时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中甲胎蛋白含量

时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中甲胎蛋白含量 时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中 甲胎蛋白含量 . 1784.中华临床医师杂志(电子版)2010年l0月第4卷第1O期ChinJClinicians(ElectronicEdition).October15.201O.V01.4.No.10 时间分辨荧光免疫法定量测定孕妇血清中 甲胎蛋白含量 谭玉华霍道贵廖思红谭子军 【摘要】目的探讨孕妇血清甲胎蛋白(MSAFP)含量与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系. 自建MSAFP时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)并对其进行评价,采用自建方法定量检测孕妇 血清3711例,建立实验室参考值,AFP浓度与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系.结果自建 AFP.TRFIA方法灵敏度优于1.0U/ml,线性范围为1.O0—1000.O0U/ml,分析内,分析间变异系数 (cv)分别不超过10.O%,15.O%,与国外同类试剂比对结果相关性好(r=0.9856).在13,13 周",14,l4周",15,15周",16,16周",17,17周",18—18周",19—19周",20,20 周",21,21周"各孕周的MSAFP含量中位数(肘)分别为16.51U/ml,23.81U/IIll,29.98U/rid, 32.96U/ml,36.86U/ml,43.01U/ml,49.61U/ml,59.66U/ml,71.11U/nil.各孕周MSAFP平均浓度 或浓度中位值与孕周呈线性正相关,r分别为0.9766,0.9832.各体质量段MSAFP浓度与孕妇体质量 呈负相关,r在一0.9929一一0.9142.同孕周组内,各年龄段间的MSAFP浓度均数差异无统计学意义 (P>0.05).结论自建AFP-TRFIA法检测性能能满足临床应用的需要.MSAFP浓 度与孕周和孕 妇体质量密切相关,在产前筛查时要准确校对以上因素. 【关键词】甲胎蛋白类;遗传筛查;荧光免疫测定 Quantitativetestofhumanalphafetoproteininmaternalserulnbytime-resolvedfluorolmmunoassay TANYu—hua,HUODao— gui,LIAOSi-hong,TANZi-jurLGuangzhouFenghuaBioengineeringCo.,Ltd., Guangzhou510730,China Correspondingauthor:TANYu—hua.Email:tanywhy@yahoo.com..cn 【Abstract】 ObjectiveTodevelopatime-resolvedfluoroimmunoassay(TRFIA)formatemalserDm alphafetopmtein(MSAFP)asanaidinprenatalscreening,evaluatetheimpactofgestationalweeks, maternalW6't,gestationalagesonMSAFPlevels.MethodsTheassaymethodologyofself-mademethod Wasevaluated.ThelevelofAFPwasquantitativetestedbyself-mademethodin3711healthymaternalserum samples.ThereferencevalueofnormalWasstudied.Statisticswasusedtoanalyzetheimpactofgestational weeks,maternalweight,gestationalagesonMSAFPlevels.ResultsThesensitivityofself-mademethod Wasbetterthan1.O0U/m1.ThelinearrangeWas1.O0U/mlto1000.00U/nil.Theintra-assayandinter— assaycoefficientsofvariation(CV)waslowerthan10%and15%,respectively.Theaccordanceofourkit tIltheimportedkitWasgood(P>0.05),andtheaccordancecoefficientwas0.9856.Themedianof MSAFPlevelWas16.51,23.81,29.98,32.96,36.86,43.01,49.61,59.66,71.11U/IIllin13— 13, l4.14,15.15,16.16,17.17', 18.18,l9—19,20-20,21-21gestationalweek, respectively.Fromthe13thweektothe21thweek.theMSAFPlevelsshowedpositivelinecorrelationwitll gestationalweeks.TheMSAFPlevelsshowednegativecorrelationwitllmaternalweight.buttheMSAFP