减少细胞的活性、 诱导细胞向细胞的分化、改变细胞因子的反应以及上调滋养层细胞.基因表达【引。 雌激素可以调整生殖系统内分泌轴下丘脑.垂体.肾上腺,对、型细胞因子起放大作用。孕 激素促进样细胞优先生长,并诱导细胞向型免疫反应转化。具有延长黄体寿命, 并使之成为妊娠黄体,增加雌激素、孕激素的分泌等功能。还能抑制淋巴细胞的免疫性,以 激素屏障保护滋养层不受母体的免疫攻击。前列腺素具有促进型因子分泌的作用【 ,在的 存在下,淋巴细胞产生免疫调节蛋白,减少、细胞因子的比值,使型细胞因子增 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 多,减少了型细胞因子【】。所以在妊娠期间,激素的分泌和作用使母体免疫向他型转化,偏 离细胞免疫。同样雌激素、孕激素、缺乏,使母体趋于型细胞因子介导的细胞免疫,造 成妊娠疾病。 .着床期子宫内膜细胞的体外培养 正常的子宫内膜由单层柱状上皮和固有层组成,柱状上皮主要由具有分泌功能的腺上皮构 成,固有层的结缔组织细胞称为子宫内膜基质细胞,与网状纤维和基质等成分构成间质。腺上皮 和基质细胞由于受卵巢激素的影响而产生周期性的变化。通常子宫内膜的体外培养指的就是对腺 上皮细胞和基质细胞的培养。体外培养存活时间的长短在很大程度上取决于分离培养细胞的纯 度。因此建立稳定有效的子宫内膜细胞培养系统显得相当重要。 等【】利用.%胰酶 加.%胰蛋白酶,先在下消化. ,再在室温条件下消化 ,成功培养出小鼠子宫内膜 ,再在室温条件下消化 上皮细胞以来,等只利用.%胰蛋白酶先在消化 ,也成功获得了上皮细胞,以后的研究基本都采用他们的方法。国内学者对培养方法进行了 改进,多采用多酶胶原酶加酶消化子宫内膜【】,步骤繁琐,需要时间长消化~,细 胞损失较多。小鼠子宫较小,其上皮细胞的分离和培养困难程度较大,经酶消化后的细胞活力较 低拉引,酶消化时间亦影响腺上皮细胞的产量, 过短残留未消化组织增多,过长对细胞有损伤, 不利于腺上皮细胞生长。我们应当探求一种方法,利用基质细胞体积小,腺上皮细胞体积大且成 团的特点,简化实验步骤,节省时间,细胞损失少,存活率高,减少细胞污染。改进子宫内膜细 胞分离及培养技术,建立人子宫内膜细胞体外培养模型,不仅能为子宫内膜细胞生物学特性、胚 胎着床、子宫内膜疾病等基础研究提供有用的手段,为进一步探查有关不孕、流产的病因和药物 作用机制,对于正确合理有效的治疗具有重要意义。 .细胞凋亡与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展 哺乳动物胚胎着床过程中,胚胎与子宫内膜之间通过复杂的双向识别与相互协调,使处于活 化状态的胚胎在较短的子宫内膜接受期着床窗口期在子宫内膜 贴附,随后滋养细胞植入内膜 与母体底蜕膜共同形成胎盘,维持胚胎进一步生长发育。研究表明在胚胎着床期,子宫内膜发生 了一定程度的细胞凋亡,有助于基质细胞蜕膜化和胚胎着床及妊娠。等认为凋亡是胚泡 得以越过子宫内膜上皮细胞的屏障、最终植入子宫内膜并与母体血管系统建立联系的一个重要机 制。等【 培养母胎界面的蜕膜基质细胞,发现其存在凋亡现象,且有凋亡分子蛋白的表 达,在围着床期,小鼠子宫内膜存在大量凋亡细胞,通过改变水平后,子宫内膜细胞凋亡而 降低胚胎着床。 .. 与细胞凋亡的相关研究 是诱发炎症反应过程中的主要致病成分,具有广泛的生物活性,如细胞毒性作用、组织 损伤、诱发感染等。对于子宫内膜细胞具有双重作用,体现在低浓度促进子宫内膜细胞增殖, 河北农业大学硕士学位毕业论文 可能是活细胞表现出的一种防御反应;在高浓度影响细胞活力抑制子宫内膜细胞生长且呈浓度依 赖性【】。研究显示,过度凋亡是滋养细胞侵入能力下降的重要原 因。对滋养细胞有明显的 凋亡诱导作用,而且呈现显著的剂量依赖关系。