【doc】孕酮,雌二醇性激素受体测定试剂盒的研制

【doc】孕酮,雌二醇性激素受体测定试剂盒的研制 孕酮,雌二醇性激素受体测定试剂盒的研制 生亿药物杂志1991年第1期(总SS期) _一习.坤?53? ;孕酮,雌二醇性激素受体测定试剂盒的研制 R?77-/.2 化工部化工劳动保护研究所主韭付贵生王垄壅张秀兰杨朋年睾鼍 性激素受体主要包括雌激素受体(ER), 孕激素受体(PR).睾酮受体(AR),是一 种蛋白质,存在于子宫,阴道,乳腺,睾丸, 前列腺等鞘器官细胞的胞浆中.除此以外,还 发现乳腺癌,子宫体癌,宫颈癌,卵巢瘤,前 列腺瘤,脑肿瘤,大肠癌,黑色素瘤,胰腺癌等也 都有性激素受体存在.因此性激素受体间接测 定法不仅可用于乳癌鉴别诊断,也可反映乳癌 予后结果.还可普遍用于妇科肿瘤,直肠癌, 胃癌及肺癌等的检测.同时也可用于病历的回 顾性研究.但是用于激素受体测定的试剂,不 仅价格昂贵,而且市场短缺. 为满足广大临床,科研的需求.一年来化 工部化工劳动保护研究所和青岛市立医院,青 岛海大公司共同合作,开展了该试剂的研制, 并组装成试剂盒. 一 ,孕酮,雌二醇抗原的制备: 1.孕酮抗原的制备:? 孕酮分子量小,不是完全抗原.我们首先 把孕酮接在牛血清白蛋白上制成完全抗原免疫 动物. (1)孕酮在第三碳位上有酮基,在碱性条 件下与羧甲基羟胺反应生成孕酮一3一肟. (2)经提纯后的孕酮一3一肟用混合酸酐 法接在牛血清白蛋白上. 取50rag孕酮一3一肟,加三正丁胺0.1ml~fl 二氧六环4ml溶解后用冰冷到lO?以下加氯 甲酸异丁酯0.03ml,4,---,10?反应3O分钟, 加入牛血清白蛋白150mg(溶在4mJ水,3mlZ. 氧六环,0.15m]1NNaoH中)4?反应6小 时,然后透析纯化. (3)通过紫外光谱计算每克分子蛋白接上 几克分子孕酮,通过测定,我们在每个牛血清白 青岛市立医院青岛海火公司 蛋白接上23个孕酮分子(?. 抗血清的质量受许多因素的影响,但抗原 的质量起着决定性的作用.考虑与蛋白联接时 既不破坏孕酮的抗原决定簇,又要引入必要的 基团与蛋白连接,利用孕酮第三位上酮基比较 活泼引入羧基,含有羧基的孕酮与甲酸异丁 酯形成混合酸酐,在碱性条件下与蛋白分子中 游离氨基缩合,结果使紫外吸收发生明显改变, 经计算1分子蛋白接上23个孕酮分子.根据文 献,1分子牛血清白蛋白有6O个游离氨基,可 根据反应时间与条件控制联接在蛋白上的孕酮 多少,接的太少抗原性弱,太多由空间位阻效 应和蛋白变性影响抗原的质量.一般认为15"- . 4O为好 2.雌二醇抗原的制备: 雌二醇抗原制备可以用珀琥酸酐直接引入 羧基.但考虑到与雌三醇,雌酮等交叉反应严 重,我们没有采用直接引入法,而是先保护羧 基,然后用重铬酸钾氧化,在第六位上氧化出 酮基.通过与孕酮类似的方法接在牛血清白蛋 白上,经紫外光谱分析每分子牛血清蛋白接上 27个雌二醇分子 经免疫家兔得到的抗血清与雌三醇交叉反 应1.5%,孕酮0.05%,醛固酮0.43oA,睾酮 <O.05%,皮质0.09%. 一 般直接引入羧基(在碱性条件下与珀琥 酸酐反应)所得抗血清对雌三醇的交叉反应达 5%"-'20%[2].本方法没有破坏雌二醇第三 位上的羟基功能团,从而大大提高了抗血清的 特异性,制备出比较理想的抗血清. 二,孕酮,雌二醇抗血清的制备: 取一定量上述抗原加完全佐剂对纯系新 西兰大白兔进行免疫,其免疫方式为每次多点 ?54? 皮内,足脓部,淋巴结区注射,每周一次,免 疫时间为5周到4个月,最后一次免疫的第三 天试血,测其效价,使用稀释度分别是:孕酮 为1:100,雌二醇为l:80. 二,孕酮,雌二酮抗血清交叉反应的测定 交叉反应是抗血清质量的重要指标之一. 我们采用放射免疫法测定其交叉反应.交叉反 应的指标有两种:一种是用非放射性竞争物竞 争5O%的放射性抗原量的比乘1oo表示;另一 种是等量的非放射性竞争物加入后使放射性抗 原结合相对减少的百分比表示. 