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通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株

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通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株 研 究 报 告doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.012 通 过 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 改 造 CHO 细 胞 株 付 玲 ,赵 兴 卉 ,郭 俊 伟 ,于 婷 ,宋 小 红 ,侯 利 华 ,陈 薇 军 事 医 学 科 学 院 生 物 工 程 研 究 所 ,病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室,2004DAV00214,,北京 100071 ,摘 要, 目 的 ...
通过共表达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株
通过共达转铁蛋白和细胞周期蛋白D1改造CHO细胞株 研 究 报 告doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.012 通 过 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 改 造 CHO 细 胞 株 付 玲 ,赵 兴 卉 ,郭 俊 伟 ,于 婷 ,宋 小 红 ,侯 利 华 ,陈 薇 军 事 医 学 科 学 院 生 物 工 程 研 究 所 ,病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室,2004DAV00214,,北京 100071 ,摘 要, 目 的 ,对 现 有 的 CHO-DG44 细 胞 株 进 行 改 造 ,得 到 在 无 血 清 培 养 基 中 更 具 生 长 优 势 的 CHO 宿 主 细 胞 株 。 方 法 ,分 别 克 隆 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 基 因 ,构 建 共 表 达 2 种 基 因 的 pIRES 质 粒 ,转 染 CHO-DG44 细 胞 株 ,筛 选 G418 抗 性 克 隆 。 结 果 与 结 论 ,得 到 3 株 G418 阳 性 克 隆 株 ,其 中 转 铁 蛋 白 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 表 达 水 平 最 高 的 S6 与 CHO-DG44 相 比 ,在 无 血 清 培 养 基 中 生 长 更 快 、密 度 更 高 。 ,关 键 词, 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 ,代 谢 工 程 ,转 铁 蛋 白 ,细 胞 周 期 蛋 白 D1 ,中 图 分 类 号, Q813; Q78 ,文 献 标 识 码, A ,文 章 编 号, 1009-000,22012,05-0676-04 Construction of Optimized CHO Cell Lines by Overexpressio n of Transferrin and Cyclin D1 FU Ling, ZHAO Xing-Hui*, GUO J un-Wei, YU Ting, SONG X iao-Hong, HOU Li-Hua, CHEN Wei* State Key L aboratory of Pathogens anBd io security,2004DAV0021,4, Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China *Co-corresponding authors, CH EN Wei, E-mail: cw789661@yahoo.com; ZHAO Xing-Hui, E-mail: zhao4work@yahoo.com.cn ,Abstract, Objective: To optimize CHO-DG44 cell line for better performancine serum-free culture. Methods: Transferrin and cyclin D1 ORFs werei nserted into pIRES, then the construct was transfecintteo d C HO-DG44 cells. The cells