口腔鳞癌组织中染色体3p142区杂合性丢失的研究

口腔鳞癌组织中染色体3p142区杂合性丢失的研究 口腔鳞癌组织中染色体3p14.2区杂合性丢 失的研究 36中国医科大学JChinMedUnlv第28卷第1期1999年2月 腔鳞癌组织中染色体Spl4.2区杂合性丢失的研究 赵邓钟鸣 7rt (中国医科大学口腔医学院种植中心辩,沈阳110001) 摘要目的齄洲口腔鳞癌组织中3p14.2区D3S1300位点丢失情况,为新的抑癌基因定位提供依据方法:应 用聚台酶链反应(PcR)技术以D3S1300位点教卫星多态为遗传标记,检测口腔鳞癌组织中谊位点的杂台性丢失 (Lossofhetcrozygosity,L0H)状'无.结果:22倒口腔鳞癌17侧提供信息,7侧出现杂台性丢盘一LOH率为-l1 (7117),有2倒出现擞卫星的不稳定性.结论:3p14.2区D3S1300位点杂奋性丢失可能与口腔鳞癌的发生发展相 关,提示该区域可能存在口腔鳞癌的押癌基因,谖区的错配修复基因突变可能是口腔鳞癌蛊生的一个新机理 关键调并桃细胞癌I口腔癌I抑癌基因I杂台性丢失,l杳 LossofHeter0zyg0snyonChromosome3p142inOralSquamousCellCarcinoma HeJianfei,LiRuiw'u. <TeethImplantingCenterofSchoolofOralSciences ZhaoYanyan,etal ChinaMedicalUniversity,Shenyang,110001 ABSTRACTObjective:Todiscussthepotentiallossoftumorsuppressorgenelocionchromo some3p14.2in ora1squamouscel1carcinoma(0Scc)andtoprovidemeterialsforlocatingnewsuppressorge ne.Methods:We8n— alyzed22tmiringmicrodissectedsampleso{normaltissuesandOSCCfromthesamepatients.LOHwasdetected byexamingmicrosatellitepolymorphicsequenceinlociD3S1300(3p142)byusingPCR.Results{In7o{17 (41),LOH惴 foundat3p142(D3S1300)Microsatelliteinstabilitywasfoundintwo0SCC.Conclusion: Thissuggestedtkattherewasfrequentlosson3p14.2inOSCC.Thereprobablyexitasuppressorgenewhichis importantinoncogenesisandprogressiono{OSCC.Themismatchrepairgenewhichbelongstoneitheroncogene norsuppressorgeneprobablyalsoplaysanimportantroleinOSCC. KEYWORDSsquamouscellcarcinomaIoralc~cer}tumorsuppressorgene{losso{heterozygoslty 抑癌基因失活常伴有邻近DNA多态标记的缺 失,如果该DNA多态在体细胞呈现杂合状态+则可 观察到杂合性丢失(Lossofheterozygosity, LOH).此现象可提示目标区域与所研究癌瘤的 发生发展相关,并可提示该区可能存在抑癌基因.对 口腔鳞癌的研究已观察到5p,9p存在杂合性丢 失,也有学者提出3p存在头颈癌的丢失位点0. 为了研究3pl42区与口腔鳞癌的关系,为新的抑癌 基因定位提供依据,作者检测了D3S1300位点微卫 星标记在22例口腔鳞癌的杂合性丢失情况 l材料与方法 1.122例口腔鳞癌组织标本来自第一临床学院口 腔颌面外科,取癌组织及距离癌组织2cm以上的正 常组织各Icm左右,均经病理证实.用生理盐水冲 洗后置一7O?冰箱中冻存. 1.2扩增D3S1300位点微卫星多态的引物按文献 第一临床学院口腔颤面外科 基础医学院医学遗传学教研室 [4]设计,由上海西克斯生物技术有限公司台成. ix3zP—dcTP购自北京亚辉生物工程公司.其它试剂 由中国医科大学遗传学教研室提供 1.3显微切割,用饱和盐水法提取DNA. 1.41OI反应体系中DNA1o0"g—TrisHcllO mmo[/L(pH8.0).KCi50mmol/L.MgCI21.5 mmol/L+dNTP混合物0.12mmoi/L.Taq酶1u. aPdCTP1/xCi+引物各250nmol/L.无菌水加至 1O,加10I石蜡油覆盖.混匀,离心片刻,进入 PCR循环.95?变性2min詹循环94?50s一55C 50s72?1min.31个循环.最后72c延伸5min 1.5PCR扩增产物用甲酰胺变性示踪液稀释2 倍,95?12min变性,取2加样.经含7mol/I_尿 素和1O甲酰胺的6聚丙烯酰胺凝胶电泳50C, 8Ow,I.5h分离,真空干燥.,70c下加增感屏与 x线片曝光24,48h,放射自显影与正常组织相 比,癌组织基因组DNAPCR扩增产物带消失1条 或其中1条带密度减弱50以上时则为LOH 刀由 一 ,^U 第l朔贺剑飞等.口腔鳞癌组织中染色体3p14.2区杂合性丢失的研究 2结果 2.1微卫星标记D3S1300位于3p14.2区,与t(3 8)及FRA3B脆性位点的关系如图1所示. 