我们用后一种,测定结果表示如下: 兔孕酮抗血清对下列竞争物交叉反应 相对结合率 孕酮100% 雌二醇<O.0l% 雌三醇<O.0l% 睾酮0.07% 醛固酮0.05% 皮质醇0.12% 雌二醇抗血清交叉反应: 相对结合率 雌二醇100% 孕酮0.05% 雌三醇1.5% 醛固西jij<O.05% 皮质醇0.09% 影响抗血清特异性的因素很多,但主要是 制备高纯度的抗原.同时在合成完全抗啄过程 中尽可能保护抗原的一些重要功能团.如在合 成雌二醇完全抗原时,没有破坏3位17碳.ki~,J 个羟基.结果大大降低了结构与雌二醇相似的 雌三醇的交叉反应.此外,动物选择,免疫时 间,截体选择.合成抗原与截体的克分子比及 连接位置等都影响抗血清的特异性,一般选择 年青健康的动物,免疫时间短,效价低,时间太 长,特异性下降,截体分子量大,抗原性好,旦 在体内易裂解成不同多肽碎片,对有机溶剂稳 定性差,半抗原与蛋白连接的克分子比太少太 多都影响抗原的殊}性,连接半抗原的位置对 抗原性特异性的影响便是人们都知道的.总之, 影响抗血清特异性的因素很多,要根据不同的 半抗原和对抗血清的不同要求做适当的选择. 四,羊抗兔igG抗血清的制备: 1.兔IgG的提取: (1)饱和(H.):SO.提取丙球: 兔血清25ml+0.85%盐水25m"~ 饱和(NHI)2SO'50ml(pH保持7) + 4?3O, I . 8000rpmJ0去上清 于沉淀中加25m】盐水溶解,加(NH): SO412.5ml, 1, ' 4?30 0 8000rpm10去上清 ~ff25mI盐水溶解,加J2.5ml(NH')2SO' , 4?3O {.. 8000rp~n10去上清 ' 加25mj盐水溶解,加】.5ml(NH.)2SO' 4?3O I 中 8(~OOrpa110去上清 . ? 加盐水l5ml (2)SephadexGO脱盐 称取一一定是的G50经水洗后,用{:H.4的 0.OlM的磷酸缓冲液平衡,装柱(j×60 cm).将5mi的蛋白上样,用缓冲液洗脱,分 管收集蛋白.在此过程中要随时注意测定NH 和蛋白.合并各管蛋白,装入透析袋内加蔗糖 或聚乙二醇脱水以浓缩蛋白., (3)DEAE--Ce!!'.tlose柱提取IgG 称取定量的DEAE分别用NaOH和HCI 洗涤,然后用水冼涤到中性再用0.0iM的磷酸 缓冲液平衡,装柱(1.6×40cm).将上述浓 缩的蛋白上样,用缓冲液洗脱,分管收集蛋白, 用紫外测其蛋白含量.用凝胶电泳测其纯度, 证明j荽成份为IgG. 2.免疫: 将上述提取的rgON完全佐剂对羊进行免 疫,其免疫方式为每次多点皮下,皮内,淋巴 结区注射,每周一次,共六周,在最后一次免 疫的第三天试血. 3.效价测定: 用琼脂双扩法测得抗血清的效价为1:32. 五,PAP的制备: 1.兔抗酶血清的制备: 用纯酶(RZ=3.0)加完全佐剂免疫的家 兔,取血清,用琼脂双扩法测其效价为1:32. 2.可溶性酶一一抗酶(Peroxidase--ar,.ti— peroxidasc.PAP)的制备: (1)取兔抗酶血清一定量,10000rpm离心 20分钟,取上清液; (2)将1mg/'m的酶(=3.)溶液与, 1RZ0 一 定量的兔抗酶血清相混,搅均,室温放置1 小时; (3)15000rpm,离心2O分钟,收集沉淀, 用冷盐水洗三次. (4)于最后一次沉淀物中加入2mg/ml的 酶溶液,用0.INHCt将pH调到3直至沉淀完 全溶解,然后立即加l0.1NNaOH将pH调到7.4. (5)加入含有0.08N醋酸钠和0.15N醋酸 铵溶液(相当原体积的1/lo),再缓慢加入等 量的饱和(NH4)SO,4?搅拌5分钟. 15000rpm,离心2O分钟.沉淀用5O%饱和 (NH.)2SO再洗二次. (6)将沉淀物溶于一定量的蒸馏水中.用 pH6.75的醋酸销-_-醋酸铵盐水透析三天. (7)150001Pro离62,0分钟,取上清液. 3.PAP克分予比值的计算: 将上清液稀释3O倍,用紫外光谱测定OD 280nm=0.050,O0托uo—rlm=0.024. 根据公式:酶量=0.288mg/ml igG量=0.790mg/ml 克分子比值为:3:2? 