白色念珠菌

白色念珠菌 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG/IgM/IgA 目录 1. 用途 2. 诊断意义 3. 赛润 ELISA classic - 检测原理 4. 试剂盒组成 5. 检测所需物质，试剂盒未提供 6. 储存和稳定性 7. 赛润 ELISA classic的检验步骤 7.1 注意事项 7.2 样品准备和储存 7.3 试剂盒反应试剂的准备 7.4 检测程序概要 7.5 检测过程 8. 检测结果评估 8.1 4PL单点定量法 8.2 检验有效性 8.3 计算赛润 ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA(定量) 8.4 检测结果分析 9. 性能特性 9.1 重复性 9.2 敏感性和特异性 10.警告 10.1警告和安全措施 10.2废料处理 11.参考文献 V9.03/06-1 1 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG/IgM/IgA试剂盒 用于人抗体(IgG/IgM/IgA)的酶联免疫检测 - 体外诊断用- IgG 试剂盒 (定量) 编号: ESR117G IgM 试剂盒 (定量) 编号: ESR117M IgA 试剂盒 (定量) 编号: ESR117A 检测评估标准: Dade Behring BEP ? III / BEP ? 2000, DSX, 手动操作 1. 用途 赛润 ELISA classic白色念珠菌IgG/IgM/IgA试剂盒主要用于定性和/或定量检测人血清或血浆中抗白色念珠菌的抗体。由于细胞质和数量减少的细胞壁成份组成的复合抗原的存在，使得能够在浅表性和侵入性霉菌病感染的不同时期，进行抗念珠菌属抗体的检测，。 2. 诊断依据 白色念珠菌是属于类酵母真菌科的、普遍存在的一种酵母菌。 表1:具有医学相关性的真菌 具有医学相关性的真菌 1. 酵母类真菌 念珠菌属 球拟酵母菌 . 隐球菌属 2. 霉菌 曲霉属 毛霉菌属 酒曲菌属 3. 皮癣菌 4. 双态性真菌 2 除了引起浅表性感染的酵母型之外，而所谓的假菌丝体是类酵母真菌的另一种形态学表现。芽管和假菌丝体的产生主要发生在侵入性感染的病人体内。 念珠菌属酵母菌能够产生和分泌多种酶，使兼性病原体微生物能够穿透血管和粘膜屏障。 念珠菌属各种病菌一般是通过污物的污染进行传播的，主要的入口是鼻咽通道，但脂肪酸、酸性pH值和敌对性菌群等也会引起皮肤表面抑制真菌感染的功能障碍，从而导致浅表性的念珠菌病。 病菌感染粘膜后，侵入性的霉菌病会从胃肠道向外传播。 类酵母真菌对不同上皮粘膜的附着是通过粘附蛋白和外部细胞膜细微结构的差异来实现的， 下面图描述了重度感染病人体内引起感染传播扩散的(假设性)过程: 在鼻咽通道内定植 从胃部经过 传播到肠道内 进入血液循环 传播到淋巴系统 念珠菌细胞的吸混 侵入多个器官 图1:念珠菌的感染过程 念珠菌属的细菌不属于健康人群生理活动的微生物菌群，但可以观察到它对人类宿主的普遍感染。 念珠菌病根据下面的主要特征可分为两大类: 3 表 2:念珠菌感染的特征 念珠菌感染 浅表性感染 深部的霉菌病(侵入性的) 感染部位 皮肤、粘膜 重要器官 宿主的免疫力 + +,-/- 风险因素 妊娠 化疗 糖尿病 医源性的免疫抑制 艾滋病 中央静脉导管 皮肤功能障碍 放射治疗 口腔卫生缺限 重度烧伤 外科手术 临床症状的级别 多数情况下无害无生命多数情况下有生命危险 危险 治疗 可进行有效的治疗 治疗效果取决于感染的 程度 念珠菌属感染的血清学诊断是很困难的，一方面酶母菌短时间的定植会引起免疫反应，另一方面在免疫抑制病人体内，系统性的念珠菌性霉菌病可能只会引起低活性的免疫应答。对于这些病人血清学检测的必要性，要做明确的解释。此外系统性的念珠菌感染没有典型的临床症状。 目前不同试验系统对念珠菌抗体的检测结果还不具有可比性及可转换性，抗体检测的特异性明显取决于所采用的试验系统(ELISA或HAT)或抗原制备过程，用HAT试验检测IgM抗体高于IgG，因为IgM具有更强的凝集能力。HAT主要用于检测抗类酵母真菌细胞壁抗原的抗体，从而进行血清学解释，而对于更复杂的情况仅提供了鉴别诊断的机会。 4 抗体滴度的变化可以用ELISA试验来检测，而HAT无法检测，因此两种检测方法应该联合使用，尤其是针对IgM抗体活性降低而同时IgG抗体增加的情况。 目前还没有哪一种检测技术能够在念珠菌感染的血清学诊断单独使用，对于高危人群的监测和治疗控制最好是几种血清学检测方法联合使用。 3. 赛润ELISA classic - 检验原理 用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG、IgA和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物(对硝基苯磷酸盐)。