生脉保元汤体内抗柯萨奇B3病毒的实验研究

生脉保元汤体内抗柯萨奇B3病毒的实验研究 生脉保元汤体内抗柯萨奇B3病毒的实验研 究 - 208?郧阳医学院(JYMC)2004年8月,23(4):208 [文章编号]lOO6—9674(2004)04--0208--04 生脉保元汤体内抗柯萨奇B3病毒的实验研究 张宏考,熊常初 (郧阳医学院附属人民医院心内科,湖北十堰442000;湖北中医学院) [摘要]目的:观察生脉保元汤对柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠的影响并初步探讨其作用机制.方珐:经腹腔注 射柯萨奇B3病毒来建立病毒性心肌炎小鼠模型.观察小鼠的一般状况,死亡率;观察小鼠心肌组织病理改变{采 用逆转录——聚合酶链反应方法检测小鼠心肌中干扰素和肿瘤坏死因子的表达.站束:生脉保元汤能剂量依赖性 地降低小鼠死亡率.改善发病小鼠的一般状况;有效减轻心肌的炎症反应;诱生干扰索,抑制肿瘤坏死因子的表达 结论:生脉保元汤对病毒性心肌炎小鼠具有治疗作用. [关键词]生脉保元汤;病毒性心肌炎;干扰素7;肿瘤坏死因子a;逆转录——聚合酶链反应 [中图法分类号]R542.21[文献标识码]A ExperimentalstudyofShengMaiBaoYuanSoup(SMBY)againstCVB3virusinvivoZHAN GHong—kao, XIONGChang—chu(Departmentofcardiology,ShiyanPeople'sHospita1.Yunyangmedicalcollege,Shiyan, Hubei442000:.ChinesetraditionalmedicinecollegeofHubei,Wuhan,Hubei43~061) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectsofSMBYontheviralmyocarditismicesinfectedCVB 3andtoexploreits possiblemechanism.MethodsAnimalmodelWasinducedbythemeansofinjectingcoxsacki eB3virusintothemice' abdonSinalcavity.Thegeneralstatus,mortalityandthemyocardiumpathologidalchangesw ereobserved.Thelevelof TNF— amRNAandIFNmRNAwastestedwithreversetranscriptionpolymerasechainreaction.Res ultsAfter medication,themortalitywasdecreased,thegeneralstatusimproved,themyocardiumpatho logicalchangesre— lieved,andIFN一wasinducedandTNF一 "expressionwasinhibited.ConclusionsSMBYhastherapeuticeffecton VMCmice. Keywords:SMBY;viralmyocarditis(VMC);interferon--(IFN一);tumornecrosisfactoralpha(TNF--d);re— versetranscriptionpolymerasechainreaction(RT——PCR) 病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是指嗜 心性病毒感染引起的,以心肌非特异性问质性炎症 为主要改变的心肌炎.其发病机理至今尚未完全阐 明,然而病毒直接侵犯心肌和经T淋巴细胞介导的 免疫反应引起的心肌损害已被证实l1].但目前临床 上尚缺乏特效的治疗方法与药物.祖国医学对 VMC有独到的认识,治疗方法也有一定疗效.本 实验拟初步探讨生脉保元汤对小鼠柯萨奇B3病毒 性心肌炎的治疗作用及可能机制,为其临床使用提 供较为可靠的实验依据. [作者简介]张宏考(196l一),男.陕西武功人,副主任医 师,学士,主要从事心血管内科的研究. :【材料与方法 :【.1实验材料 1.1_1实验动物:纯种雄性BALB/C小鼠,4周 龄,11,12g,购自湖北省实验动物中心(动物合格 证号第19—083号). 