无作用下细胞滋养细胞有自发凋亡,低剂量 的凋亡诱导作用较弱,随着剂量的增加细胞凋亡指数明显增加。滋养细胞受到诱导后, 的表达与.凋亡指数正相关。旦.被激活,细胞凋亡将不可避免【】。因而 体外分离培养着床期子宫内膜细胞,可以研究着床期子宫内膜细胞凋亡和胚胎着床之间的关系, 给予诱导后,探求引起子宫内膜细胞炎症损伤导致着床障碍机制中参与其中的一系列 分子和复杂的信号网络,为治疗胚胎着床障碍提供依据。 ..槲皮素与细胞凋亡的相关研究 槲皮素在多种植物的花、叶、果实中分布极广,属于天然的黄酮类化合物,药理 作用强大,近几年成为国内外研究热点。其药理作用有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗粘附、 抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、降低血压以及免疫调节作用【。裴天仙和王丽伟等 研究发现槲皮素对体外培养心肌细胞的凋亡有明显保护作用,其机制可能是通过上调 蛋白的表达或是降低的表达狄而上调./值,抑制.的活性,减少细 胞凋亡。卢 春风等【】研究了槲皮素对异烟肼诱导的大鼠肝损伤及肝组织.和表达的影响,发 现槲皮素可使肝组织中.蛋白表达增加,蛋白表达降低,表明槲皮素可以上调.蛋白表 达下调蛋白表达进而减少细胞凋亡,对所致的大鼠肝损伤具有保护作用。李娜等【】早期 给予膳食槲皮素对大鼠母代生殖极其子代生长发育的影响证实槲皮素无生殖与发育毒性。但是等【】发现槲皮素对细胞增殖的作用可能具有双重影响。槲皮素具有多种生物 学功能,将槲皮素开发为绿色环保型饲料添加剂应用于畜牧业。这对真正意义上减少抗生素等药 物添加剂在饲料中的使用,对我国畜牧业可持续发展具有重大意义。 . /.信号转导通路与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展 样受体蛋白最早是在果蝇体内发现的,对果蝇的天然免疫反应起重要作用【。目前通过 各种不同的激动剂在哺乳动物细胞内发现了至少种。有研究报道,生殖道上行性感染是宫 内感染包括临床或亚临床感染的主要原因,革兰氏阴性细菌是其主要的病原体【。属 于型跨膜蛋白,其中可能是信号转导的主要受体,广泛存在于细胞表面【。有研究显 示参与了妊娠免疫,在胎盘遭受病毒和病原菌感染时,表达明显上调并引发一系列信 号转导,导致炎性介质释放,滋养层细胞凋亡,影响母胎间的免疫平衡导致反复流产的发生【。 诏属于蛋白家族,参与一系列基因表达的调控,与免疫反应、应激反应、 . 炎症的发生及细胞凋亡有关。谢青贞等【】证实了柏参与了小鼠胚泡着床过程,张桂林【】等发 现了奶牛子宫内膜炎症细胞中.的异常活化说明.在妊娠免疫中发挥着重要的作用。 作为最密切的配体,可激活信号转导通路介导妊娠早期细胞滋养层和绒毛膜滋养层细 胞产生典型的以炎症反应和抗炎症反应细胞活素类分泌增多为特征的级联反应【】。 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 .. 介导/.信号转导通路研究 是由结构和功能不同的部分组成:.特异侧链、外核心、内核心和类脂,其中特异侧 链、外核心、内核心是亲水性的多糖,类脂是的生物活性组分。 有一些研究从从分子和基 因水平探索内毒素增敏系统,试验发现介导的细胞激活需要血浆中或细胞表面存在能够与 结合的蛋白质的参与,这些蛋白包括脂多糖结合蛋白?和脂多糖,.复合物与 结合后可介导细胞反应即。一方面创伤、烧伤、休克等应激状态可以引起.表达上 调,使机体对内毒素的敏感性增高;另一方面,组织受到革兰氏阴性菌感染后,内毒素上调 激活多种炎症细胞,释放炎症细胞因子,致使炎症反应不断放大、加重。脂多糖结合 蛋白 ,是一种相对分子质量为的糖蛋白,由肝细胞 合成并分泌入血。