该反应产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。 5 4. 试剂盒的组成 试验成分 IgG试剂盒 IgM试剂盒 IgA试剂盒 数量 / 剂量 微孔条(此微孔条可以掰开单独使用，每条有8孔，共96孔，已经包被了抗原) 12 12 12 1个微孔条框架 包被的抗原为灭活抗原 标准血清(立即可用) 人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液;抗HIV抗体、抗乙肝病毒(HBV)表面抗原和抗丙肝病毒(HCV)2×2毫升 2×2毫升 2×2毫升 抗体均为阴性; 防腐剂:< 0.1% 叠氮化钠 染色剂:紫红色O 阴性质控血清(立即可用) 人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液;抗HIV抗体、抗乙肝病毒(HBV)表面抗原和抗丙肝病毒(HCV)1×2毫升 1×2毫升 1×2毫升 抗体均为阴性; 防腐剂:< 0.1% 叠氮化钠 染色剂:里沙明绿 V 酶标记的抗人IgG, IgA, IgM (立即可用) 羊抗人IgG, IgA, IgM(多克隆)，碱性磷酸脂酶，以蛋白稳化溶液加以稳化。 13毫升 13毫升 13毫升 防腐剂: 0.01% 甲基异噻唑啉酮 0.01% 溴化硝基二垩烷 浓缩洗液(可稀释至1000毫升) 氯化钠，含吐温20和30mM Tris 1×33.3毫升 1×33.3毫升 1×33.3毫升 防腐剂:< 0.1% 叠氮化钠 稀释缓冲液 磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温20 2×50毫升 2×50毫升 2×50毫升 防腐剂:< 0.1% 叠氮化钠 0.01克/升的溴酚蓝钠盐 终止液 15毫升 15毫升 15毫升 1.2 N 氢氧化钠 底物(立即可用) 邻硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液 防腐剂:< 0.1% 叠氮化钠 13毫升 13毫升 13毫升 (瓶子未盖好底物可能会轻微变黄，但不会影响其质量) 带有标准曲线和评估表的质量控制认证文件 1 1 1 (抗体以IU/毫升或U/毫升计量) 6 5. 其它检测所需物质 - 普通实验室所需的仪器装置 - IgM检测: 赛润类风湿因子Rf -吸附剂(产品编号Z100/5ml和Z200/20ml) - 分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米- 690纳米(例如 650纳米) - 37?温箱 - 湿盒 - 蒸馏水。 6. 储存及稳定性 试剂 储存 稳定性 微孔条 开封后放在2-8?装有干燥剂的密封铝箔袋中。 4星期 (抗原) 有效期内; 质控血清 / 开封后保存于2-8?。 24个月 标准血清 有效期内 立即可用的溶液于2-8?储存。 酶标记抗体 24个月 避免污染(使用无菌针头)。 开启后于2-8?储存。 18个月 有絮状时丢掉 稀释缓冲液 有效期内 未开封 36个月 浓缩液开封后保存于2-8?。 有效期内 工作液在2-8?。 2星期 工作液在室温下。 1星期 洗涤液 盛过工作液的瓶子应按常规方法清洗，并丢弃混浊溶液。 有效期内 2-8?储存，避光。 24个月 底物 避免污染(使用无菌针头)。当溶液变为黄色时应予以丢 弃。(水作空白，吸光度大于0.25时)。 终止液 开封后保存于室温下。 有效期内 7 7. 赛润 ELISA classic的检验步骤 7.1 注意事项 只有全部使用赛润 ELISA classic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润 ELISA classic试剂盒。 ELISA classic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。应在未开封的情况下，保存于2-8?，并在有效期(见标签说明)内使用。详细的稳定性和储存资料在“6. 储存及稳定性”内将加以详述。 每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果未经被稀释或改动都会导致检测的敏感度的降低。 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 应按照规定刻度截断微孔条。如果铝袋破损或者开启装有干燥剂的铝袋后而未以夹子封紧的，则不要继续使用。 开始试验前，将所有试剂置于室温。 从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的外面，注意不要盖错瓶盖或管盖。 试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液(例如使用混合器)。 8 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。 