1.1.2药物与病毒:生脉保元汤:由郧阳医学院附 属人民医院制剂室制备,每毫升含生药量1g,高压 灭菌后,保存于4?冰箱.CoxB3(柯萨奇病毒B3 嗜心肌株):由华中科技大学同济医学院附属协和医 院病毒室董继华主任惠赠,本实验室一7O?低温冰 箱保存备用. 】.1.3主要仪器:无菌操作台,离心机,长波紫外 投射仪,PCR仪,水平电泳仪,GDS8000凝胶成相分 张宏考等.生脉保元汤体内抗柯萨奇B3病毒的实验研究?2O9? 析系统. 1.1.4主要试剂:IFN—y上下游引物序列:5'一 AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGT一3': 5'一GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG 一 3'.TNF—a上下游引物序列:5'一AACTAG TGGTGCCAGCCGAT一3':5'一CTTCAC AGAGCAATGACTCC一3'.I3一actin上下游引 物序列:5'一TGGAATCCTGTGGCATCC ATGAAAC一3';5'一TAAAACGCAGCT CAGTAACAGTCCG一3'.以上均由大连 TakaRa公司合成.DNTPs,Taq酶及逆转录酶 (LMLV)来自Promega公司. 1.2实验方法 1.2.1观察生脉保元汤对实验性VMC小鼠疗效: 动物随机分为6组,N组:正常对照组(10只);M 组:模型对照组(16只);R组:病毒唑药物对照组 (16只);S组:高剂量生脉保元汤治疗组(16只);S 组:中剂量生脉保元汤治疗组(16只);S.组:低剂量 生脉保元汤治疗组(16只). (1)小鼠模型建立:除N组外,M,R,S,S2,S组 腹腔无菌注射含IOOTCID5.CVB3的Eagle'sMEM 液0.2ml,N组则注射Eagle'SMEM液0.2ml. 病毒感染1h后,N与M组给予生理盐水灌胃,R 组给予病毒唑液灌胃(50mg/kg),S,S,S.组给予 生脉保元汤灌胃(分别为40g/kg,20g/kg,10g/ kg).各组均为每天两次,疗程为lOd. (2)一般状况的观察:详细观察动物的精神状况, 饮食,活动,大小便,皮毛色泽形态,同时进行死亡率 统计. (3)心肌组织学检测:感染病毒后第5d至第9d 随机处死(每组抽取2只,其它进行死亡率统计),在 无菌条件下,快速剖心目检,纵向解剖为两份,一份 经40g/L甲醛固定后石蜡包埋,病理切片,贴于载 玻片上,HE染色,光镜下观察心肌组织形态学改 变. 1.2.2观察生脉保元汤对实验性VMC小鼠的免 疫调节作用:动物随机分为3组,N组:正常对照组 1O只;M组:模型对照组15只;S组:生脉保元汤治 疗组l5只. (1)小鼠模型建立:方法同上.病毒感染1h后, S组给予生脉保元汤(4Og/kg)灌胃,每天两次,每 次0.2ml,疗程为1周.N组和M组按同法给等容 量生理盐水. (Z)VMC小鼠心肌TNF—amRNA和IFN—y mRNA的RT—PCR检测:各组小鼠于感染后l周 处死,取一7O?冻存心脏. (3)RT—PCR:采用Trizol法提取心肌标本的总 RNA.逆转录反应的成分包括样品总RNA5l,随 机引物0.5l,5×逆转录酶缓冲液5l,LMLV逆 转录酶0.5l,4×dNTPll,加dH0至总体积为 25l混匀.42?水浴60rain后取出反应物.PCR 扩增反应成分包括上述逆转录产物2.5l,其余成 分均先混合后再等量分装于各反应体系.其成分包 括dH2031.5l,4×dNTP1l,10×PCR反应缓 冲液5l,上游引物(TNF—Q或IFN—y或I3一aC tin)ll,下游引物(TNF—a或IFN—y或J3一ac— tin)1l,TaqDNA聚合酶0.5l,MgC125l,混匀 后加灭菌石蜡油,扩增3O个循环.其中TNF—a扩 增参数为94?5rain,94?30s,60?30S,72?90 s,72?5rain;IFN—y扩增参数为94?2rain,94 ?50S,60?50S,72?60S,72?4rain.1琼脂 糖凝胶(含EB)电泳,紫外灯下观察结果. (4)半定量检测:用GDS8000凝胶成相分析处理 系统对RT—PCR电泳照片之TNF—a条带(332 bp),IFN—y条带(243bp)和相应内对照J3一actin 条带(348bp)进行扫描,测量面密度值.