瘦肉精检测技术

摘要:瘦肉精是一种引起广泛关注的非法饲料添加剂，人食用瘦肉精超标的肉制品会引起严重的不良反应，本文讲述了瘦肉精危害以及检测。 关键词:瘦肉精 残留 检测方法 Abstract:Clenbuterol Hydrochloride was a illegal feed additive which caused wide attention. It would bring serious harmful reaction if people eated Clenbuterol Hydrochloride. The article discussed toxicology and the way of assay of Clenbuterol Hydrochloride. :Clenbuterol Hydrochloride residue assay Key words 1 盐酸克伦特罗概述 盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride，CLB)，又名瘦肉精，药品名为克喘素、氨哮素等，为白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化学性质稳定。它是一种B:肾上腺素受体激动剂，最早作为止喘药用于防治哮喘和支气管痉挛。20世纪70年代末，美国等发达国家开始了将CLB用作“营养重分配剂”及“促生长剂”的实用性开发研究，20世纪80年代后期，我国部分大专院校和科研机构也开始向饲料企业和养殖户推广这类物质作为饲料添加剂使用，但很快发现它在畜牧业发展和食品安 。 全方面的副作用，便全面禁止其使用 2 危害性 2(1 对动物的影响 (1)扩张气管，影响肌肉蛋白质、脂肪代谢及肝脏中的糖代谢，严重影响动物正常的生长发育。(2)糖降解作用不足，导致猪肉品质下降 (3)容易发生蹄损伤和跛行，大运动量会造成死亡，高温条件更容易发生。 2(2 对人的影响 自从上世纪80年代中期，欧美国家发现CLB的毒副作用以来，至今世界范围内已有数以千计甚至万计的人因食用残留有CLB的动物性产品而中毒。CLB残留引起的中毒事件最早发生在西班牙。在我国，最早披露的中毒事件发生在香港。今年三月份，中国最大肉制品加工企业双汇也发生了令人震惊的“瘦肉精事件”，对国家企业消费着造成了巨大的伤害。人中毒后主要表现为:(1)心肌收缩加强，心率加快，产生心悸、心慌;对原有心脑血管疾病、糖尿病、冠心病、甲状腺功能亢进、青光眼、前列腺肥大者可导致心动过速，室性期前收缩，甚至中毒性心肌炎、心肌梗死，心电图可呈S—T段压与T波倒置或低平等现象。(2)面颈、四肢肌肉颤动，有恶心、呕吐、头晕乏力、手抖甚至不能站立等现象。(3)孕妇中毒可导致癌变，胎儿致畸。 3 控制标准 检验CLB对动物和人构成严重危害，世界各国纷纷颁布法规，禁止将其用作生长促进剂。从1986年开始，欧美等发达国家已严禁畜牧生产中应用CLB，我国农业部在1997年3月以[农牧发(1997)3号文]严令禁止B一肾上腺素类激动剂在动物生产中的应用”。美国食品药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)建议CLB在动物组织中最高残留限量(MRL)分别为:肉0(2μg,kg，肝0(6μg,kg，肾0(61μg,kg，脂肪0(2μg,kg，奶0(051μg,kg。部分欧盟成员国如英国规定可食性组织中MRL值为0(5μg,kg，荷兰规定牛、马肝脏组织中的MRL值为0(51 μg,kg。 4 残留检测方法 瘦肉精检测方法有:简易检验法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱一质谱注(GC—MS)，毛细血管区带电泳法(CE)，免疫技术(IA)。这些是目前国内外用于检测CLB的常用方法，但都不是十分理想(新兴的滴金免疫技术(DIGFA)和生物传感器技术(BS)以及荧光免疫分析法由于三者明显的技术优越性(将会成为瘦肉精主要检测方法。 4(1 感官识别 屠宰前，让待宰生猪进栏休息20min后，凡皮毛异常光亮，呼吸急促，后臀部外形饱满且突出，四肢严重颤抖或非外因而卧地不起者，基本上可以做出初步判断。屠宰后，可以从肉的颜色和品质上来判断。含有CLB的猪肉肉色较深，较鲜艳，脂肪层非常薄，在胴体两侧腹股沟的脂肪层内毛细血管分布较密，甚至呈充血状态。内脏实质器官(心、肝、肾)充血肿胀，用手指触之酥软星脂肪变性;间质器官如肺、气管切面见泡沫、气肿等病变特征，有时有少量“汗水”渗出肉面。而一般健康肉呈淡红色，肉质弹性好，也不会有“出汗”现象。感官检验法可用于对含有CLB动物性产品的粗略判断，主观性较强，但可为消费者购买放心肉提供一定的参考。 4(2 实验室检测 目前已用于CLB检测的实验室方法主要有:分光光度法、免疫分析法、色谱分析法及各种联用技术分析法等。 