纳米材料应用于电流型癌胚抗原和人绒毛促性腺激素免疫传感器的研究

纳米材料应用于电流型癌胚抗原和人绒毛促性腺激素免疫传感器的研究 纳米材料应用于电流型癌胚抗原和人绒毛促性腺激素 免疫传感器的研究 独创性声明 学位目:纳苤挝粒廑用王塾速型癌匿擅厘塑厶缝垂堡性膣邀盍 ’ 鱼瘗佳盛墨鲍盟究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了 标注。 学位论文作者: 签字日期: 年々月万日 譬专 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密, 口保密期限至 年 月止。 学位论文作者鲐 导师张掳 艺砰 签字日期:?,/年么月矽曰 签字日期:砌年够月衫日洲矾 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? .? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? .纳米材料概述..纳米颗粒 ..纳米微管??.. ..复合纳米材料..:. .本论文研究思路? 第章基于普鲁士蓝纳米复合膜及纳米金修饰的癌胚抗原免疫传感器研究.实 验部分?. ..仪器和试剂.. ..?纳米复合物的制备? ..免疫电极的制备??一 ..方法??一 .结果与讨论 ..电极修饰过程的表征.. ..实验条件的优化..免疫传感器的响应特性..传感器的稳定性、选择性和重 现性 ..回收测定 .结论. 第章基于纳米金与二茂铁.功能化的壳聚糖复合物固定癌胚抗原的电流型免 疫 传感器研究 .实验部分..试剂和仪器?一 .. 半胱氨酸羧基二茂铁一壳聚糖复合物黼备..修饰电极的制备..检测方法??. .结果与讨论??一 ..电极修饰过程的电化学表征 ..免疫传感器的信号放大作用 ..实验条件优化..??.??.. 的研究?一??.??.??.??.??.??.??.??. ..实验条件的优化..免疫传感器的响应特性..免疫传感器的再生性 ..免疫传感器的稳定性和重现性.结论. 参考文献? 作者部分相关论文题录 致 谢? ? ? ?’ 两南大学硕十学伊论文 摘要 纳米材料应用于癌胚抗原和人绒毛促性腺激 素的电流型免疫传感器的研究 分析化学专业硕士研究生 吕萍 指导教师袁若教授 摘 要 电化学免疫传感器是将电化学分析方法与免疫学技术相结合而构建的一类生物传感器, 具有灵敏度高,分析速度快,操作简单,价格低廉及选择性好等优点,在生物分析、临床诊 断、环境监测等领域得到了广泛的应用。传感器的性能主要取决于生物活性物质的固定方法 和材料,电化学免疫传感器研究中的关键是如何将生物活性组分有效地固定在电极表面。纳 米材料具有比表面积大、吸附力强、生物相容性好等特性。本文将纳米金、纳米铂、碳纳米 管等纳米材料应用于免疫传感器,制备了一系列的电化学免疫传感器。并对免疫传感器的组 装过程进行了表征,以及研究了传感器的性能,结果表明,本文制备的传感器 在一定的程度 上改善了传感器的灵敏度和稳定性,并且本文采用制备方法简单,操作简便。 本论文主要从以下几方面开展研究工作: .基于普鲁士蓝纳米复合膜及纳米金修饰的癌胚抗原免疫传感器研究 利用和保护,并将具有空心管状结构的碳纳米管作为的载体,可提高作为 媒介体的固定量、稳定性并改善其电子的传递。将功能化的...复合膜修 饰于玻碳电极表面。再利用的氨基的结合作用和的静电作用结合具有大的比表面积、 较强的吸附力以及良好生物相容性等优点的纳米金。然后再利用纳米金吸附抗体,制得了一种 性能优良的电流型免疫传感器。该传感器制备方法简单、成本低、灵敏度高、稳定性好 以及线性范围宽等特点。 .基于纳米金与二茂铁.功能化的壳聚糖合物固定癌胚抗原的电流型免疫传感器研究 利用和将与交联,并进一步将交联到壳聚糖上,从而制 备出的功能化的壳聚糖复合物既具有氧化还原活性又有活性基团氨基和巯基,再利用活性基 团氨基和巯基与纳米金的键合作用将纳米金吸附到电极表面,最后利用纳米金吸附抗体,制 成以纳米金.功能化壳聚糖生物复合膜为基质的癌胚抗原免疫传感器。同时,利用代替 作为封闭剂放大响应信号。该免疫传感器对癌胚抗原的检测线性范围为.? /,检 测限为. /。 两南大学硕学位论文 摘要 .基于纳米铂与酶作为二抗标记物的电流型免疫传感器的研究 利用铂纳米粒子和辣根过氧化物酶作为信号放大标记物标记二抗,构建了夹心式电流型 免疫传感器。