探究青霉的筛选及其大量产生纤维素酶的Ph值

探究青霉的筛选及其大量产生纤维素酶的最适PH值及温度 引言 纤维素是自然界含量最丰富的碳水化合物，占到了总生物量的80％，因此在当今能源和资源日趋危机的年代，借助于纤维素酶将纤维素资源转变为人类所需的物质显得尤为重要，而对于纤维素酶的开发利用研究，也具有深远意义。目前，纤维素酶广泛运用于酿酒、食品、饲料、造纸、制药、环保、石油开采等工业，具有很大的市场需求量。 纤维素酶在自然界的分布很广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，甚至哺乳动物中的反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有能够分解纤维素的细菌存在。但是，植物中虽然广泛存在有纤维素酶，但从其中提取纤维素酶比较困难，而且含量不高，所以目前研究运用比较少；而动物体内对于纤维素的消化主要是依靠其消化道内共生的微生物、原生动物来完成，即使研究已经证明动物体内本身确实存在内源性的纤维素酶[1]，但由于动物中相关研究的复杂性，成本和提取等方面的问题，动物中的纤维素酶的研究运用也不多；所以，目前纤维素酶的运用还主要集中在微生物纤维素酶的运用上。纤维素酶的产酶菌很多，主要有细菌、放线菌和丝状真菌。丝状真菌的纤维素酶产量较高，可达20g/L以上，而且丝状真菌产酶具有诸多优点：产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理。因此，目前丝状真菌所产的纤维素酶研究较多。而这其中活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉、腐质酶和青霉等。青霉除了产生大量的纤维素酶外还可产生较高的葡萄糖苷酶，从而弥补木霉产葡萄糖苷酶不足的缺点。 目前过去青霉主要在工业上用于青霉素的生产，如今随着其他各种抗生素的开发生产，青霉素的市场前景面临威胁，经济效益下降是青霉素生产面临的最大困难。所以开发青霉工业批量生产纤维素酶的条件在青霉的工业应用上就显得更有意义和经济价值。 1 材料 1.1 材料 1.1.1 菌种来源 在已经霉变的桔子皮用刀片刮取可见霉块2.5克 1.1.2分离菌种和斜面菌种培养基 马铃薯糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200g，蔗糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000ml,自然pH值。 1.1.3鉴定菌种培养基 察氏纤维素培养基：蔗糖 30g，硝酸钠 2g，磷酸氢二钾 1g，七水合硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，琼脂 20g，纤维素 5g，琼脂 20g，蒸馏水 1000 ml,pH 7.0-7.2。 1.1.4粗酶发酵培养基 Hagerdal Medium培养基：10×macro salts 100ml，50×micro salts 20ml，酵母浸膏 1g，硫胺素 1mg，生物素 1mg，蒸馏水 1000ml。（10×macro salts：氯化钠 1.5g，硫酸铵 3.1g，磷酸氢二钠 9.1g，磷酸二氢钾 0.9g，蒸馏水 100ml；50×micro salts：EDTA 0.05g，硫酸镁 0.2g，硫酸锌 0.008g，硫酸铁 0.02g，硫酸锰 0.015g，氯化钙 0.02g，蒸馏水20ml）。 1.2 实验方法 1.2.1 菌种的分离与纯化 分别称取0.5g带有霉块的样品五份，制备浓度为10-2的样品悬液（主要是为了分离霉菌），分别标号1、2、3、4、5号，将样品悬液进行涂布，在29℃的温箱中培养3-5天。然后对长出的菌落进行划线，在29℃的温箱中培养3-4天，课多次重复此步骤直到找出生长较好的菌株，并对其进行察氏纤维素鉴定培养基的点种。 1.2.2 透明圈筛选法 对点种在察氏纤维素鉴定培养基上的菌株进行测定透明圈直径（d）与菌落直径（D）之比（d/D），以此比值来衡量纤维素酶产生能力的大小，从而进行纤维素酶产生菌的初筛[7]。 1.2.3 青霉的筛选与分离 在显微镜下观察点种在察氏纤维素鉴定培养基上的菌株，结合青霉菌株的显著特点分离出青霉菌株 1.2.4 酶活力的定义和测定 纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，由EG（内切葡聚糖酶）、CBH（外切葡聚糖酶）和CB（纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶)构成。其降解过程是纤维素酶分子吸附到纤维素表面，然后，EG在葡聚糖链的随机位点水解底物，产生寡聚糖；CBH 正是这些酶组分协同作用，最终将纤维素水解为了葡萄糖。以滤纸作为底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，可将滤纸分解打孔，测得一段时间后孔的直径作为衡量酶活力的大小的标准。 1.2.5 不同温度下粗酶液的制备 将筛出的菌株等量接入液体培养基中，在摇床（20\30\40\50\60\70℃，200r/min）中培养2天，然后取培养液以4000r/min的速度离心20分钟，分别取等量上清液即为粗酶液，分别标号w20,w30,w40,w50,w60,w70. 1.2.6 不同温度下青霉的纤维素酶产量的测定 将一块面积为10×10cm的滤纸打薄并用铅笔划线将其划分为面积相等的六块，分别标记为w20,w30,w40,w50,w60,w70.在相同温度下，再将所提取的粗酶液滴加10滴（等量）在相应区域上的中央位置，每一小时后记录一次滤纸上被分解处的直径大小。八小时后停止。 1.2.7 不同Ph值下粗酶液的制备 将上步实验中酶产量最高时的温度记为t,分别将青霉菌株接入液体培养基中，在摇床（t℃，Ph=2\3\4\5\6\7\8\9,200r/min）中培养2天，然后取培养液以4000r/min的速度离心20分钟，取等量上清液即为粗酶液，分别标号p2,p3,p4,p5,p6,p7,p8 1.2.8 不同Ph值下青霉的纤维素酶产量的测定 将一块面积为10×10cm的滤纸打薄并用铅笔划线将其划分为面积相等的八块，分别标号p2,p3,p4,p5,p6,p7,p8。再将所提取的粗酶液滴加一滴（等量）在相应位置上，每一小时后记录一次滤纸上被分解处的直径大小。八小时后停止。 2 结果 2.1 霉变桔子表面真菌的筛选结果 表1：霉变桔子表面真菌的筛选结果 种类 青霉 毛霉 木霉 曲霉 菌落数目                   2.2 温度对青霉产生纤维素酶量的影响 表2：青霉在不同温度下纤维素酶的产量 编 号 小 孔 直 径 培 养 时 间 W20 W30 W40 W50 W60 W70 1h             2h             3h             4h             5h             6h             7h             8h                           *w后的数字表示培养的温度 2.3 Ph值对青霉产生纤维素酶量的影响 表3：青霉在不同Ph值下纤维素酶的产量 编 号 小 孔 直 径 培 养 时 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 1h                 2h                 3h                 4h                 5h                 6h                 7h                 8h                                   *P后数字表示培养的Ph值 3 结论