were treated wi th G418 at a fi nal concentration of 800 μ g/mL for sleection. Results and Coclu? sion: Three C HO-DG44 cell lines overexpressing transferrin and cyclin D1 wereo btained. The growth rate of one of these three cell li nes, S6, was isgnificantly greater than CH ODG44 during days 4~7 of pseunssion - culture in [2]中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞,Chinese hamsteorv ary。 例 如 ,共 表 达 IGF-1 和 Bcl-2 的 CHO 细 胞 株要 求 serum-free medium. Our study proved thaovt er expression of cyclin D1 and transferrin could confer C HO-cell,CHO 细 胞,表 达 系 统 因 具 有 准 确 的 转 录 后 修 饰不 仅 对 恶 劣 培 养 环 境 诱 导 的 凋 亡 具 有 更 强 的 抵 抗 DG44 能 功 能 ,且 表 达 的 糖 基 化 蛋 白 药 物 在 分 子 结 构 、理 化 性 with increased growth rate, anpd ro vided new candidate CHO cell lines for biopharmaceutical production. [3]力 ,还 可 以 通 过 自 分 泌 IGF-1,降 低 对 培 养 基 中 添 加质 和 生 物 学 功 能 方 面 最 接 近 天 然 分 子 ,而 成 为 生 产 IGF-1 的 依 赖 性。 与 未 经 改 构 的 CHO 细 胞 株 相 比 , ,Key words, Chinese hamster ovary cell ; metabolic engineering; transferrin; cyclin D1 诸 如 抗 体 等 大 分 子 蛋 白 质 药 物 的 首 选 表 达 系 统 。 然 共 表 达 存 活 素 和 细 胞 周 期 蛋 白 D1 的 CHO 细 胞 株 进 而 ,在 工 业 规 模 化 培 养 过 程 中 ,CHO 细 胞 常 遇 到 细 入 S 期 的 比 例 增 加 56%~94% ,早 期 凋 亡 减 少 33%~ 胞 生 长 缓 慢 、易 凋 亡 ,以 及 对 无 血 清 培 养 基 适 应 性 差 43% ,且 可 以 在 无 血 清 培 养 基 中 达 到 更 高 的 生 长 密 [1]等 问 题 。 为 了 刺 激 CHO 细 胞 的 生 长 ,需 要 在 无 血 [4]度,而 人 工 构 建 的 自 表 达 转 铁 蛋 白 和 IGF-1 的 CHO 清 培 养 基 中 添 加 胰 岛 素 样 生 长 因 子,IGF,和 转 铁 蛋 [5]细 胞 株 甚 至 能 在 无 蛋 白 培 养 基 中 持 续 高 速 生 长。 白 等 生 长 因 子 ,这 些 因 子 大 多 是 动 物 来 源 的 蛋 白 我 们 通 过 在 CHO 细 胞 株 中 共 表 达 转 铁 蛋 白 和 质 , 不 仅 费 用 高 昂 ,而 且 还 有 被 病 毒 污 染 的 潜 在 可 细 胞 周 期 蛋 白 D1,构 建 了 在 无 血 清 培 养 基 中 具 有 生 能 。 长 优 势 的 CHO 宿 主 细 胞 株 。 利 用 代 谢 工 程 方 法 在 CHO 细 胞 株 中 高 表 达 某 些 重 要 基 因 ,可 以 使 所 构 建 的 新 型 CHO 细 胞 株 在 一 1 材 料 与 方 法定 程 度 上 克 服 上 述 局 限 ,更 适 应 产 业 化 规 模 培 养 的 收 稿 日 期 ,2012-02-06 1.1 材 料基 金 项 目 ,国 家 自 然 科 学 基 金,81025018,30570951, 作 者 简 介 ,付 玲,1961 ,,女 ,高 级 实 验 师- CHO-DG44 和 CHO-S 细 胞 购 自 Invitrogen 公 司 , 通 信 作 者 ,陈 薇 ,,Email,cw789661@yahoo.com,赵 兴 卉 ,,Email,-- CHO-K1 细 胞 、大 肠 杆 菌 DH5α感 受 态 为 本 室 保 存 , zhao4work@yahoo.com.cn 质 粒 pIRES 购 自 Clontech 公 司 ,pGEM-T 购 自 Pro?mL 的 G418筛 选 阳 性 克 隆 。 