利用功能化的和纳米金作为固载基质来固定抗体,可增大电极的比表 面积,从而提高抗体的【司定量,并且改善电极表面和生物分子间的电子传输能力。采用双抗 体夹心免疫分析模式,将和纳米铂标记的二抗结合到电极上,即制得免疫传感器,该免 疫传感器利用铂纳米粒子和的同时对催化放大作用,有效放大电流响应信号,提 高免疫传感器的灵敏度。此外,该免疫传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性。 关键词:癌胚抗原免疫传感器纳米金多壁碳纳米管人绒毛膜 ?, , ,柚. , ., , , .?, , . ,, , ,. : . ? .硒 . ,.., 两南大学硕十学位论文 . , . . ‘ ,: , ‘. ? , , 豁 . . . / /. . 阳岬 ? . , . ?,?. , .,. ? : ;; ; ; 来的,用于监控和检测抗原和抗体之间反应的一类生物传感器。它主要由生物识 别元件感受器和换能器等元件组成。由于免疫传感器是以抗原一抗体为分子识 别元件,抗体与抗原的结合具有高度的亲和性和分子识别性,因此具有优良的选 择性。相对其它的生物传感技术,免疫传感器减少了非特异性干扰,提高了检测 的准确性。根据产生信号的不同,其检测设置有四种类型:电化学型、温度型、 光学型、和质量型。根据检测信号的产生来源即是否使用标记物,免疫传感器又 分为直接型和间接型的免疫传感器。 ..免疫传感器工作原理 免疫传感器的工作原理属于固相免疫测试法,即把抗体或抗原固定在固相支 持物表面,通过固定化的抗体或抗原识别待测样品中与它相对应的抗体或抗 原并 结合形成稳定的免疫复合物来实现对待测样品特定抗原或抗体的检测。利用抗原 一抗体的高度特异反应的特性,将反应时所产生的一系列化学、电学等响应,通 过换能器转变成可检测的信号,其信号大小与待测物的含量存在定量关系,从而 实现对待测物质的定量检测【】。免疫传感器不但能定量检测,由于传感与换能同步 进行,能实时监测到传感器表面的抗原一抗体反应,还能够对整个免疫反应过程的 动态变化进行实时监测,有利于对免疫反应进行动力学分析。 ..电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是免疫传感器中种类最多的一个分支,相比其它免疫传感 器,它的研究最早,同时发展也较为成熟,它将免疫学技术与电化学分析方法相 结合,用于测量免疫反应前后引起的电化学信号变化。随着各种电分析技术的发 展,如电化学流动注射分析、循环伏安法、阳极溶出伏安法、液相色谱电化学检 测等方法,电化学免疫传感器的灵敏度得到了大大提高。除具有生物传感器快速、 灵敏、选择性高、操作简便等特点外,电化学免疫传感器还具有构制敏感电极方 法灵活,体系容易集成化、微型化,测定不受样品颜色、浊度的影响,可以在线关系。其测定原理包括两种,直接测定法非标记和间接测定法标记,直 接测定法是通过免疫反应前后信号电流的变化来对待测物质进行定量检测。间接 测定法则需要采用标记物,抗原抗体的结合反应通过标记有标记物的免疫复合物 间接表现出来,通过对标记物的间接测定,实现对被测抗原或抗体的定量检测。 常用的标记物有酶和电活性物质。根据抗原抗体特异识别方式,间接测定法主要 有夹心法和竞争法两种。前者是在电极上固定抗体,加入含有抗原的待测样品, 与抗体结合,再加入酶标记抗体与抗原结合,形成夹心结构,催化氧化还原反应 产生电流值变化,利用酶的放大作用,可获得极高的灵敏度。后者是用未标记的 抗原与一定量的酶标记抗原竞争固定在电极上的抗体所提供的结合点。催化氧化 还原反应,引起电流变化,从而可测得样品中抗原浓度。 .纳米材料概述 年在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学技术会议,正式标志着纳 米科学的诞生【们。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由 范围内, 它们作为基本单元构成的材料。一般来说,纳米材料的尺寸在. 具有四大效应:表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效。