为一糖蛋白,是宿主天然防御反应的关键分子,能结合许多微生物配体 和加速免疫炎性介质的表达】。典型的.心是和两个亚基组成二聚体,静息状态下, 蛋白二聚体与抑制蛋白结合成三聚体,无活性而滞留于胞浆,胞外刺激如细胞因子、脂 多糖及氧化应激等均可降解而激活信号传导通路,后者以二聚体进入胞核发挥其功能。 . 是.信号传导通路的关键性激酶。?是高分子量复合体,包括两 个激酶亚 基、【事和一个调节亚基?丫【舶。通常情况下,?可和游离的共存于细胞中,只有当 与.心结合后才对具有极强的磷酸化作用【不。 进入宿主血液后,首先通过类脂与宿主血液的结合【】。主要充当磷脂转移作用 及参与内化作用,使寡聚状态的解离为单体,有利于暴露其内部结构并使之与 分子和接触,起着呈递和催化作用。.复合物将传递给靶细胞细胞膜上的, 形成的衄/三联复合物与细胞膜上的跨膜受体相互作用。可招募胞浆内的一 个接头蛋 ,髓样分化蛋白,胞内区的结构域同胞 浆内的的羧基末端结构域相互作用,活化。活化的氨基末端死亡结构域 与一种丝/苏氨酸蛋白激酶. ,.受体相关激酶的死亡结构域 相互作用,导致的自主磷酸化并与分离,游离于胞浆。游离的与另一衔接分子肿瘤坏死因子受体相关因子 ,发生结合形成复合 物,转而使发生寡聚化;然后可通过接头蛋白 与 ., 家族的成员 . 转化生长因子激活激酶相互作用,使活化。活化的可以磷酸化 ,和诱导激酶的末端区域, 从而激活?,导致的位苏 氨酸残基发生自主磷酸化。再激活榴的抑制蛋激酶,活化的复合体 及使得.复合物中的抑制成分磷酸化而脱颗粒,磷酸化的心即与分离,导 致心的持续活化,活化的柚迁移至核内,启动靶基因的转录【】。在核内.心核转录因 子可诱导众多炎症相关的特异基因如,,.等的表达,引起一系列炎症反应。 ..槲皮素与/.信号转导通路的相关研究 /信号通路是细胞中广泛存在的一种信号转导途径,在免疫、炎症和肿瘤等众多疾 河北农业大学硕士学位毕业论文 病的发生发展中起着很重要作用。近年来对于中药对这一通路的调节作用的研究成为热门,目的 是为了探讨明确中药对相关疾病治疗的分子基础,以为新药的研制与开发提供思路。李莉等【】 研究发现槲皮素可以延长小鼠的动情期和动情前期,使得子宫在组织结构上作出适应胚泡植入需 要的调整并且对于小鼠有明显的免疫增强作用。郑丰杰等【】研究发现对给予急性肺损伤模型大鼠 以清热解毒药配桔梗汤黄芩、栀子、桔梗、生甘草等组成天后注射,结果肺组织病变明显 减轻,而套腰 胞核蛋白表达下降,说明该复方中药可抑心从胞浆活化转移至胞核 中,发挥了解毒抗炎的功效。等【】发现栀子苷可以减少诱导的人脐静脉内皮细胞的 活化由胞浆向胞核的转位。槲皮素作为黄酮类化合物因其具有的广泛的药理作用,近年来受到研 究者的亲睐。研究发现,槲皮素可以通过抑制内毒素诱导的急性肺损伤中、.等促炎介 质的过度释放而发挥明显的保护作用【】;槲皮素可以抑诱导的中性粒细胞活化效应,减少 炎症细胞向炎症局灶的浸润而发挥抗炎作用【】;槲皮素对于诱导的体外培养肝细胞损伤有明 确的保护作用】。槲皮素对引起子宫内膜细胞损伤的保护作用的研究确实鲜见报道。中药及 复方因其具有的疗效好、残留少、毒副作用小的独特优势,目前正逐渐被国内外广泛接受,但是 其作用机制一直不够清澈。通过研究中药调节/信号通路的作用,可以从分子水平阐述 一些中药的作用机理,为一些免疫性疾病、炎症及肿瘤的预防和 治疗提供新思路。然而这一研究 思路有很多疑难问题:/信号通路较为复杂,其信号转导途径及机制尚未完全阐释清楚; 通路中涉及参与的细胞因子繁多复杂,目前根本不清楚中药的具体作用环节;除了中药的治疗作 用外,中药的副作用是否也与/信号通路有关随着中药在该领域的研究逐渐深入,这 些问题将会得到清楚的解答【。 . /因子与胚胎着床障碍的相关分子机制研究进展 表达的淋巴细胞主要为辅助性细胞 ,,可以分为与型。