只有严格遵守赛润ELISA classic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。 如果实验中未严格遵守控制质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。 洗涤不充分将影响试验结果: 应该小心进行洗涤。洗涤步骤应遵守相关洗涤器(平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米)指导手册进行。重要的是所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。避免产生泡沫～如果使用自动洗板机，注意正确操作。 7.2 样本准备储存 虽然，在检验中不会产生副影响，但为避免干扰结果，应保留使用高血脂的、溶血的或污染的血清。 样品不应加热灭活。 7.2.1样品稀释 开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下(V1+V2): 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG/IgA V1 + V2 = 1+1000 每10 µl患者血清 各加入到1000 µl稀释缓冲液 (= 1+100) 从第一稀释液中取20 µl 加入 200 µl稀释缓冲剂(= 1+10) 9 稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混合。 赛润 ELISA classic白色念珠菌IgM 类风湿因子干扰 类风湿因子抗体是IgM的自体抗体，可与IgM免疫复合物结合。非特异性IgM抗体(风湿因子)的存在将导致IgM检测的假阳性结果。另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。(赛润类风湿因子吸附剂，产品编号Z100 (5ml/25样品)及Z200(20ml/100样品))。 首先应该使用稀释缓冲液(V2)对类风湿因子吸附剂 (V1)进行如下稀释: V1+V2=1+4 加 200微升 Rf -吸附剂 于 800微升 稀释缓冲液中 然后将患者的待测样品(V1)在此Rf-稀释缓冲液(V3)中进行稀释: V1+V3=1+100 加 10微升 患者待测样品 于 1000微升 Rf -稀释缓冲液中 7.2.2样品储存 密封的患者样品可在冰箱中2-8?保存7天。? -20?可保存更久。 避免样品反复冻融。 已稀释的样品可在2-8?保存一星期。 10 7.3 试剂盒反应试剂的准备 7.3.1 微孔条 微孔条置于一框架内，并与干燥剂一同封于铝袋之中。应将不需要的微孔条取下并重新放入铝袋。将袋口折叠2-3次，并以夹子夹紧，确保铝袋的密封性。 7.3.2 对照血清 / 标准血清 对照和标准血清稀释，可直接使用。 对于每次试验和每批检测体系，无论使用的微量板数目的多少，均应包括阴性阳性对照孔。界定对照应作双份。如果定量试验，标准血清也应作双份。 不要用Rf-吸附剂处理对照血清～ 7.3.3 抗人 IgG, IgA 或IgM抗体，用 AP标记(即用) 禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合使用。同一试剂盒才能达到最佳检测效果。 7.3.4 洗液 以1:30稀释浓缩洗涤缓冲液(V1)至体积V2。 例如: 浓缩缓冲液(V1) 终体积(V2) 33.3毫升 1000毫升 1.0毫升 30毫升 7.3.5 样品的稀释缓冲液(即用) 7.3.6 底物(即用) 试验时戴手套以避免污染。必须以无菌针头吸取底物溶液。 7.3.7 终止液(即用) 11 7.4 检测程序概要 白色念珠菌IgG / IgM/ IgA定量 进行IgM检测时先吸除RF 因子 样品稀释液(患者样本) IgM:1+100 IgG/IgA:1000 , 将稀释的样本，和立即可用的对照血清 / 标准血清，加 到微量孔内(100微升) , 孵育60分钟 / 37? 湿盒中 , 洗涤 , 加入已稀释的酶标记抗体溶液(100微升) , 再孵育30分钟 / 37? 湿盒中 , 洗涤 , 加入底物溶液(100微升) , 再孵育30分钟 / 37? 湿盒中 , 加入终止液(100微升) , 在405 纳米处读消光系数 12 7.5 检测过程 7.5.1 将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张标签。 7.5.2 在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本对照血清。留一个孔为 底物空白使用，例如: 定量的IgG / IgM / IgA 抗原微量孔 孔A1 底物空白 孔B1 阴性对照 孔C1 标准血清 孔D1 标准血清 孔E1 标本 1…… 7.5.3 将样品于湿盒内37?(? 1?)