铺 96 孔 板 ,挑 取 30 个 mega 公 司 。G418 阳 性 克 隆 放 大 培 养 。 HT、细 胞 贴 壁 培 养 所 用 的 MEM 培 养 基 及 悬 浮1.4 Western印 迹 验 证 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 基 因 培 养 所 用 的 CHOSSFM?培 养 基 购 自 Invtrogen 公在 CHODG44 细 胞 中 的 表 达--i- 司 ,胎 牛 血 清,FBS,购 自 Hyclone 公 司 ,细 胞 转 染 试细 胞 裂 解 物 的 提 取 方 法 及 Western印 迹 方 法 参 [4]剂 LipofectAMINE200 0 购 自 Invtrogen 公 司 。照 文 献。 i 1.5 无 血 清 培 养 基 中 细 胞 生 长 曲 线 测 定转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 的 抗 体 、ECL 免 疫 印 迹 底 物 购 自 Santa Cru公z 司 ,辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的CHO-DG44 及 表 达 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 的 阳 二 抗 购 自 中 杉 金 桥 公 司 。 性 克 隆 在 含 HT 的 无 血 清 培 养 基 CHOSSFM?中 培-- 1.2 双 顺 反 子 表 达 载 体 pTID 的 构 建养 至 对 数 期 ,以 2000/孔 的 密 度 接 种 96 孔 板 ,每 孔 加 根 据 GenBank序 列 BC092046设 计 转 铁 蛋 白 基入 200 μL 上 述 无 血 清 培 养 基 。 每 天 每 株 细 胞 取 因 引 物 ,在 基 因 中 部 设 计 Xho?酶 切 位 点 ,分 成 2 部3 分 ,以 小 鼠 肝 脏 cDNA 为 模 板 扩 增 ,通 过 Nhe?和 Mlu孔 ,用 台 盼 蓝 染 色 ,计 数 活 细 胞 。 [6] ?克 隆 入 pIRES,依照 文 献 方 法 ,以 CHOS 细 胞 系- 2 结 果 的 cDNA 为 模 板 扩 增 周 期 蛋 白 D1 基 因 序 列 ,通 过 BamH?和 Sal?克 隆 入 pIRES。 引 物 见 表 1。 2.1 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 基 因 的 克 隆 PCR 扩 增 条 件 ,94?预 变 性 10 min,然 后 从 54? 由 于 以 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 等 3 株 开 始 每 5 个 循 环 退 火 温 度 增 加 2?直 至 62?,每 个 循 CHO 细 胞 的 cDNA 为 模 板 都 没 有 扩 增 到 转 铁 蛋 白 基 环 72? 延 伸 90 s,最 后 延 伸 7 min。 产 物 进 行 琼 脂 因 ,于 是 便 以 小 鼠 肝 脏 cDNA 为 模 板 扩 增 。 在 基 因 糖 凝 胶 电 泳 ,从 胶 上 切 下 各 约 1000 b p的 片 段 ,连 接 中 部 设 计 引 物 ,引 入 酶 切 位 点 Xho?,分 成 2 段 分 别 入 pGEMT 载 体 ,测 序 。- 克 隆 ,PCR 结 果 如 图 2 所 示 。 将 测 序 正 确 的 转 铁 蛋 白 2 段 基 因 分 别 用 核 酸 分 别 以 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 的 cD? 内 NA 为 模 板 ,扩 增 中 国 仓 鼠 周 期 蛋 白 D1 基 因,图 3,。 切 酶 Nhe?/Xho?和 Xho?/Mlu?从 经 测 序 正 确 的 T 与 CHO-DG44 一 样 ,CHO-S 也 是 购 自 Invitrogen 公 载 体 中 切 下 ,连 入 经 Nhe?/Mlu?酶 切 的 连 有 正 确 的 司 的 商 品 化 细 胞 ,由 细 胞 株 CHO-K1 驯 化 而 来 ,因 此 周 期 蛋 白 D1 基 因 序 列 的 载 体 中 ,选 取 酶 切 鉴 定 正 确 是 dhfr 非 缺 陷 型 细 胞 ,可 在 无 血 清 培 养 基 CHO- 的 质 粒 ,命 名 为 pTID,图1 ,。 S-SFM?中 悬 浮 生 长 。 该 细 胞 株 与 CHO-DG44 相 比 1.3 CHO-DG44 细 胞 的 转 染 与 阳 性 克 隆 的 筛 选 虽 然 无 法 用 MTX 加 压 ,但 其 生 长 活 力 比 CHO-DG44 用 LipofectAMINE2000 将 pTID 转 染 CHO-DG44 细 胞 ,根 据 试 剂 说 明 书 操 作 。 