levelsshowednocorrelationtIlmaternalages.therewasnostatisticalsignificanceforMSAFPaveragelevels withgestationalagesinthegroupofages(P>0.05).CondusionsAlltheresults DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2010.10.004 基金项目:广州经济技术开发区,广州高新技术产业区,广州出口加工区,广州保税 区科技项目(广州市生物 产业发改委资金配套类,2008Ss—P126) 作者单位:510730广州市丰华生物工程有限公司(谭玉华,谭子军);中山大学附属第 三医院产科实验室(霍 道贵),输血科(廖思红) 通讯作者:谭玉华,Email:tanywhy@yahoo.COrn.cn 2 ? 论着? 中华I临床医师杂志(电子版)2o10年1O月第4卷第10期 ChinJClinicians(ElectronicEdition),October15,2o10.Vo1.4,No.10 oftheparametersshowedthatthemethodwedevelopedcouldmeettheneedofthec~nicappficadon. Gestationalweeks,maternalweightbearsdirectlyonthelevelsofMSAFPforprenatalscreening. 【Keywords】alpha—fetoproteins;Geneticscreening;Fluoroimmunoassay 母血清甲胎蛋白(maternalserumalpha-fetoprotein,MSAFP)是胎儿先天性缺陷常用 的筛查指标之一.甲 胎蛋白(AFP)最早由卵黄囊少量合成,卵黄囊退化后由胎儿肝脏大量合成,肠和肾也能微量合成AFP.胎儿 血中的AFP经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血.母体血清中AFP约在妊娠10周时可检测到.1984 年Merkatz等最先发现怀有21-三体胎JL(DownSsyndrome,DS)的MSAFP含量降低,以后的研究发现MSAFP 降低与18一三体,l3一三体儿有关,并且AFP也是孕中期筛查胎儿神经管缺陷(neuraltubedefects,YrD)的有 效指标.由于我国幅员广阔,各地区发展不平衡,经济技术和对出生缺陷产前筛查的认识不足,缺少进行产 前筛查的试剂,设备仪器和专业技术人员等原因,部分地区仍无法开展DS,NTD等先天性疾病的产前筛查. 为了使产前筛查在全国深入开展和普及,通过多年研究,MSAFP时间分辨荧光免疫法(time.resolvedfluoroim— munoassay,TRFIA)在本实验室建立成功,笔者利用自建方法定量测定了371l例孕母血清样本的AFP的含 量,探讨了MSAFP浓度与孕周,孕妇体质量和孕妇年龄的关系,结果分析如下. 材料和方法 1.标本:按《产前筛查技术》?,经知情同意,收集了3711例孕单活胎(已超声确定)的孕妇血清 样本,年龄在18.0—44.9岁,平均为(28.5?3.6)岁,经孕周计算(孕妇月经者孕周以末次月经第1天 算起,月经不规则者以超声确定孕周),孕周为l3—2l周?,孕妇体质量在33.5,102.0kg,平均体质量为 7.3)kg. (54.3? 2.试剂与仪器:产前筛查AFP的TRHA定量测定试剂盒,泰莱TRFIA仪,恒温振荡仪,全自动洗板机和 企业质控品(广州市丰华生物工程有限公司);参比试剂DELFIA.AFPKit(美国PerkinElmer公司);国家标 准品(中国药品生物制品检定所);室间质评样本由中国卫生部临床检验中心统一发放. 3.自建检测方法:采用双抗体夹心TRFIA一步法原理.准确吸取25品(复孔)和待测样本依次 加入包被有AFP单克隆抗体的微孔反应板中,每孔加入100p,lAFP单克隆抗体铕标记工作液,室温振荡反 应1.5h,洗板6次,加人增强液100l/,孔,振荡5min后,反应板放入泰莱TRFIA仪内检测荧光值,并用随 仪器配备的拟合分析软件进行结果分析. 4.统计学分析:参考文献[3]对方法学进行主要性能指标评价;剂量一反应曲线由仪器自动给出;检 测结果采用均数?标准差(贾?s)表示;按孕周进行分组,参考文献[4]方法建立本实验室的MSAFP中位 值(median,),并计算各孕周的浓度均值和中位倍数值(multiplesofmedian,MoM);各孕周AFP平均浓 度和中位值与孕周的关系采用线性回归分析;并按同孕周组内孕妇体质量分组(组段按30.0—39.9kg, 40.0—49.9kg,50.0,59.9kg等以此类推分段),计算每组段平均体质量和相应体质量组段的AFP平均 浓度,各组AFP浓度与孕妇体质量的关系采用线性回归性分析;同孕周组内再按孕妇年龄分组(<30.0 岁组,30.0,34.9岁组,/>35.0岁组),计算相应组的AFP平均浓度和标准偏差,组间AFP平均浓度采用 两独立样本t检验,方差齐性采用F检验,检验水准=0.05,P<0.05表明差异具有统计学意义. 结果 1.