孵育60分钟(? 5分钟)。 7.5.4 孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔(使用自动洗板机或手工洗板): - 吸去或甩去洗液 - 每孔内加入300微升洗液 - 吸去或甩去洗液 - 重复洗涤过程3次(共4次～) - 将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体 7.5.5 加入酶标记抗体。 于相应孔内(底物空白除外)加入100微升 IgG / IgM / IgA酶 标记抗体 ,7.5.6 湿盒内37?(? 1?)孵育30分钟(? 1分钟)。 7.5.7 孵育后，以洗液清洗板孔(洗涤见上) 7.5.8 加入底物 于每孔内加入100微升底物溶液(包括底物空白孔) 7.5.9 湿盒内37?(? 1?)孵育30分钟(? 1分钟)*。 , 注意:在特殊的工作环境下有必要对孵育时间进行调整。 13 7.5.10 终止反应 每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。 7.5.11 读取消光度 以底物空白为空白对照液， 60分钟内读取405纳米的OD值，建议参 考波长范围为620纳米-690纳米(例如650纳米)。 8(检测结果评估 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG/IgM/IgA(定量) 8.1 4PL单点定量法 用赛润 ELISA classic试剂检测，抗体浓度可通过逻辑对数模型(4PL, 4个参数)来计算，该模型对浓度曲线有很精确的适用性。计算公式如下: D - A OD = A + B(C - In conc.)1 + e 参数A、B、C和 D能够反映曲线的精确形状。 1. 下端渐进线 , 参数A 2. 曲线的斜率 , 参数B 3. 曲线的转折点 , 参数C 4. 上端渐进线 , 参数D 标准曲线是由德国维润赛润研发有限公司(维尔茨堡市)在严格条件下经过多次试验制定的。使用者无需花费大量的时间和使用昂贵的仪器来制作标准曲线。 每一个试剂盒内均附有专用的标准曲线和评估表用来计算抗体浓度。如有需要也可取得相关的评估软件。 为了校正正常试验偏差和建立试验对照，每轮试验均需使用标准血清作为对照。该对照血清的有效范围参考值是由厂商的质量控制部门确定的，在此范围内可 14 保证抗体浓度测定的正确性。标准血清不一定是阳性对照，且在某些ELISA试验中标准血清数值可能是临界值或阴性结果。 8.2 有效性标准 - 底物空白的OD值必须 , 0.25 - 阴性对照必须为负值 - ELISA定量试验:标准血清的平均OD值必须在有效范围内，此范围已在试剂盒专用的质量控制证中给定(减去底物空白之后～) - ELISA 定性试验:阳性对照的平均OD值必须在有效范围内，此范围已在 试剂盒专用的质量控制证书中给定(减去底物空白之后～) 如果未达到以上标准，则试验无效且必须重做。 8.3 赛润 ELISA classic 布鲁氏杆菌IgG/IgM/IgA 的定量计算 8.3.1非自动评估 每个试剂盒内均备有一个标准曲线和一个评估表，因而每一个OD值都可得到一个抗体活性值。标准血清的参考值和有效范围已在评估表格(质量控制证书)中给定。 所有的OD值在求值前必须先减去空白(A1)。 方法1:定性评估 为确定有效范围的上下限数值，请将已测得的标准OD平均值与质量控制证书上给出的数据相乘(见专用公式)，例如: OD = 0.502 x MW(STD) 临界值上限 OD = 0.352 x MW(STD) 临界值下限 如果得到的标准血清的平均消光度值是0.64, 那么上下限数值的范围即为 0.225-0.321。 15 方法2:用评估表精确评估抗体活性 1. 计算标准血清两个OD值的平均值，并检查其是否在给定的有效范围内。 2. 然后，根据标准血清的平均OD值在下表中确定对应的数据栏。 3. 用已测得的患者样品OD值查出“IU / ml或U / ml”栏中对应的抗体活性。 例如: 标准血清/OD范围 0.57-0.61 0.62-0.65 IU/ml 或 U/ml < 0.06 < 0.07 < 5 其它 0.07-0.12 5-10 0.13-0.22 11-19 0.23-0.32 20-30 0.33-0.40 31-40 例如:测得的标准血清平均消光度值为0.64，则对应表中OD值0.62-0.65一栏中的数据。如果患者血清样品的OD值为0.25, 对应的抗体活性范围应是20-30。 方法3:利用标准曲线进行抗体活性的连续求值。 测定间差异(指不同时间的检测差异和不同实验室的检测差异)可用校正系数 F 与当前测定数值相乘进行校正。校正系数的计算公式为: (标准血清)OD参考值 F = (标准血清)当前测量OD值 用户利用专用的标准曲线对检测试验的偏差进行校正是非常必要的。 首先，不同日期检测之间的差异可通过计算校正系数 F 进行校正。 1. 