六,试剂盒的临床试用: 1.试验程序: 石船切片(置t;0?烘30,6O)一常规脱 ?55? 腊入水-~PBS冲洗一0.6%H2O2一PBs液20分 钟一冲洗3次一!mg/ml雌二醇或孕酮液孵育60 分钟一冲洗一1%戊二醛--~PBS液稳定5分钟 一冲洗3次一1:lo&牛血清孵育3O分钟一兔抗 雌二醇或孕酮血清(1:80或l:100)孵育60分 钟一冲洗一羊抗兔IgG血清(1:20)孵育30分 钟一冲洗一兔PAP(1:100)液孵育60分钟一冲 洗一DAB酶显色液温育3,5分钟一水冲洗一 苏木素复染一脱水封片一镜下观察. 2.临床试用结果: (?)试剂最佳使用稀释度:经预试验结果 选定,并被初步试用结果证实;兔抗雌二醇血 清l:80;兔抗孕酮血清l:100;羊抗兔IgG l:20;兔PAPl:l00为最佳应用稀释度组合. 在排除切片质量问题后,阳性切片DAB显色清 晰,背影非特异染色极少,但神经纤维及血管 内皮细胞可见到轻度非特异性着染.阴性切片 不着色与上海华美公司及上海内分-泌所同类产 品相比较,结果相同.而阳性着染颗粒较深, 背景并无着染,对比度好,结果优于上述单位 产品.此外,所有抗体经3,.5次反复冻融, 效价无明显变化., 七,讨论 1年Jc;iseR等首次报道切除的乳腺癌组 织中存芏E蠢..'一,而后相继有入报道少肿瘤 细胞中存在有性激素受体一.,引起众多学 者的扳大兴趣,而且性激素的存在与否又可成 为预测不少肿瘤患者预后的指标.并提供肿瘤 内分泌疗法的f_衣据coj.因此;性激素受体 检测的研究&近十余年中成为发展较快的一个 课题. 随着放免技术,免疫细胞化学及配体细胞 化学技术的进展.目前已有多种技术可用于性 激素受体的俭测,特别是ER,PR检测技术进 展较为迅速.在国外,常用的方法是生化法已 如前述,但生化法需昂贵的设备,操作复杂;又 需新鲜标本,因而其推广应用受一定限制. 近十余年来不少学者在寻求一种较为简单,实 用而且可靠的方法检测丑R,PR,具有代表性 的有Stenberger应用的配体免疫细胞学力 ? 56? 附表:ER,ER,E,PR,PR,P阳性率: 乳腺癌(7)(28:%)(6)(357%)(6)(39:%)(52%)(48:%) 良性乳腺 疾病 喉癌 子宫内膜 腺癌 子宫内膜 增殖 前列腺癌 肝癌 5 O 1 O 1 1 5 0 1 0 1 1 法(ABC法)及许良中(?改良的Stenberger 法(ABC)法.及刘肖廉等开发的配体细胞化学 法c].此外,Lee.氏荧光法().郑氏'?)荧光 法.亦为近年来ER,PR检测方法中的娇娇者. 我们设计的ER,PR检测药盒,基本采用 经Pascalc?)改良的Stenberger法,其基本原 理为:应用激素饱和组织中受体,然后使用抗 激素血清孵育切片,使之与激素结合,继而使 用PAP法.测知抗血清的存在,因而是间接 测知ER,PR的存在.此方法的特点是激素与 受体结合有高度亲和力及相对稳定性.而ER- E.PR--P的试验设计中又考虑到人体本身存 在性激素,故而部分受体业已被内源性激素所 饱和,而这种激素,,受体复合物的化学性质 又较为稳定.一脓组织处理方法,不影响其结 构的稳定性,故而检测结果较为衡定. 本文应用[ER及PR检测药盒对216例外检 标本进行了PAP法免疫组织检测,发现抗体特 异性较国内同类产品稍好.在标本切片中极少 出现文献中所提到的"不可避免的背景特异性 染色"(?.少数间质出现非特异性着色的标 本经分析,切片过厚,经换用薄切片后,背景着 色消失.另有几例非特异着色原因为(1)标本 自溶;(2)组织脱水不佳;(3)用95%乙醇固 定标本后又改用福尔马林固定的标本.我们认 5 0 1 0 1 1 5 O 1 0 1 1 为.本法检~I]ER,PR避免间质非特异性染色 的根本问题在于抗血清的质量与标本质量,因 而不存在"不可避免"的问题. 在药盒应用过程中,所有抗体都经过三次 以上的反复冻融,部分抗体贮存于4?冰箱达 1个月之久,除雌二醇抗血清效价稍有下降 外,其他几种抗体效价均无明显改变,抗体 效价基本稳定.