以 终 浓 度 为 800 μ g/ 图 2 转 铁 蛋 白 基 因 的 扩 增 M,DNA marker D L2000,1,转 铁 蛋 白 基 因 前 半 段 , 表 达 载 体 pTID 示 意 图图 1 2,转 铁 蛋 白 基 因 后 半 段 表 1 引 物 序 列 引 物 序 列,5'-3', 备 注 周 期 蛋 白 D1 基 因 上 游 引 物D1-FTAGGATCCCACCATGGAACACCAGCTCCTGCC CCD1RAAGTCGACTCAGATGTCCACATCTC周 期 蛋 白 D1 基 因 下 游 引 物- TFFTAGCTAGCCACCATGAGGCTCACCGTGGGT转 铁 蛋 白 基 因 前 段 上 游 引 物 - 转 铁 蛋 白 基 因 前 段 下 游 引 物 Xho?-RACACTTGGTTCTCTCGAGGTG Xho?-FTCTCTCGAGAGAACCAAGTGT转 铁 蛋 白 基 因 后 段 上 游 引 物 TF-R ATAACGCGTTTAATGTTTGTGGAAAGTG 转 铁 蛋 白 基 因 后 段 下 游 引 物 高 ,代 时 也 比 CHO-DG44 短 。 由 于 我 们 克 隆 的 是 与CHO 细 胞 株 。优 势 的 细 胞 周 期 相 关 的 周 期 蛋 白 D1 基 因 ,因 此 推 测 这 些 基在 获 得 的 3 株 G418 筛 选 阳 性 的 细 胞 株 中 ,E5 和 因 在 CHO-S 中 的 表 达 水 平 应 该 比 在 CHO-DG44 中E8 在 无 血 清 培 养 基 中 的 生 长 速 率 与 培 养 第 7 d 达 高 ,因 而 更 容 易 进 行 PCR 扩 增 。 所 得 基 因 序 列 已 以到 序 列 号 EF524275在 GenBank中 注 册 。 中 国 仓 鼠 周的 细 胞 密 度 都 与 CHO-DG44 差 别 不 大 ,但 S6 则 明 显 期 蛋 白 D1 的 cDNA 序 列 与 小 鼠 的 同 源 性 为 94.6, 。较 CHO-DG44 具 有 更 快 的 生 长 速 率 ,并 且 可 以 在 培 2.2 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 在 G418阳 性 细 胞 中 的养 第 7 d达 到 更 高 的 细 胞 密 度 。 我 们 注 意 到 ,S6 中的 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 的 水 平 都 高 于 E5 和 E8, 提 示 2 种 蛋 白 的 较 高 表 达 水 平 是 赋 予 细 胞 显 著 的 表 达 如 图 4 所 示 ,与 未 转 染 pTID 的 CHO-DG44 相 生 比 ,3 个 阳 性 克 隆 株 中 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 都 获 长 优 势 所 必 需 的 。 得 了 明 显 表 达 ,而 且 细 胞 株 S6 中 2 种 蛋 白 的 表 达 水 我 们 通 过 对 CHO 细 胞 的 改 造 ,使 之 更 适 于 在 无 平 都 显 著 高 于 E5 和 E8。 血 清 培 养 基 中 悬 浮 培 养 ,并 且 较 改 造 之 前 具 有 生 2.3 表 达 转 铁 蛋 白/周 期 蛋 白 D1 的 CHO 细 胞 株 S6 长 在 无 血 清 培 养 基 中 较 CHO-DG44 更 具 生 长 优 势 优 势 。 因 此 ,当 我 们 将 改 造 后 的 CHO 细 胞 株 S6 应 用 CHO-DG44 是 适 于 在 无 血 清 培 养 基 CHO- S-SFM? 中 生 长 的 细 胞 株 ,因 此 我 们 检 测 了 CHO- DG44 及 3 株 转 染 pTID 并 表 达 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 的 细 胞 株 在 这 种 无 血 清 培 养 基 中 的 生 长 情 况 。 如 图 5 所 示 ,E5 和 E8 在 培 养 的 第 2~7 d ,其 细 胞 密 度 都 与 CHO-DG44 接 近 ,而 S6 在 培 养 的 前 3 d 细 胞 密 度 与 CHO-DG44 接 近 ,第 4~7 d细 胞 密 度 都 显 著 高 于 CHO-DG4,4P<0.05,。 图 3 以 不 同 细 胞 cDNA 为 模 板 扩 增 周 期 蛋 白 D1 基 因 M,DNA marker DL200,01,以 C HO-K1 细 胞 cDNA 为 模 板 , 讨 论3 2,以 CHO-DG44 细 胞 cDNA 为 模 板 ,3,以 CHO-S 细 胞 cDNA 为 模 板 无 血 清 悬 浮 培 养 因 具 有 培 养 基 成 分 相 对 明 确 、 产 品 下 游 处 理 工 序 简 单 、能 够 实 现 高 密 度 培 养 等 优 势 ,已 逐 步 取 代 贴 壁 培 养 成 为 CHO 细 胞 表 达 系 统 的 [7]工 业 化 应 用 趋 势 。 