计算标准血清的两次OD值的平均值，并确认是否在有效范围内。 2. 校正系数 “F”的计算:用给定的参考数值除以标准血清两次消光数的 平均值。 16 F = 标准血清的参考消光数值 / 标准血清消光数的平均值 3. 将测得的所有病人血清的消光数值与校正系数 “F”相乘。 4. 用经过校正的消光数值在标准曲线“U/ml或IU/ml”坐标轴上确定对应 的抗体活性。 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG 活性的计算: 阳性结果: > 100 U/ml 不确定性结果: 40-100 U/ml 阴性结果: < 40 U/ml 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgM 活性的计算: 阳性结果: > 80 U/ml 不确定性结果: 60-80 U/ml 阴性结果: < 60 U/ml 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgA 活性的计算: 阳性结果: > 80 U/ml 不确定性结果: 60-80 U/ml 阴性结果: < 60 U/ml 针对不确定性结果的样品，应在1-2 周后对相应的病人再进行取样，重新检测。 8.3.2 利用SERION easy base 4PL软件/SERION评估软件进行自动评估 输入4个参数和标准血清的参考数值之后，联机软件能够立即自动计算出样品的抗体活性。 如果标准血清的光密度不在有效范围之内，SERION easy base 4PL软件就会出现下列提示信息: 17 “标准已超出允许范围”和 / 或“标准差异大于20%”。("Standards are not in tolerance range"和/或"Distance between standards is greater than 20 %.") SERION评估软件只用英语显示: “以下组样品标准值超出允许范围:以下组样品(1-24组)标准值差异大于20%”。("Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more than 20% in following groups: Group 1-24.") 这种情况下试验是无效的，必须重新进行试验。 只有更换批号时，参数和参考值才需要改变(评估表中标有参数与参考值)，可通过标准血清OD值对应IU/ml or U/mi栏中每组数据检查输入数据的正确性。计算出的平均OD值应与专用证书所列出的活性值相对应，软件可自动校正测定值，使用标准版软件会打印出如下内容: 样品编号 OD值 U / ml 或 U/ml 结果说明 8.4 检测结果说明 赛润 ELISA classic念珠菌IgG试剂的临界值范围是根据90%的随机血样呈阴性或在临界值范围内的试验结果确定的，因此IgG阳性结果可以确定是急性感染，而不是一般的初期感染。 根据赛润ELISA classic念珠菌IgG、IgM和IgA试剂临界值的设置，对于血清学表现的变化可以做出如下解释。 IgM抗体被认为是急性感染的敏感指标，明显升高的抗体滴度只需几天或几周 18 的时间就会降到正常水平;IgM抗体很少会长时间持续存在。对90份随机血样进行检测，结果均呈阴性。 与IgM抗体相比，IgG抗体能够在很长的时期内被检测到。在健康人群中重复感染时IgG的抗体滴度通常会比较高。 IgA抗体检测主要用于粘膜感染病例的诊断，也经常和IgG抗体一起进行检测。 在下面的表中对不同血清学试验的结果和相互影响因素进行了说明。 表3:不同血清学试验结果的说明: HAT IgM- IgG- IgA- 说明 ELISA ELISA ELISA - - - - 血清学阴性状态或继往感染;对免疫抑制病 人应注意考察临界值范围以下的抗体滴度 动力学特征。 - - + - 无急性感染迹象，念珠菌继往感染，正常的 血清普及率(与年龄有关的)。 + + - (+) 急性感染的特征 + + ? (+) 免疫抑制病人的特征 + + + (+) 需要进行抗原检测 下面的注解中说明了念珠菌感染的血清学特征: , 很少有结果表明HAT阴性与ELISA-IgG/M/A 阳性之间会相互影响，其原 因是ELISA 技术具有高敏感性，而抗原(细胞壁抗原的数量不同)之间存 在着差异。 , 对于免疫能力正常的人，要排除念珠菌病的可能性，应观察其临床表现， 并作进一步的检测(如培养试验，抗原检测)。 , 免疫抑制病人严重的念珠菌病几乎都要通过试验室检测进行诊断。 19 , 当HAT试验检测抗体滴度没有变化时，采用赛润 ELISA classic 白色念珠 菌 IgG/IgM/IgA 试剂检测，可以发现其抗体滴度的动力学特征。这些结果 与临床表现(如治疗成功)具有相关性。 , 由于免疫抑制病人体液免疫应答受到压制，临界值范围以下的抗体滴度动 力学就变得更加重要。 , 由于初期免疫反应的不成熟性，临界值范围以下的抗体滴度动力学则具有 很重要的意义。 