要堡 宝 囤1D3S13OI~与"38)及FRA3B的位置关秉 2.222例口腔鳞癌组织,17例提供信息,7例出现 杂合性丢失,占41(7,/17),2例现为微卫星不稳 定性,放射自显影如图2所示. 图2D3S13OO杂台性丢失电最照片 OC1,OCg,OC.6,OC7,OC9,OC10,OC13为杂台性丢失 OC4,OC5,OC8,OC14~OC17,OC19,OC21为杂旨状态 OC12,O(218表现为傲卫星不稳定性; OC3,OC11,OC20,OC2z不提供信息 3讨论 口腔鳞癌的发生涉及多种因素的作用.在分子 生物学水平探讨其发生机理越来越受到学者的关 注,此过程主要包括癌基因的激活和抑癌基因失 活.抑癌基因失活常伴有邻近DNA多态标记的 丢失,反之,观察到某一区域DNA微卫星标记的杂 台性丢失则提示此区存在抑癌基因"最近的研究 表明,3p丢失在头颈鳞癌达6O,75.本实验 针对D3S1300进行杂台性丢失的显示3pI42 区可能存在口腔鳞癌的抑癌基因,这与以前的报道 相一致】至于本结果频率稍低,原因可能有:二:(1) 本研究仅应用一个微卫星标记,只反映此一位点的 缺失频率;(2)本研究应用临床切除的原发标本,与 用细胞株作为实验对象的研究相比-缺失频率由于 受正常组织的干扰而稍低,这有待于实验方法的提 高.D3S1300位点与FRA3B和t(3;8)相邻.而后二 者被认为与抑癌基因的异常表达相关.它们与抑 癌基因在肿瘤发生中的交互作用尚不明确,有待于 进…步研究.本实验同时发现2例表现出微卫星不 稳定性,此现象首先在结直肠癌中观察到,由于特异 存在于肿瘤细胞中,被认为可能是肿瘤细胞的又一 标志.Bronner等".认为微卫星不稳窟性是由于 负责碱基错配修复的基因发生突变而导致的.并且 这种基因已被证实既非癌基因又非抑癌基因,是另 一 类的肿瘤相关基因.本研究发现3p14.2区 D3S1300位点在口腔鳞癌出现微卫星不稳定性.提 示位于3p的错配修复基因突变也是口腔鳞癌发生 发展的机理之一.因此,对3p的深入研究有助于阐 明口腔鳞癌的致病机理,并为探索定位新的抑癌基 因提供宝贵资料 参考文献 1WeinhergRATumorsup10relasorgene~.Science?1991?354 (5033】?l1S8l146 2lshwadCS.Lossofheterozygosityoftheshort…ofchromo some~3and9inoFa】can—lntJCaneer.1996.69(1):1,4 3ChuLW.PhilipS.AndrewP.atDetetionmappingonthe shortaT孙ofchromosome3insequamouseel】dreinomaofthe D伯】cavityCancerRes,1994,34(24】:6484—6435 4ManS.EllisIO.SbberingM,eta1.Highlevels.fallele]ossH: theFHITandATMgenesin?eomedoduc*aicarcinomain situandgradeItubularinvasiveb~astancrHCancerRes? 199fi,56【23):5484—5489 5ZhungZ—BertheauP.Emme~BuchMRttatAmicrodissec tlontechniqueforarchivalDNAanalysisofspecificcellpopula tionsinlesions<1in1AmJParhot.1995.146c3】 520625 6林长坤姜莉.张励.一种实用的基因蛆DNA提取方{击厦其应 用中国医科大学.199827(4):44D 7VanderRP.Nawro~H.HrubanRH,etalFreque~l】.of ~hrgmosome郎Zl一22~ar[yLnheadndnkn…pr.ge sionC~ncerRs,1994t54【5)l1156--】58 8享万渡.限制性片段长度多奄性和杂台性丢先与肿癌研竞 华遗传学杂志,l9g3,10【5):237,290 9MaestroR.GasparottoD.VuksavtjevicT.BitrTmnLal Thrdiscreetreg;ons0fdeletioninhead?11【1neck…Ts CancerRes1993.3S(23】:5775—5779 10Yanagisa~aK.Knr~4oM?O~adaH,e1;11Molecularnnalysis oftheFHITgeneat3p142:nlungc~ncercelllinesCancer Res.199555<24).5579—5582 1lYuri1I—MiguelAPeinadoSergeiM,eTtL】ubiquitous一1日 Lmutationsinslmpie…Itdsequencesreveala…me~'ha n:smforcoloniccaax'inogenesN~trure.1993.363(54蚺】 538—56l 12BTo~nerCE.S…MBakerP丁.talMu:tlonintht,DNA mismatcherpa;rgenehomoioguehMLH1…I…LaTedwith hereditarynon—oilyposiscolon…crNm.199【.3? (6463)258—231 (19981015收犒)