4(2(1 分光光度法 由于CLB溶于水和乙醇，可直接用水进行提取，而且CLB既可显芳香第一胺类的鉴别反应，也可显氯化物的鉴别反应。因此，用分光光度计检测，可在243nm与296nm的波长处得到最大吸收峰。 鉴于CLB残留对人和动物造成的危害，世界各国纷分光光度法在常温下有较好的稳定性。由于CLB在生物样品中含量甚微，该法检测限过高，达不到残留分析 要求，因此。目前只限于CLB药品本身的常规分析”。 4(2(2 免疫分析法(IA) (1)酶联免疫分析法(EIA) EIA中应用最为广泛的是酶联免疫吸附法(ELISA)。目前，国内用于CLB残留检测的ELISA试剂盒已经商品化。EIA法样品前处理简单或不需要前处理，成本低，具有操作简便、快速、仪器设备简单等优点，适合对活体动物做大批量样品的快速检测。欧盟等国家已将EIA作为“筛选法”，用于CLB的宰前尿检、血检及屠宰场的检疫。缺点是该法不能实现现场检测，且结果假阳性率较高，尤其是当样品中含有抗生素或磺胺类药物时，会使假阳性率进一步提高，被检阳性者需要用气相色谱一质谱联用法确证。 (2)滴金免疫分析法(DIGFA) 其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色。由于胶体金肉眼可见，故阳性反应者在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不会形成红色斑点。张敏娟等分别用该法和ELISA法对12份猪尿样品进行检测，两种方法阳性吻合率为85(71,(6,7)，当生猪尿样中CLB的浓度大于2700时，吻合率达91(67,(11,12)。 该法仪器设备简单，试剂安全，对操作者没有太高的专业技术要求，能实现现场检测。缺点是反应线颜色受反应时间影响较大。 4(2(3生物传感器检测法(BS) 其原理为待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。肖红玉等叫利用生物体内抗原抗体专一性结合而导致电化学变化的原理成 为0.1,8(1u g,L，检出限为0.lμg,L。通过对了免疫生物传感器，线性范围 100个已知阳性样品和100个已知阴性样品的测试，准确率为97,;通过对批内和批间的多个重复，仪器的稳定性和重现性都较好，检测时间在20min以内，检测成本低，可以满足现场检测的需要。BS法具有灵敏度高、特异性强、样品前处理简单(有的样品无需前处理)、检测迅速、携带方便、能重复利用并能实现现场检测和在线检测等优点，有望开发成检测激素、抗生素或兽药残留的最有效的新技术。 4(2(4放射免疫分析法(RIA) 目前国外已生产出运用R1A测定CLB的试剂盒产品，还建立了类似RIA的放射受体分析法，这种方法是用受体代替抗体结合CLB，检测限可达到2(4 μg,g。 RIA检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、准确快速、易标准化等优点，但是由于所用仪器较昂贵，对条件要求较苛刻，并且放射性同位素对工作人员有一定伤害，从而限制了该法的广泛应用。 (5荧光免疫分析法(FIA) 用三价稀土离子及其螫合物作为示踪物，代替荧4(2 光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质。当免疫反应发生后，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。时瑾等用自己建立的时间分辨荧光免疫法(TRFIA)检测猪尿样品，其灵敏度为0(01μg,L，测量范围为0(0l一25μg,L，平均回收率为99(7,，RSD为3(9,，与盐酸异丙肾上腺素的交叉反应率为0(01,，与沙丁胺醇、盐酸肾上腺素、重酒石酸去甲肾上腺素无交叉反应。8条不同时间进行的CLB—TRFIA的效应点值ED?、ED、ED20分别为(0(074?0(01)μg/ L、(1(474?0(11)μg,L和(23(64 4-0(56)μg/L尿样经TRFIA和ELISA试剂盒同时检测，2者的相关系数为0(932，结果相符。 该法具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点，因此越来越多地应用于疾病诊断、疗效观察等医学研究领域，但对温度的强烈依赖性和荧光强度取决于激发波长，因此在药物残留分析方面应用较少。 4(3色谱分析法 4(3(1 高效液相色谱法(HPLC) 利用HPLC检测CLB是一种比较成熟的方法，国内外相关的文献报道比较多。该法具有检测精确度高、假阳性率低的特点，最低检测限为1—1599,kg，我国已将其作为检测CLB残留的半确证性方法。但是由于该法所要求的仪器较昂贵，检测费用高，操作比较繁琐且耗时，因此，主要在一些大的研究机构和实验室中使用。 