9. 性能特征 9.1 可重复性 检测内结果的可重复性通过在同一批试验中检测20次不同反应的血清来判断，而检测间结果的可重复性通过分别在5天进行10次独立的血清检测分析来判断。 标准差 差异系数 (CV) = x 100 平均值 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgG: 平均消光值 检测内分析平均消光值 检测间分析 (OD) (CV%) (OD) (CV%) 样品 0.507 6.6 0.496 11.7 阴性 1.618 5.2 1.51 8.2 临界值 20 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgM: 平均消光值 检测内分析平均消光值 检测间分析 (OD) (CV%) (OD) (CV%) 样品 0.371 6.4 0.452 10.9 阴性 0.519 7.8 0.634 11.0 临界值 1.358 7.5 1.567 8.9 强阳性 赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgA: 平均消光值 检测内分析平均消光值 检测间分析 (OD) (CV%) (OD) (CV%) 样品 0.369 8.5 0.304 6.2 阴性 1.880 7.9 1.587 5.4 临界值 9.2 敏感性和特异性 在念珠菌血清学中应用最广的抗体检测试验还是念珠菌属血球凝集试验(C-HAT). 在赛润ELISA classic白色念珠菌试剂与C-HAT商品试剂的对照试验中，372个病例(其中65%是重病特别护理病人)结果有33.3 %呈IgG相关性，31.1 %呈IgM相关性，和26.7%呈IgA-ELISA阳性。ELISA试验的阳性结果能够对应HAT试验中阳性或处于临界值范围内的每个病例，而ELISA试验处于临界值范围内的病例数量明显低于HAT试验相应的病例数(ELISA:IgM: 3.5 %，IgG: 7.3 %，IgA: 1.9 %;HAT:22.6 %)。这表明ELISA试验能够更好地鉴别阳性和阴性结果。 赛润 ELISA classic 白色念珠菌试剂的性能 赛润 ELISA classic 白色念珠菌IgG和IgM试剂与C-HAT临床相关抗体的滴度动力学 21 与HAT抗体滴度相比，ELISA方法对不同免疫球蛋白的鉴别其重要性在于它能够表现霉菌病的病情发展过程(图2, 来自明斯特大学[Münster University，德国] W. Fegeler博士的个人通讯)。HAT的检测结果不能对临床表现给予明确的解释，而通过ELISA试验得到的IgM抗体滴度动力学特征却与临床表现有很好的对应关系。 图2: 对一感染的5岁男孩，经诊断发现患有念珠菌败血症和葡萄球菌感染，使用两性霉素B和5-氟胞嘧啶治疗4周，再用氟康唑治疗4周，最终可以看到念珠菌败血症已完全恢复。 鉴于以上原因，以HAT试验作为金标，来计算赛润 ELISA classic 白色念珠菌 IgM、IgG和IgA 试剂的敏感性和特异性是没有意义的。 22 计算赛润ELISA classic试剂与其它ELISA商品试剂相比较的敏感性和特异性是行不通的，因为赛润 ELISA classic试剂只用于急性感染期的检测，而其它商品试剂还用于正常人群的血清普及率的检测。 10. 警告 10.1 警告和安全措施 赛润 ELISA classic试剂盒是针对熟悉实验室操作人员所设计使用的。 所有试剂盒试剂及人类标本必须采用已有的良好实验技术，小心处理: - 此试剂盒内含人血成分。尽管所有的对照及定点对照都已经过试验验证并且发现对于乙型肝炎表面抗原，丙型肝炎抗体，HIV抗体均为阴性;但仍认为它们具有潜在的感染性。 - 移液过程禁止用口。 - 在处理试剂和标本的地方禁止吸烟，饮食。 - 使用试剂盒和标本时，必须戴一次性手套，穿试验服，戴安全镜。使用后请彻底洗手清洁。 - 患者样本及其他潜在感染材料试验后应予以消毒。 - 试剂应保存在安全的地方，禁止儿童接触。 - 终止液:具有腐蚀性(C);发生酸烧伤(R34);因此在操作时应穿戴防护镜，手套和试验服。 10.2 废料处理 请注意相关要求～ 23 11. 