计算公式 为:IFN—y相对量=IFN—y产物电泳条带相对 量一actin产物电泳条带相对量×100;TNF—a 相对量=TNF—a产物电泳条带相对量/J3一actin 产物电泳条带相对量×100. 1.3统计方法 数据处理用均数?差(土),组问比较采 用方差分析,率的比较用X检验,P<0.05认为有 显着性差异. 2实验结果 2.1生脉保元汤对病毒性心肌炎小鼠一般状况的 影响 病毒感染后第3d,除了N组外,各组均有小鼠 出现皮毛紊乱,无光泽,倦缩驼背,少动等病态表现. 第4d开始死亡,第5d以后症状逐渐加重,重者拒 食,体重减轻,抽搐,死亡逐渐增多.第7,9d死亡 达高峰.治疗组小鼠较M组小鼠上述症状为轻,死 亡数量亦少,尤其是S组,仅部分小鼠有症状,如松 毛,少动(见表1). ?210?郧阳医学院(JYMC)2004年8月,23(4):208 表1接种病毒后9d小鼠死亡率比较 与M组比较:'P>0.05.,P<0.05,…P<O.01; 与N组比较:P>0.05,?P-Q0.01;与Sl组比较:P<O.01. 2.2生脉保元汤对病毒性心肌炎小鼠心肌病理改 变的影响 感染病毒的各组小鼠心外膜下均有不同数量的 白色点状,条索状或斑块状病灶,以M组数量为多 且程度较重.光镜检查M组病变呈灶性分布,感染 病毒后9d病变较5d更为广泛,可见较多的心肌坏 死病灶,大量淋巴细胞或单核细胞浸润.而药物治 疗组中以S.组小鼠心肌病变较M组明显减轻,可 见少量心肌坏死病灶,伴少量淋巴细胞或单核细胞 浸润(见图1,2). 2.3VMC小鼠心肌IFN一7mRNA.TNF—d mRNA表达 RT—PCR产物电泳结果见图3,4.所有各组 IFN--7,TNF—圾一actin扩增产物经琼脂糖凝 胶电泳,所示条带均位于300bp附近,说明扩增产 物符合的片段大小,可以确定所扩增的产物分 别为IFN一7,TNF—和—actin.各组随机抽取 一 只小鼠进行半定量检测,从所摄片上来看,IFN一 7mRNA表达的半定量R值变化为:N组0.5074, S组1.0192,M组0.7036.TNF—mRNA表达 的半定量R值变化为:N组0.4764,S组0.7030,M 组1.0635. 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 348bp 243bp 图3RT,PCR法检测心肌中IFN一7mRNA, 其中A,C,E分别为正常组,模型组,治疗组 2000bp 1000bp 750bp 5006p 250bp 100bp 的IFN一7mRNA扩增结果,而B,D,F则 分别为上述三组一actin的扩增结果. 辩 圈4RT—PCR法检测心肌中TNF—dtuRNA, 其中A,C,E分别为正常组,模型组,治疗组 的TNF—mRNA扩增结果,而B,D,F则 分别为上述三组fj—actin的扩增结果. 3讨论 病毒性心肌炎临床表现为发热,乏力,胸痛,气 短,心悸等.祖国医!虽无病毒性心肌炎之病名,但 依据本病症状和体征属于"心悸","怔忡","胸痹"等 范畴,依据病因则属于"温病"范畴[2].多数医家认 为,正气不足,外邪侵心是本病发生的关键.生脉保 元汤为李杲《内外伤辨惑论》之方,该方由人参,麦 冬,五味子,黄芪,甘草五昧组成,主治暑热汗多,耗 气伤阴及久咳肺虚,气阴两伤之证,具有补气养阴之 功效.病毒性心肌炎,中医认为多由温热病邪入侵 心脉,耗伤营阴而致气阴两虚为主[.在体外实验 研究中已证实,该方能直接杀灭coxB3一Nancy株 和coxB3株;能阻止coxB3Nancy株和coxB3株 的增殖;能阻止coxB3一Nancy株和coxB3株吸附, 穿人易感细胞. 在本实验中,心肌病理切片结果显示生脉保元 汤能明显减轻VMC小鼠心肌病变,减少心肌病变 处的炎性细胞浸润,从而减轻VMC的炎症反应,同 时我们统计了各组/J,.鼠死亡率,结果发现生脉保元 汤能够剂量依赖性地降低VMC小鼠死亡率,这与 组织形态学观察结果是一致的.以上结果证实了生 脉保元汤对实验性VMC小鼠有明显疗效. (下转第2l3页) 胡云等.异氟醚麻醉大鼠脊髓NOS活性和NO产量的动态变化?2l3? NO产量渐进性升高,清醒期恢复至正常对照组水 平.