人们发 现/因子对妊娠的作用,主要取决于辅助细胞的免疫作用。细胞主要分泌.、、 等细胞因子,能介导细胞免疫及迟发性过敏反应,可抑制胚胎着床、滋养细胞生长,过度 表达对胚胎具有免疫损伤作用,致病理性妊娠不利于妊娠维持。细胞主要分泌、.、. 等细胞因子,可以抑制型细胞因子的产生,能介导抗体产生,有免疫营养作用,有利于妊娠。 反复性自然流产所表现的母.胎界面免疫耐受异常与辅助细胞及细胞有密切的关系】。尤昭 玲等【研究发现,然流产小鼠和较正常妊娠小鼠明显升高,而几和.表达明显降 低,说明/型细胞因子平衡在妊娠维持中有重要作用;琴梅等【】的研究表明,型细胞因 子.,与其受体相互作用有利于同种异基因妊娠成功。很多研究者证明正常妊娠是一种特殊的 现象,即妊娠期母体是趋向于型细胞因子参与的体液免疫,而避免了型细胞因子参与 的细胞免疫【】。研究显示细胞因子在妊娠正常进展中起着重要作用,在自然流产中又是将病因与 免疫、内分泌、炎症等联系起来的纽带。目前对于影响细胞因子分泌、作用的因素,不同种类细 胞因子在生殖过程中的表达、分布、调控机理及相互之间的关系等,不甚了解,待进一步深入探 讨。 .. 与/因子的相关研究 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 革兰氏阴性细菌是与机体组织长期共生的微生物,耐热性强,需要在?干热 或者 强酸强碱才能将其彻底灭活。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分,是引起炎症反应 的关键细胞毒性因子。临床上子宫受到感染时,病原微生物粘附子宫粘膜,聚集或穿透子宫上皮, 释放内毒素。能诱导粒细胞、子宫内膜细胞等合成和分泌多种细 胞因子,引发子宫内膜炎。 细胞因子是一组调节细胞反应的蛋白质,体内多种细胞产生分泌,既是机体应激反应的需要,是 应激组织损伤发生和发展的病理基础。叶静等将纯化的加入到巨噬细胞培养液中,模拟 细胞在体内受感染的状态,发现分泌量与的浓度呈正相关,但当浓度太大时, 分泌量减少。金婉冰【】等检测到诱导的大鼠蜕膜.、的浓度比正常妊娠大鼠中的 显著升高,、.则明显降低,预示受到刺激后,胎界面免疫反应偏离,倾向于, 引发流产。付灵梅掣】研究发现正常的子宫内膜细胞在受到培养液诱导后,急性炎症早期细 胞因子.、.的分泌浓度随着作用时间增长呈上升趋势。 ..槲皮素与/因子的相关研究 中医药是中华民族的瑰宝。由于中药成分的多样性和中医组方的多变性,其能够多环节、多 靶位发挥拮抗内毒素的作用。中药抗内毒素的机制,归纳起来主要是:清除或灭活内毒素,减弱 或消除内毒素诱发的炎性细胞因子的损伤、对脏器组织细胞的保护作用及免疫调节作用畔】。国内 研究已发现有近百种单昧中药、中药复方和中药化学成分有拮抗 内毒素的作用,尤其许多清热解 毒类中药有直接破坏内毒素结构的作用。穿心莲可以通过抑制内毒素所介导释放的大量炎性细胞 因子.,.和.的活性起到拮抗内毒素的作用【。许锋等【】发现丹参素可以下调内毒素 刺激下分泌的细胞因子几.、.和.仅,这种抑制作用呈剂量依赖性。叶文掣】论述了杜仲 中槲皮素等化学活性成分发挥安胎的药效。中药安胎历史悠久,安胎中药可以增强母胎保护性免 疫功能,降低母胎损坏性免疫功能,调节内分泌;动物实验和现代中药药理学研究也已发现中药 对妊娠期细胞因子平衡有着重要影响,而提示从细胞因子角度进行研究,有望成为研究中医药安 胎机理和提高中医药安胎疗效的突破口。 河北农业大学硕士学位毕业论文 材料与方法 .试验动物 周龄健康纯种昆明系封闭群清洁级未经产雌鼠及雄鼠,平均体重.. ,购于石家庄 河北医科大学实验动物中心。雌鼠只笼,雄鼠只笼。湿度士%,室温士。,室温要 恒定。每日光照时间 ,全价饲料,自由采食饮水,经适应环境周后,阴道涂片法进行发情鉴 。 