这是 因为纳米材料的尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区 域,这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统【】。纳米材料由于其结 构的特殊决定了纳米材料出现许多不同于传统材料的特性,如:大的比表面积、 正或负的电荷环境、较高的表面能量、优异的电子传输性、较强的吸附能力、 良好的生物相容性等。利用纳米材料的这些特殊性能可以研制出响应速度快、灵 敏度高、选择性好的各种不同用途的免疫传感器。使纳米材料成为应用于免疫传 感器方面最有前途的材料之一。 ..纳米颗粒 两南入学硕七学伊论文 第章 纳米颗粒由于具有比表面积大、生物亲和性高、吸附能力强、催化效率高、 表面反应活性高、稳定性好等优异特性,在传感器的研究中发挥着重要作用。 常 ,其中,金纳米粒子是研究的 见的金属纳米粒子有、、洫、和等【。 较早较为成熟的纳米颗粒。 由于纳米颗粒具有极佳的比表面积,可用于生物分子的固定,能增大其固定 量,从而增强响应信号;同时它具有一定的生物相容性,能使生物分子较稳定 地 存在。等?】利用纳米金的良好的吸附能力,构建了电流型甲胎蛋白免疫传感 器, 该传感器的性能良好,其检出限为. /。详见图.。。?。 一 礅璐疆羹 攀 麝戥‘群蠹髦 ????? 一‘ ?。? 搿噍 图.传感器的修饰过程 纳米颗粒不仅可以作为一种基质用于生物分子的固定,而且可以用于生物分 子的标记,从而实现信号的检测和放大。等构建了一个纳米金作为标记物 的电化学信号放大的免疫传感器,该电极的线性范围. /,检测限为 /图.。 汹等匿半巨墨睾隧? 瘢敢鼙 童匿眭嚣鞋掘 坩咻咐咐基 留卜?荆,? 捌蝴 砜 ‖ ‖ , 彻。?爸二??。 弼篓删?嗍 事???》??, 图.免疫传感器的制备过程 ..纳米微管两南大学硕十学位论文 第章 纳米微管在提高分子的固定效率的同时又保持生物分子的活性,而利用其尺 寸更小、比表面积更大的独特的纳米微结构,可以进一步改善生物传感器的 性能。 关于纳米微管的研究报道很多,其中,以碳纳米管的研究最热。碳纳米管具有 大 的比表面积,孔径大小可控制,独特的电子特性金属或半导体性质,是制作生 物传感器的理想材料。 等分别利用碳纳米管作为电极的固载基质和二抗的标记物,构建了高灵 敏的免疫传感器如图.。将碳纳米管作为固载基质,可以将大量抗体固定在 电极表面,而将碳纳米管作为标记物,可以吸附大量的酶于二抗上,极大地增强 传感器的响应信号,将该免疫传感器用于的检测,其检测限低至 /。 ‘‘“铂嘲嘲?嘛耐劳稍 懈??盼矗翻嘲疗钿,喊 图.免疫电极的制备过程示意图 ..复合纳米材料 随着对纳米材料的研究不断深入,由两种或两种以上的材料,通过各种工艺 手段组合而成的新型复合纳米材料,成为材料科学领域研究的一个热点,引起人 们的广泛关注。这种新型复合纳米材料具有独特的力学、热学、光学和电学性质, 由于其良好的稳定性、独特的生物亲和性,以及其表面易基团功能化等特点,被 广泛地应用于敏感分子的固定、信号的检测和放大【。。 】等制备了硒化镉量子点与碳纳米管的复合物。首先将带正电荷的 修饰到碳纳米管表面,再通过静电吸附作用将预先制备好的负电荷的硒化镉量子 点 固载到碳纳米管表面,从而形成为 ?的复合 物。将该纳米复合材料作为电极的固载基质,制备了用于检测的免疫传感器。 该传感器的线性响应范围为. /,检出限为. /。具体过程见 图.。 图.为 的制备过程,为免疫传感器的构建过程 等【首先制备了金/碳复合纳米微球,如图.,首先在制备好碳纳米球 表面的修饰上,利用带正电荷的将纳米金溶胶修饰到碳纳米球表面, 从而制得金/碳复合纳米微球。利用金/碳复合纳米球标记二抗分子,该复合 材料 具有较大的比表面积,可使电极上结合的量大大增加,极大提高该免疫传感 器灵敏度,将制得的免疫传感器对进行检测,其检测限低至. /。 薹 攀 ?删删??删? 斟鞋 髫隧髭睡髭匿匪鬣 件?“. 隧甏嚣髦垂 隆 图.基于纳米金功能化碳纳米微球的免疫传感器制备过程示意图 攀豢等一 两南大学硕十学位论文 第章 .本论文研究思路 利用和保护的修饰具有独特空心结构的多壁碳纳米管 ,得到普鲁士蓝.功能化的多壁碳纳米管复合物..。 然后将该复合物用于修饰电极,再吸附纳米金,进一步利用纳米金固定抗体,以 癌胚抗原为分析模型,构建免疫传感器。 利用二茂铁.