因此我们可以推论,对N0S的抑制,干扰鼠脊 髓NO的生成是异氟醚发挥麻醉镇痛作用机制之一 [参考文献] [4]KurodaY,StrebelS,RaffertyC,eta1.Neuroprotec— tivedoseofN,methy—D,aspartatereceptorantag— onistsprofoundlyreducetheminimumalveolaranes- thetieconcentration(MAC)forisofluraneinratsEJ]. AnesthAnalg,1993,77(4):795—800. YamamotoT,ShimoyamaN.MizuguchiT.NitricOX— idesynthaseinhibitorblocksspinalsensitizationin— ducedbyformalininjectionintotheratpaw[J]. AnesthAnalg,1993,77(5):886—890. 姚立农.脊髓是吸人麻醉药的作用位点[J].《国外医 学》麻醉学与复苏分册,1995,16:262—264. [收稿日期]2O04一O6—16 (上接第210页) 机体受到病毒感染时,病毒能诱导机体产生干 扰素,干扰素由淋巴细胞产生,具有抗病毒,抑制细 胞增殖,抗肿瘤和免疫调节的作用,免疫系统中几乎 所有效应细胞均可受干扰素的调节.干扰素的抗病 毒作用并非直接杀死病毒,而是通过诱导细胞产生 抗病毒蛋白,增强几乎所有杀伤细胞的杀伤功能,为 机体抗病毒感染的重要非特异性防御体系[引.IFN 一 了在VMC早期的抗病毒作用已被众多的研究结 果所证实].TNF—a是机体在受到感染或组织损 伤等刺激时产生的一种致炎性多肽类细胞因子. TNF—a除可使免疫杀伤细胞分化,增殖外,亦可诱 导增强心肌细胞主要组织相关抗原一l(MHC—1) 的表达j,从而促进毒性T淋巴细胞杀死和破坏心 肌细胞[8].我们研究结果表明,生脉保元汤能促进 诱生小鼠心肌lFN一7mRNA,抑制TNF一0tmR NA的表达量,这一结果提示,生脉保元汤对病毒性 心肌炎的治疗作用,其机制可能有一方面是通过促 进机体诱生干扰素,抑制肿瘤坏死因子而实现的,从 而达到减轻VMC小鼠心肌的病理改变,降低小鼠 死亡率. 综上所述,生脉保元汤能改善病毒性心肌炎小 鼠的一般状况,减轻心肌病变,降低死亡率,促进干 扰素诱生,抑制肿瘤坏死因子的表达,从而达到治疗 病毒性心肌炎的目的. (文中图1,2见封二) [1] [2] [3] [4] [8] [参考文献] 王吉耀主编.内科学[M].北京:人民卫生出版社, 2002.328. 于作详,陈建吕.病毒性心肌炎应属"温病"范畴[J]. 河南中医,1998,18(1):25. 孙云.急性病毒性心肌炎发病机制解析[J].山东中 医药大学,2001,25(6):413414. 张宏考.张晓华.中药生脉保元汤体外抗柯萨奇B3 病毒的作用[J].临床心血管病杂志,2003,19(增刊): 75. 何球藻主编.细胞与分子免疫学[M].上海;上海科学 技术文献出版社,1998.189一l98. MatsumoriA.TomiokaN,KawaiC+ela1.Protec— tiveeffectofrecombinantalphainterferononCOX— sackievirusB3myocarditisinmice[J].AmHeartJ. l988,115(6):l229—1232. KlingelK,KandolfR.Theroleofenterovirusrepli cationinthedevelopmentofacuteandchronicheart musclediseaseindifferentimmunocompetentmouse strains[J].ScandJInfectDisSupp1.1993,88:79— 85. 张松,饶邦复.TNF—nmRNA在小鼠病毒性心肌 炎中表达及意义[J].中华病理学杂志.2002,31(3): 25O一252. [收稿日期]2004一o6一l6 一_三?曲,.:一一一,,一,,一v=兰亿一川一,,一一一一,,一M舭,一一,一,一一,,一一一一,一一一一一 海马注射Ap.诱导大鼠记忆减退及其脑内 细胞周期蛋白的异常表达 IF史l93酊I 围l填型组第9天.心吼多个廿性坏.非肓兜性细玎乜挂润(HE10uJ 图2慷僳元洒治疗组第9可览心日I【变性膻小帕炎性损伤址lI{E×2C]… 文见208面】