定。发情母鼠与公:合笼过夜,次日清晨检出阴栓者,定为孕 .试验药品 体内试验,用. ,.的经细菌滤器过滤消毒稀释,配制浓度为 . /;体外试验,用不含血清培养基稀释至. /并经细菌滤器过滤消毒后分装。 、 、 槲皮素,先用少量无 槲皮素,,纯度%,体内分别称取 水乙醇溶解,再加稀释到. /、. /、. /;体外用此溶 解至. /并经细菌滤器过滤消毒后分装为贮存液,用时稀释到、、?./, 最终含量为/。/培养基,由供应;胎牛血清,杭州四季青 生物科技有限公司;青链霉素混合液双抗,、、、,由供应; 蛋白质定量试剂盒,公司;?和,由供应;细胞培养板,购 自;凝胶制备试剂盒、磷酸盐缓冲液,购自;超敏化学发光试剂盒、显影定影试剂盒,均购于上海碧云天生物技术有限公司 ;小鼠.、的检测试剂盒,购自&公司;兔抗鼠、 多克隆抗体、即用型免疫组化试剂盒、显色试剂盒、标记羊抗兔 均购于武 汉博士德公司; ,认,购于;兔抗鼠多克隆抗体、 标记羊抗兔、染色液、标记羊抗兔均购于武汉博士德公司;比, 购自 . ,北京康为 :.. ,; 世纪生物科技有限公司供应。 .主要仪器 ..型电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 北京诺华科技有限公司 . 万像素彩色高清晰度摄像头 江苏省金坛市医疗仪器厂 .精密恒温水浴锅 北京医用离心机厂 低速离心机 上海民桥精密科学仪器有限公司 精密电子天平 上海安亭科技仪器厂 .台式离心机 上海三科仪器有限公司 酶标仪 ..滑走切片机 日本东京爱尔玛公司 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 加光学显微镜 重庆光学仪器厂 .型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 . 海尔冰箱 青岛海尔股份有限公司 . 培养箱 日本三洋公司 医用型洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司 .倒置生物显微镜 重庆光电仪器总公司 博劢行仪器有限公司 电动移液器 . /型空气压缩机 泉州恒德集团有限公司 .自动三重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 .磁力加热搅拌器 江苏省金坛市医疗仪器厂 .直立式超低温冰箱 型笔式酸度计 北京哈纳科技有限公司 ?型微型台式真空泵 绍兴市卫星医疗设备制造有限公司 . , . . , . . 型垂直板电泳槽 北京市六一仪器厂 .型电泳仪 北京市六一仪器厂 .体内小鼠胚胎着床障碍模型的建立 ..试剂配制 .. . .双蒸水 溶解,定容至 ,调值.。注意,数字和单位之间空格 母液 .?贮存 组:. 母液无菌生理盐水. ,浓度为. ,即含 /,尾静脉注射. . ; 组:. 母液无菌生理盐水. ,浓度为. ,即含 /,尾静脉注射. .; 组:. 母液无菌生理盐水. ,浓度为. ,即含 /,尾静脉注射. . ; 组:. 母液无菌生理盐水. ,浓度为. ,即含 /,尾静脉注射. 河北农业大学硕士学位毕业论文 .; 组:. 母液无菌生理盐水. ,浓度为. ,即含 /,尾静脉注射. .。 ..动物处理 纯种昆明系封闭群清洁级周龄,未经产雌鼠及雄鼠,雌鼠只一笼,雄鼠只一笼。室温 ,湿度%,全价饲料,自由采食饮水。适应环境 后,交换垫料,阴道涂片法 进行发情鉴定。阴道外观若红润或肿胀,开口较大,初步判断可能处于发情期,然后进行阴道涂 片加以确认。阴道涂片上皮细胞成分的变化为:动情前期,上皮细胞不很多,主要是嗜碱性或失 去着色性的细胞,有的细胞形似蝌蚪,细胞质染色不均或时有空 泡。