参考文献 Fegeler, W. „Möglichkeiten einer differenzierten Candida-Serologie“ Pilzdialog 4/1992, 61-62 Jones J.M. „Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis“ Clin. Microbiol. Rev.; Vol.3 No.1, 32-45 (1990) Kostiala A.A.I., Kostiala I. „Enzyme-Linked-Immunosorbend Assay (ELISA) for IgM, IgG and IgA Class Antibodies agains Candida albicans Antigens: Developement and Comparison with Methods“ Sabourandia 19, 123-134 (1981) Matthews R.C., Burnie J.P., Tabaqchali S. „Isolation of Immunodominant Antigens from Sera of Patient with Systemic Candidiasis and Characterization of Serological Response to Candida albicans“ J. Clin. Microbiol., Vol.25 No.2, 230-237 (1987) Matthews R.C., Burnie J.P. „Diagnosis of Systemic Canidiasis by Enzyme-Linked Dot Immunobinding Assay for a Circulating Immunodominant 47-Kilodalton Antigen“ J. Clin. Microbiol., Vol.26 No.3, 459-463 (1988) Meunier F. „Candidiasis“ Eur. J. Clin. Microbiol. Inf. Dis., Vol.8 No.5, 438-447 Müllensiefen M, Ringelmann R. „Labor-Diagnostik systemischer Candidosen“ Lab. med. 15, 410-413 (1991) Repentigny L. „Serological Techniques for Diagnosis of Fungal Infections“ Eur. J. Clin. Microbio. Infec., Vol.8 No. 4, 362-375 (1989) Tietz H.-J., Tausch Irene „Differenzierte Candidaserologie auf dem Prüfstand“ Pilzdialog 4/1993, 55-56 Walsh T.J. et al. „Detection of Circulating Candida Enolase by Immunoassay in Patients with Cancer and Invasive Candidiasis“ New Engl. J. Med., Vol.324 No.15, 1026-1031 (1991) 24 Werle E., Kappe R., Fiehn W., Sonntag H.-G. „Nachweis von Anti-Candida- Antikörpern der Klassen IgM, IgG und IgA mittels Enymimmunoassays in sequentiellen Serumproben hospitalisierter Patienten“ Mycoses 36 (Suppl. 1), 71-78 (1994) Zöller L., Krämer I., Kappe R., Sonntag H.G. „Enzyme Immuno Assay for Invasive Candida Infections: Reactivity of somatic Antigens of Candida albicans“ J. Clin. Microbiol., Vol.29 No.9, 1860-1867 (1991) 赛润 ELISA classic 标签注释 / symbols on labels: LOT 签号 / lot REF 订货号码 / reference or order number x…y? 储存在x…y之间的温度下 / store between x and y degree celsius CE 按照欧共体标准98/79执行 / CE marking according to IVD guideline 98/79 EC CE0197 按照欧共体标准98/79附录II, B目录执行 / CE marking according to IVD guideline 98/79 EC according to annex II, list B 终止日期 / expiry date MTP 微孔板 / microtiter plate(breakable strips) AG 抗原 / antigen CAG 对照抗原 / control antigen STD 标准血清 / standard serum POS 阳性对照 / positiv control C / O 界定血清 / cut-off serum NEG 阴性对照 / negative