转 铁 蛋 白 可 以 协 助 细 胞 利 用 三 价 铁 离 子 ,并 且 自 身 也 是 一 种 生 长 因 子 ,是 工 业 化 大 规 模 细 胞 培 养 所 应 用 的 无 血 清 培 养 基 的 重 要 添 加 成 分 。 本 研 究 构 建 载 体 所 采 用 的 转 铁 蛋 白 cDNA 带 有 信 号 肽 序 列 ,因 此 可 被 细 胞 自 分 泌 到 培 养 基 中 ,从 而 减 少 培 养 基 中 转 铁 蛋 白 的 添 加 量 ,降 低 生 产 成 图 4 Western印 迹 检 测 3 个 阳 性 株 中 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 的 表 达 水 平细 胞 周 期 蛋 白 D1 是 一 种 作 用 于 G期 细 胞 的 周 本 。 1 [8]期 蛋 白 ,能 够 促 进 细 胞 进 入 S 期 。 在 我 们 的 前 期 研 究 中 发 现 ,周 期 蛋 白 D1 在 CHO-DG44 细 胞 中 高 表 达 能 够 有 效 增 加 培 养 体 系 中 S 期 细 胞 的 百 分 比 ,促 进 细 ++胞 生 长 。 我 们 尝 试 在 CHO-K1,dhfr,、CHO-S,dhfr, -和 CHO-DG4,4dhfr,等 3 种 常 见 CHO 细 胞 株 中 克 隆 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 基 因 ,结 果 在 3 株 细 胞 中 都 未 能 成 功 克 隆 转 铁 蛋 白 基 因 ,而 仅 在 CHO-S 中 克 隆 到 转 周 期 蛋 白 D1 基 因 ,换 言 之 ,在 CHODG44 中 转 铁 蛋 白 - 和 周 期 蛋 白 D1 基 因 都 没 有 得 到 成 功 克 隆 ,说 明 它 们 在 CHODG44 细 胞 中 的 表 达 水 平 很 低 。 因- 此 ,我 们 将 转 铁 蛋 白 和 周 期 蛋 白 D1 基 因 引 入 CHO-DG44 中 ,以 构 建 在 无 血 清 培 养 基 中 具 有 生 长 图 5 CHO-DG44 与 3 个 阳 性 克 隆 株 在 无 血 清 培 养 基 中 的 生 长 曲 线 [4]Zhao X, Guo J, Y u Y, et la. Overexpression of usrvivin 于 目 的 蛋 白 的 表 达 时 ,细 胞 将 更 易 于 培 养 ,并 对 培 and 养 cycn D1 in CHO ces confers apoptoss resstance and lillii基 中 额 外 添 加 转 铁 蛋 白 成 分 的 依 赖 性 降 低 ,这 为 en? 提 高 大 规 模 培 养 效 率 并 降 低 成 本 提 供 了 便 利 。 hances growtih n serum-free suspension culture[J]. [5] Biotechnol 参 考 文 献 Lett, 2011,33(7):12931300.- [6] Sunstrom N A, Sugiyono, Hunt S, et l . a Regulated [1]Rolf G W, Wolfgang N, Kristina K, et la. Appropriate autocrnei mam? growth of CH O cells[J]. Cytotechnol, 2000,34:39-46. [7]malian expression systems for bio pharmaceuticals[J]. 郭 俊 伟, 赵 兴 卉, 陈 薇, 等. 用 Touch-Up PCR 克 隆 中 国 仓 Drug [2] 鼠 Res, 1998,48:870888.- Survivin 基 因 及 其 序 列 分 析 [J]. 生 物 技 术 通 讯, [8]Bailey J E. Toward a c isence of metbaolic engineering[J]. [3] 2007,18(2): Sci? 209212.- ence, 1991,252:1668-1675. Parampa , skrdge , Smth , et a. Deveopement of lliAEiKiLll来 大 志, 翁 少 洁, 齐 连 权, 等. 通 过 高 表 达 Igf1/Bcl-2 或 se? 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