另有少量有核的角化细胞及 白血球;动情期,几乎全是无核的角化细胞,伊红染色,没有白血球;后情一期,出现成团块或 成片的角化细胞,有时有极少量的白血球。处于动情前期、动情期、后情一期的小白鼠接受交配。 发情母鼠与公鼠:合笼过夜,次日清晨检出阴栓者,定为孕 。 ..动物分组 将怀孕母鼠随机分为组,只/组。组为对照组,孕、尾静脉注射无菌生理盐水.; 组,孕 、 尾静脉注射. 注射液. . 、 / 含 ;组,孕 尾静脉注射. 、 / 注射液.含 .肛;组,孕 尾静脉注射. / 注射液. 含 . 、 尾静脉注射. ;组,孕 注射液. ./ 含 . 、 尾静脉注射. 注射液. 含 ;组,孕 ./ .肛。 注射药剂后每天注意观察小鼠有无异常情况,各组于孕 采样。 ..胚胎着床率和子宫重量计算 孕 颈椎脱臼处死小鼠,打开腹腔,暴露子宫,观察子宫生长情况,记录胚胎着床数和发 生胚胎吸收的死胚数。在冰盒上取出完整子宫,剪除子宫系膜及脂肪,称重。纵向剖开子宫角, 小心剥去胚胎后称量子宫净重。 正常胚胎为光洁粉红色,呈串珠状分布,大小均匀。解剖镜下观察胎膜轮廓清晰,无出血、 淤血现象。发生吸收或死亡的胚胎,因伴有缺血、出血和坏死致使其体积明显小于正常存活胚胎, 胚泡萎缩消融,时间较长灰黑的死胎脱落在宫腔,解剖镜下观察模糊一片,没有正常胎膜结构。 计算各试验组的平均着床胚泡数:平均着床胚胎数总着床胚胎数/孕鼠数 . 检测槲皮素对作用小鼠子宫组织病理学变化的影响 ..试剂配制 槲皮素 称取 皮素,先用少量无水乙醇溶解,再稀释. /作为高剂量槲皮素组, 再倍比稀释到. /作为中剂量槲皮素组,. /作为低剂量槲皮素组。 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 苦味酸饱和溶液 . 苦昧酸 水 ’液 苦味酸饱和溶液 甲醛 ..动物分组 孕鼠随机分为组,组于孕 尾静脉注射 .,组于孕 尾静脉注射 / .。、组小鼠于孕~每天各灌服.;~组小鼠于孕~每天分别灌 服. 不同浓度槲皮素:. /、. /、. /,每天次。以上各组小鼠于 孕天眼球采血,颈部脱臼致死,取完整子宫固定后,制备石腊切 片。 .. 染色小鼠子宫 石蜡切片制备: ?%乙醇 %醇 .脱水:修剪适当大小子宫组织%乙醇过夜,第二天%乙醇 %乙醇 ; 一%乙醇?%乙醇 .透明:无水乙醇:二甲苯: ?二甲苯 .透蜡:软蜡,硬蜡 ; .包埋:将组织块移入已融化石蜡的包埋器中,待石蜡表面冷却后, 立即投入冷水中冷却变硬成 为组织蜡块; .切片:组织蜡块经修整后,固定于标本台上,用石蜡切片机切成 厚的切片标本; .贴片:在?恒温水浴锅展片,置于?烤箱内 以使切片紧密贴 附,。烤箱内烘干 备用。 染色过程: .脱蜡:二甲苯 次; .复水:无水乙醇、%乙醇、%乙醇、%乙醇、%乙醇、蒸馏水各 .苏木精染色:苏木精染色 ,.%酒精分色,立即在自来水中冲洗 ,入伊红染液,自来水洗去多余染液; .伊红染色:入蒸馏水洗去碱性水分,%酒精 .脱水:%乙醇、%乙醇、%乙醇、%乙醇各 .透明:二甲苯,各 ; .封片:中性树胶封片; .显微镜观察,采集图像。 .免疫组化检测槲皮素对诱导小鼠子宫中./表达的影响 ..试剂配制河北农业大学硕士学位毕业论文 免疫组化专用.. ..蒸馏水 枸橼酸缓冲液抗原修复用 . 枸橼酸三钠 枸橼酸. 蒸馏水 显色液 取 双蒸水加入一滴?液浓缩缓冲液,混合均匀后,/液溶液和 内使用, 液浓缩过氧化氢液各一滴,混匀。此溶液必须现用现配,配好后避 光保存, 剩余液体应弃掉。 ..动物分组 . ,组于孕 孕鼠随机分为组,组于孕 尾静脉注射 尾静脉注射 ./ . 。、组小鼠于孕 每天各灌服 . ;组小鼠于孕 每天分别灌 服. 不同浓度槲皮素:. /、 /、. /,每天次。以上各坌/鼠于 孕天眼球采血,颈部脱臼致死,取完整子宫固定 后,制备石腊切 片。 ..