4(3(2 气相色谱法(GC) 崔晓明等40将样品经固相萃取、衍生化后用ECD检测器检测，以外标法多点校准定量，测得动物组织中CLB的峰面积与样品浓度在0(005,l.0μg,ml范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0(999。肉样的加标回收率在70,一80,，最低检出限为lμg/kg。谢维平等采用厚膜非极性柱对未经衍生化的克伦特罗直接分离，用NP检测器检测，分离峰形良好，平均回收率为86(O,，相对偏差RSD为5(O,，相关系数为0(9993，线性范围为O(1—40(0mg,L，检测限为0(03mg,L (S,N=3)。气相色谱法和高效液相色谱法一样，具有检测精密度高等优点，但同时也具有检测过程烦琐，耗时长、不能定性等缺点。 4(3(3 毛细管电泳(CE) 毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、重现性好、样品和试剂用量少等优点，被视为高效的分离技术之一。由于克伦特罗具有电化学活性，可在电极上发生氧化反应，可以采用电化学检测器检测。毛细管电泳法与电化学检测方法(ED)联用对电活性物质有很高的灵敏度和选择性。管月清等首次采用CE—ED法测定了肉制品中CLB和沙丁胺醇的含量，在最佳实验条件下，在8min内即可实现二者的分离，且在两个数量级的范围内呈良好的线性关系，抗坏血酸对其检测不产生干扰。该法无需对样品进行衍生化反应，简单的前处理后即可直接进样，方法简单可靠，能够有效地对肉制品中残留的CLB和沙丁胺醇进行分析、测定。由于电化学系统仪器和毛细管电泳仪均不是一般实验室常备检测仪器，因此在对大量样品中CLB的测定方面应用并不十分广泛。 4(4 联用技术分析法 将几种分析方法结合起来，特别是将一种分离手段和一种鉴定方法结合组成的联用分析技术，不仅可以取长补短，起到方法间的协同作用，从而提高方法的灵敏度、准确度以及对复杂混合物的分辨能力，同时还能获得两种手段各自单独使用时所不具备的某些功能。 4(4(1 气相色谱一质谱法(GS,MS) 岳秀英等用此法检测了牛奶中的CLB，线性范围为0(005—0(2μg,ml，平均回 ,一110,，最低检出限为5(Oμg,ml，能满足残留分析的要求。GS收率为70 ,Ms法可以在多种残留物同时存在的情况下，对某种特定的残留物进行定性、定量分析，且具有较高的灵敏度，是检测CLB残留的最常用的方法之一。我国及欧盟等国家将该法定为检测CLB的确证性方法。 4(4(2 液相色谱一质谱联用(HPLC—MS) 由于该法不需要对样品进行衍生化就可直接分析，操作步骤相对简单，所以也在CLB残留的测定中逐步得到应用。余建新等建立了尿样及动物组织中B一兴奋剂残留量的液相色谱一串联质谱联用测定法，检测的定量限在0(15—0(6μg,g，线性范围均大于103，线性方程的相关系数大于0(999，组织样品和尿样的回收率大于70,。该法具有灵敏度高、专属性强、定性准确的优点。 4(4(3 液相色谱一酶免法黄宏南等利用HPLC法对60份样品进行CLB的测定，一些样品出现了仅根据峰的保留时间难以判断是否是CLB的现象，于是应用ELISA法将经HPLC法判为可疑的样品进一步确证。该法可以较好地对CLB进行定性和定量，从而确证畜禽产品中的CLB残留存在。此法的优点是高度的灵敏性和特异性，缺点是操作过程过于烦琐，费时及花费颇多。 4(4(4 低温捕获气相色谱一傅立叶转换红外分析法(GC—FTlR) GC—FTIR系统由GC仪、光管(接口)、FTIR仪、计算机系统构成。从GC仪分离出来的馏分按保留时间顺序进入光管，然后聚焦至液氮低温检测器进行红外检测，计算机数据系统存储采集到的干涉图信息，经快速傅立叶转换得到组分的气相红外光谱图。傅立叶转换红外光谱仪具有光通量大、信噪比好、频率精度高、扫描速度快、能在很短时间内(小于ls)获得全频域光谱响应等特点。所得结果一般比光谱分析要高1,2个数量级，是一种较好的药物分析方法。由于对CLB的检测限为2(5μg,kg，高于欧盟规定的最高允许限量标准(O(5μg,kg)，因此不能满足其残留检测分析要求，在国内应用很少，只在国外有少量报道。 双汇‘瘦肉精”事件之后，我国对瘦肉精的关注再次达到了顶峰状态，瘦肉精的不法应用如此猖狂，所以需要一种快速简便经济的检测方法。综上所述，在各种检测方法中，ELISA法作为一种最常用的免疫分析法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单等特点，适合于大批量样品的快速分析，但不能作为确证方法。而HPLC法和GC—MS法及其它联用方法虽然提高了分析的灵敏性、准确性和有效性，降低了检测限，但均需要昂贵的仪器、复杂的样品处理程序以及专门的操作技能，且比较费时，成本高，因此不适合用于临床上大批量样品的检测。BS法、DIGFA法和TRFIA法灵敏，快速、方便，是今后研究和开发检测CLB等残留物的重要方向。 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