control APC 酶标记的抗人 / alkaline phosphatase conjugate anti-human + 低浓度的酶标记物 / conjugate with low concentration 25 ++ 中等浓度的酶标记物 / conjugate with medium concentration +++ 高浓度的酶标记物 / conjugate with high concentration RF 类风湿因子RF—吸附剂 / rheumatoid factor absorbent (rf-absorbent) Rf/CAG 赛润对照抗原类风湿因子RF—吸附剂 / rheumatoid factor absorbent (rf-absorbent) with control antigen DILB 血清稀释缓冲器 / dilution buffer for sera WASH 洗涤液 / washing solution concentrate pNPP pNPP酶结合物 / pNPP substrat STOP 终止液 / stopping solution 有腐蚀性 / corrosive CERT 标准曲线和评估表 / certificate(standard curve and evaluation table) INFO 用法说明书 / instructions RTU 立即可用 / ready-to-use CONC 浓缩 / concentrate DIL 稀释或溶解 / dilute or disolve in AQUA 蒸馏水 / aqua detillata IVD 体外诊断使用 / in-vitro diagnostic use 128 腺病毒 / Adeno, Virus 132 烟曲霉 / Aspergillus fumigatus 120 百日咳 / Bordetella pertussis 1201 百日咳毒素 / Bordetella pertussis Toxin 121 Burgdorferi 疏螺旋体 / Borrelia burgdorferi 116 布鲁氏菌 / Brucella 139 空肠弯曲杆菌 / Campylobacter jejuni 117 白色念珠菌 / Candida albicans 137 衣原体 / Chlamydia 1311 热柯克斯体 Q-Fever I / Coxiella brunetii (Q-fever) phase 1 26 1312 热柯克斯体 Q-Fever II / Coxiella brunetii (Q-fever) phase 2 134 柯萨奇病毒 / Coxsackievirus 109 巨细胞病毒 / Cytomegalovirus 130 白喉 / Diphtheria 1362 EB病毒 EBNA1 / Epstein-Barr, Virus/EBNA 1 1361 EB病毒 VCA / Epstein-Barr, Virus/VCA 107 棘球属 / Echinococcus 135 艾柯病毒 / Echovirus 133 肠道病毒 / Enterovirus 112 TBE病毒 / TBE Virus 118 幽门螺旋杆菌 / Helicobacter pylori 1051 单纯疱疹病毒1 / Herpes Simplex, Virus 1 1052 单纯疱疹病毒2 / Herpes Simplex, Virus 2 105 单纯疱疹病毒1 / 2 / Herpes Simplex, Virus 1/2 1231 流感病毒 A / Influenza, virus A 1232 流感病毒 B / Influenza, virus B 106 嗜肺军团菌1-7 / Legionella Pneumophila 1-7 125 钩端螺旋体 / Leptospira 102 麻疹病毒 / Measles Virus 103 腮腺炎病毒 / Mumps Virus 127 肺炎支原体 / Mycoplasma pneumoniae 1261 副流感病毒1 / Parainfluenza, virus 1 1262 副流感病毒2 / Parainfluenza,virus 2 1263 副流感病毒3 / Parainfluenza,virus 3 126 副流感病毒1, 2, 3 / Parainfluenza,virus 1, 2, 3 122 细小病毒 B19 / Parvovirus B19 113 呼吸道合胞病毒 / Resp. Syncitial Virus 129 风疹病毒 / Rubella virus 108 破伤风 / Tetanus 110 弓形虫 / Toxoplasma gondii 104 带状疱疹病毒 / Varicella-Zoster Virus(VZV) 138 耶尔森氏菌 / Yersinia 27 28