免疫组化检测槲皮素对诱导小鼠子宫./表达的影响 .切片常规脱蜡至水:二甲苯 次;无水乙醇、%乙醇、%乙醇、%乙醇、%乙 醇、蒸馏水各 ; 份蒸馏水份混合,室温 以灭活内源性酶;蒸馏水洗次; .% .热修复抗原:将切片浸..枸橼酸盐缓冲液 .,微波炉加热至沸腾后断电,间隔分钟 后,反复.次;冷却后用洗涤次; .滴加正常山羊血清封闭液,室温 ,甩去多余液体,不洗; 后?过夜;先 次; .滴加适当稀释的兔抗鼠.、多克隆抗体,? ;洗次; .滴加生物素化山羊抗兔,。 .滴加试剂,? ;洗 次; .显色:室温显色.镜下控制反应时间, 证左右;蒸馏水洗涤终止显色; .脱水,透明,胶封片; .显微镜观察,采集图像。 .着床期小鼠子宫内膜细胞的体外培养 ..试剂配制 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 . ./.培养基:/一袋, ,超纯水磁力搅拌溶解,调 .,加水至,过滤除菌,保存备用。 胎牛血清:将未灭活的胎牛血清置于?的水浴中,灭活 ,分装,.?保 存背用,用前过滤。 .%含胎牛血清培养基:取 灭活后的胎牛血清,加入到 /.培养 基中搅拌混匀,调到.,过滤除菌,分装,?保存备用。 . . . 磷酸盐缓冲液: .妒. ,加超 纯水磁力搅拌溶解,调至.,再加超纯水定容到,高压灭菌后保存备用。 :,加不含血清培养基,细菌滤器过滤消毒,浓度为 / 为母液:取.母液,加 不含血清培养基,细菌滤器过滤消毒,浓度为. /为 储备液;使用前用.%含胎牛血清培养基稀释到所需浓度。 槲皮素,,:. 槲皮素,用儿溶解,不含血清培养基 补充到,细菌滤器过滤消毒后分装,浓度为. /为贮存液;用时稀释到、、 /,最终含量为/。 ..着床期小鼠子宫内膜细胞的分离 .取妊娠. 小鼠,快速颈部脱臼法处死; .腹部%酒精消毒,迅速无菌取出子宫,置于预冷的中,去除多余脂肪后,用 液漂洗次; .纵向剪开子宫,用镊子撕取子宫内膜后剪成.~. 的糊状,加入新鲜的含.%的 /培养基,吹打均匀后接种到细胞培养板中; .置。、%、饱和湿度的培养箱中培养,次日换液,清除未贴壁的组织块,加入足够培 养液,每隔~ 换液。 .体外小鼠子宫内膜细胞炎症模型的建立 .. 致炎症作用剂量筛选试验 待细胞长满%后,用.%胰酶消化至孔板中,选用法进行剂量的 筛选。法原理:是一种黄色的四甲基偶氮唑盐,可被活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶转化 产生紫色的甲瓒结晶,而死细胞无此功能,不能形成甲瓒结晶,故该法可用于测定活细胞量,该 法灵敏度高,重复性好,简便快捷,是目前最为常用的方法。 取孔细胞培养板中生长良好的细胞,随机分为组个不同浓度的组、、、 、/和个对照组每组个孔,各组换液时每孔加皿含不同剂量 的培养基,空白对照组添加皿的/.培养基不含血清。放入?、%培 养箱中培养,观察细胞培养情况,在分别培养和后各组细胞每孔加入 /的 皿,继续温育 后终止培养。吸弃孔内培养上清液此,加入此,震荡。 在酶联免疫检测仪上,测定 波长处各孔的吸光值,以不加细胞的孔调“”,记录结果。计 算药物对细胞的抑制率?巡%,确定的最佳浓度和作用时间。计算公式如下?对 照孔吸光度一模型孔吸光度?对照组吸光度×% 河北农业大学硕士学位毕业论文 .. 致炎症作用时间筛选试验 待细胞长满%后,用.%胰酶.消化至孔板中。将细胞随机分为组,每组 个样本,空白对照组、模型组、模型组、模型组、模型组、模型组。根据前面 的诱导剂的细胞毒试验所确定的浓度给各组施加药物。分别收集、、、、 时间段的细胞培养液,离心后取培上清液,方法检测、的含量变 化。同时每 个时间段用倒置相差显微镜进行各组细胞的形态学观察。 .. 检测培养上清中炎症因子.、.