在我们初步应用于各类组织受 体的检测过程中,两种药盒的效价均比较稳定 216例组织免疫组化标记.我们均应用同样实 验条件,所得结果与文献中受体检测结果相 比较,阳性率偏高,其原因可能是:(1)我们 判断阳性肿瘤标准切片中,25%以上肿瘤细胞 阳性率为阳性肿瘤,而不少人使用的标准为 40%;(2)与上海华美公司的试剂比较,我们 应用的抗血清免疫效价要低于该公司产品,但 组织染色结果则相反.这显然是与抗体特异性 有关.交叉反应情况略高于我们应用的抗血清, 因而影响了他们抗血清的. 我们发现,切片中多数神经组织及血管 内皮均呈现不同程度的着染,推测其可能: 存在ER及PR,但在其他种类抗体(主要 为抗血清)免疫组化检测也不同程.度的.出现 这种现象,是否与血清中含有与这两种组织 有一定亲和力的免疫球蛋有关,这一点 有待进一步研究. 应用PAP法测定石腊切片中,ER—E, PR--P,PR的最大优点是:组织切片清晰, 受体定位明确,便于观察,并可与肿瘤细胞的 形态特征对照研究,且操作简便,试剂价廉. 所以,易于为基层医疗单位所接受,我们所研 制的药盒,已为数多个临床单位所应用.据反 映,本药盒的效果与国外同类产品相当,优于 国内产品. 参考文献 1.ErlangerBF.etal;J.BiolChem. 228.7l3.1957 2.Ching-Hsiuetal:Radioimmunoa— ssayofplasmaestrogeussteroid18; 91.1971 3.JensenE.V.etabNatiCancer LastMonograph34:55.197l 4.Dapanto:CancerTreatReep63: ,51' ll86.1979 MolteniA.eta1;ARchSurg1_16, l98l Chauolhare:CancerRes40;861, l980 AlfortA.etal,Cancer43;980, l979 MayerC;Cancer40;2290,1977 MagureW.L;Cancer37;643,1975 KarzonR.M.etal;JHistochem Cytochem26;803,1978 许良中等,肿瘤2,1982 徐芩薇等,肿瘤4.1984 LeeS.H.etal;AmJchinPathol 70l197.1978 郑树等,浙江医大11.129, l982 PascalR.R.etal;HumPathol17: 370,1986 侵'I瓣奴,人文乞,议和踬; 用放射免疫法监测人绒毛膜促性腺激素的生产 徐州生物化学制药厂.盈鲞鸱尺977., 人绒毛膜促性腺激素(HumanChorionic激黄体不衰退,不萎缩,刺激黄体细胞产生黄 Gonadotrophin,HCG)是生物活性类似于酮体,使子宫内膜不裂,保证受精卵着床]. 浞黄体生成激素(LeuteinizingHoromone)的在临床上,可治疗习惯性流产或治疗由促滤泡 糖蛋白促性腺激素f-,,?,由胎盘滋养叶外素过多,促黄体生成激素不足而引起的不孕症 层细胞合成.1927年Aschheim及ZoEdek从孕以及治疗性机能障碍.此外还可以制备妊娠试 妇尿中首次发现?.经Got等人研究确定HCG剂或放射免疫试剂,测定血,尿!中HCG的含 是一种糖蛋白,其糖含量约占30,,其量,诊断早期妊娠或绒毛膜癌[3). 中唾液酸含量最高.HCG由,I3两个亚单位组1960年Got和Bourrillon建立了一种分离 成,一亚单位由92个氨基酸残基,I3一亚单位纯化HCG的方法(?,此法工艺简便,得率又 由147个氨基酸残基组成).分子中的糖链高,适于大规模制备.目前国内生产厂家大多 通过两种方式和一,I3一肽链相联(?.其分子采用Got法改良工艺.本厂采用的工艺简 量为47,000~59,000c?.生理上,HCG可刺单如下: 1/15MNaAcbuffer50A1c一1/l5MNaAcbuffer70%A1e—l0%NH4Acbuffer HCG粗品 DEAE纤维素柱 — 精品 ——— A—BC .;c;" l1ll1l 1?