方法学评价:(1)剂量一反应曲线:采用双对数LOG—LOG_B最佳曲线数学拟合模式,曲线的线性相 关系数(coefficientofcorrelation,r)达0.9998,且lO批次曲线检测的20%,50%,80%有 效剂量(20%, 50%,80%effectivedose,ED20,ED50,ED80)的变异系数(coemcientsofvariation,cv)均在1O.00%以内, 剂量一反应曲线稳定;(2)灵敏度:优于1.0U/ml;(3)特异性:检测500ng/ml癌胚抗原,100mg/L白蛋 白,AFP表观值均不高于1.00U/ml,本方法特异性强;(4)线性范围:在1.O0,1000.O0U/ml内,r达0.9990; (5)准确度:自研试剂校准品与AFP国家标准品的相对效价在0.90—1.10内,校准品定值准确;(6)精密度:实 验内CV%不超过10.0%;实验间CV%不超过15.0%,测量精密度良好;(7)HOOK效应:检测浓度为10000 2010年10月第4卷第1O期ClainJClinicians(ElectronicEdition).October15.2010.Vo1.4.No.10 U/II1lhAFP国家标准品时,未见HOOK效应;(8)热稳定性:自研试剂盒经37cI=3d烘烤后,性能指标能达到企 业产品标准的要求;(9)室间质量评价:2007,2009年参加卫生部临检中心室间质量评价,3次l5个样本,实测 值与靶值偏倚在一7.86%一7.45%,均在卫生部室间质量评价接受标准(425U/ml,靶值?5U/ml;>25U/llll, 靶值?30%)内;(1O)试剂盒比对:自研试剂与参比试剂同时检测了218例孕妇血清样本的AFP浓度,结果的线 性回归方程为白喇)=0.9223(参比试剂)一0.4885,r=O.9856. 2.实验室参考值的建立及AFP浓度与孕周的关系:通过检测了3711例孕妇血清样本,按孕周建立了参 考值,检测结果详见表1.在13—2l周?内,随孕周的增加MSAFP浓度呈线性上升,MSAFP平均浓度或浓 度中位值与相应孕周呈线性关系,回归方程分别为MsA畔均浓度)=6.3265X(孕周)一62.916,r=0.9766; I,(MsAFP浓度中位值)=6.2543(孕周)一65.934,r=0.9832. 表13711例正常单胎孕母血清中的AFP检测结果 注:MoM为中位倍数值 3.AFP浓度与孕妇体质量的关系:MSAFP浓度(y)与同孕周内的孕妇体质量()呈负相关,同孕周内 的各体质量段AFP浓度均值与孕妇体质量用线性回归分析,相关系数r在一0.9142,一0.9929.结果见 表2. 表2AFP浓度与孕妇体质量的回归方程与相关系数 13周"组因样本较少,未做进一步分组分析 注:13, 4.AFP浓度与孕妇年龄的关系:母血清AFP浓度与孕妇年龄的线性回归方程为y(姒啦度)= - 0.2644X(孕妇年龄)+52.829,r=-0.04123,P>0.05.同孕周组内各年龄组段间AFP平均浓度差异无统计 学意义(采用两独立样本t检验,t或tI为一1.64—1.97,P>0.05).结果见表3. , 2010年1O月第4卷第lO期ChinJClinicians(FAeetronicEdition).October15,2010,Vo!.4,No.1O 表3孕妇年龄对AFP检测结果的影响 讨论 1984年发现怀有DS的孕妇AFP含量低于正常孕妇,这在产前筛查史上是一个划时代的进步,首次可 以用于35岁以下孕妇的产前筛查,为后来探索孕妇血清中其他标记物奠定了基础,为大规模产前筛查指引 等标记免疫了方向.AFP测定方法有酶联免疫,化学发光,电化学发光,TRFIA法.TRFIA法作为一项新兴 的标记免疫检测方法,将抗原抗体反应与荧光物质发光和时间分辨三者结合,该技术灵敏度可高达 10.mol/L[5】.自建AFP—TRFIA法通过方法学性能评价,该方法具有灵敏度高,特 异性强,稳定性好,测定范 围宽等优点,室间质量评价比对好. 利用自建AFP定量检测方法检测3711例孕周为13,21周?的孕妇血清发现,各孕周MSAFP平均浓 度或浓度中位值与孕周呈线性正相关.母血清AFP浓度与同孕周内的孕妇体质量呈负相关.但同孕周组 内各年龄段间AFP平均浓度差异无统计学意义,母血清AFP浓度与孕妇年龄无相关性,但孕妇年龄仍可以 影响筛查的阳性率和估计检出率J.MSAFP随妊娠时间而发生变化,产前筛查中为了消除孕周对血清学指 标的影响,采用统一的筛查标准,常采用将指标值转化成同孕周的MoM值_7剖,每个实验室应建立自己的参 考值或对参考值进行确认. AFP最先用于NTD筛查,检出率为85%,一般以MSAFP>2.5MoM为标准,为目前其他标记物无法取 代的NTD筛查标记物.而AFP单独用于DS筛查的阳性检出率约为25%,一般以MSAFP<0.4MoM为标 准,也有以MSAFP<0.7MoM为标准l9J.一些仅用单一标记物进行产前筛查的实验室仍然主要使用这一标 记物.我国是一个人口大国,我国的大城市约有20%,25%的围产儿死亡是由出生缺陷造成的?…,NTDs是 一 组高发的严重先天畸形,占总先天畸形的20%,25%_l..,而Ds的发生率约占活产新生儿的1/800,1/ 600H?.为此,在产前尽早发现胎儿的先天缺陷,对优生优育,降低围产儿死亡率具有重大意义.AFP—TR— FIA方法学的建立及其试剂盒的研制,并且TRFIA产前筛查FreeHCG13定量测定试剂盒也在本实验室研制 成功J,这为推动国内产前筛查有着积极的重要意义.国外已推出 TRFIAAFP/FreeHCG13双标记的一体 化试剂盒,这也是今后国内需努力的攻克课题. 志谢感谢冯健明,沈健,何海荣,季涛,李贵情,吴道贫等同志对本研究的支持与帮助 参考文献 [1]中华人民共和国卫生部.产前诊断技术管理办法.中国生育健康杂志,2003,14(2):68-70. [2]中华人民共和国卫生部.《产前诊断技术管理办法》相关配套文件.中国生育健康杂志,2003,14(2):70-77 [3]徐立根.ELISA,MAIA,CLIA和TRFIA试剂盒质量标准探讨.放射免疫学杂志,2006,19(3):230-234. Q| ? 1788? 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