【含量 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被.或.抗 体的包被微孔中,依次加入标本、品、标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物 显色,在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色 的深浅和样品中的。或呈正相关。用酶标仪在衄波长下测定吸光度值, 计算样品浓度。 试剂盒组成: 名称 孔配置 微孔酶标板 条×条 标准品 .管 样品稀释液 检测抗体. ×洗涤缓冲液 底物底物 终止液张 封板膜 说明书 份 自封袋 个 注意:标准品.浓度依次为:、、、、、 / 洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按:稀释,即份的洗涤缓冲液加份的蒸馏水。 操作步骤:。从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回。。 .设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品儿。 .样本孔先加待测样本旺,再加样本稀释液此;空白孔不加。 .除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体 , 用封板膜封住反应孔,。水浴锅或恒温箱温育 。 .弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置 ,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此 重复洗板次也可用洗板机洗板。 。 .每孔加入底物、各此,避光孵育 .每孔加入终止液儿, 内,在 波长处测定各孔的值。 致胚胎着床障碍的分子机制及槲皮素的保护作用研究 结果判定:绘制标准曲线:在工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应值作纵坐标, 绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。注意,按照说明书操作是样本已经 稀释倍,最终结果乘以才是样本实际浓度。 .槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞病理学变化的影响 ..细胞处理 将经泡酸、三蒸水洗、高压消毒及包被多聚赖氨酸的盖玻片置六孔板内,待细胞铺板达% 后,将细胞分为五组,组为空白对照组,添加不含血清培养基;组为模型组,根据前面的诱 导剂的细胞毒试验所确定的浓度和时间处理;、、分别给予、、 /槲皮 素处理,根据前面的诱导剂的细胞毒试验所确定时间进行处理。 ..细胞染色 .取出细胞培养板,各孑吸弃培养基; .取出盖玻片,用洗次; .用%酒精固定 ; . 次; .浸入苏木精染色液中,染色 ,自来水浸洗 .浸入稀盐酸酒精溶液中分色 ,自来水浸洗 ; 使胞核蓝化,自来水浸洗 : .浸入淡氨水中 .浸入伊红染液中 ,染红胞质,自来水浸洗 ; .待玻片自然晾干后,在载玻片上滴加少许中性树胶,将有细胞的 一面向下固封于载玻片上,晾 干:.显微镜下观察细胞形态变化并采集图像。 . 检测槲皮素对诱导小鼠子宫内膜细胞 ./表达的影响 ..试剂配制 细胞裂解液唧 .. % .. . 蒸馏水 混匀备用。 河北农业大学硕士学位毕业论文 %丙烯酰胺 丙烯酰胺 .亚甲基双丙烯酰胺 双蒸水定容至过滤后置棕色试剂瓶内,?贮存。 浓缩胶缓冲液:. ,. . 加水溶解,的盐酸调节.,双蒸水定容至, ?贮存。 分离胶缓冲液:. ,. . ?贮存。 加水溶解,的盐酸调节.,双蒸水定容至, %十二烷基硫酸钠/ 双蒸水定