功能化壳聚糖复合物和纳米金固定抗体,同时用 代替作为封闭剂来放大响应信号,制备电流型癌胚抗原免疫传感器。 采用双抗体夹心分析模式,来制备信号放大的电流型免疫传感器。利 用功能化的和纳米金作为固载基质来固定抗体,增大电极的比表面积,从 而提高抗体的固定量,并改善电极表面和生物分子间的电子传输能力。铂纳米粒 子与对的协同催化放大作用,可以有效放大电流响应信号,从而提高免 疫传感器的灵敏度。 碳纳米管于年被】发现以来,因其独特的物理、力学、化学及电子特性, 及其潜在的应用前景而倍受人们的关注,成为世界范围内的研究热点之一。其独特的空 心管状螺旋结构使碳纳米管既具有金属导电性,也具有半导体性能。由于碳纳米管直径 小、表面能高、原子配位不足的表面效应,使其表面原子活性高,易与周围的其它物质 发生电传递作用。利用碳纳米管独特的物理特性,可以在其表面修饰多种无机、有机及 生物分子来制备生物传感器,】等将壳聚糖和纳米铂修饰在碳纳米管表面制 得纳米 复合物,构建过氧化氢传感器,使得响应电流显著增大,同时稳定性得到提高。【 等将修饰到多壁碳纳米管上,将复合物固定到电极表面,获得了良好的电化学响应。 普鲁士蓝纳米粒子,作为电子媒介体由于其具有大的比表面积,高的电催化活 性等特点,在生物传感器上起着重要的作用【。但由于不稳定,易于从电极表面脱 落?,因此常用功能化的有机聚合物将其保护起来,如:聚二烯丙基二甲基氯化铵 、壳聚糖,近来,我们研究小组采用和共同保护】,制 得的传感器,其性能较单一保护的传感器性能更好。因此,本文在此基础上制备了由 和共同保护普鲁士蓝.多壁碳纳米管纳米复合膜.?.。将该 复合膜修饰到电极表面,再利用的氨基和的正电荷吸附带负电荷的金纳米粒 子,在增强的氧化还原电化学活性的同时为抗体蛋白的固载提供具有更多结合位点、 具有更高表面能和生物相容性的金纳米层。然后利用纳米金层固定抗体,制得电流型癌 胚抗原免疫传感器。该传感器制备简单,具有良好的稳定性和较高的灵敏度。 .实验部分 ..仪器和试剂 循环伏安测量采用 电化学工作站上海仪器公司;采用三电极体系 工作电极,铂丝为辅助电极,饱和甘汞电极为参比电极;超声采用 ~超声清洗仪德国 地虬公司;质量的称量采用 .电子天平瑞士公司;电极表面的微观结构表征采用扫描电子显 微镜,..日本日立公司。 癌胚抗原及癌胚抗体.郑州博赛生物技术研究所;多壁碳纳米管 两南大学硕十学伊论文 第章 以引入羧基 ,中国科学院成都有机化学有限公司,使用前先用浓硝酸回流 。柠檬酸钠,壳聚糖,:,, /,?%,聚二烯丙基二甲基氯 化铵,;,, /,%水溶液,牛血清白蛋刍和氯金酸美 . / / ,. 国公司,不同值的磷酸缓冲溶液 / 和. 还原. 制得, 配制;纳米金是由柠檬酸钠在 尺寸约为眦【。其它试剂均为分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水。 .. ..纳米复合物的制备 . 参照文献并做少量修饰得到纳米复合物【,在搅拌的情况下,缓慢的将 / 包含. /的滴入到 ?,.%,和. %的溶液中。持续搅拌,得到深蓝色的混合液,离心,然后用%醋酸和水至少洗 次后,将收集的固体与适量的水混合于超声仪中分散。然后加入一定量纯化 过的 使其浓度为. /,再置于超声仪中分散即得纳米复合物。 ..免疫电极的制备 将直径为 悬浊液抛光至镜面后,冲洗 玻碳电极分别经.、. 除去抛光粉后,在蒸馏水中超声洗净,然后依次用蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水 超声 , 清洗后,.自然晾干待用。 首先将一定量...复合物滴加到电极表面,于室温下晾干,然后 于纳米金溶液,浸泡 ,清洗晾干后,再置于.溶液中,于 下浸泡过夜,用 .%溶液来封闭电极上可能存在的非特异性结合位点,封闭 。冲洗晾干,将制 备好的免疫电极置于 的冰箱中保存待用。图.为免疫电极制备过程 国???????, 暖 够 ????????????????????卜 ????????????????? 喹曦 图.免疫电极的制备过程 ..检测方法 第章 两南大学硕十学位论文 电极制备过程的表征及对的检测采用循环伏安。该方法采用三电极体系, 修饰电极为工作电极,铂丝电极为辅助电极,甘汞电极为参比电极。整个实验 的的 / 电位范围为一.~.,扫描速率为 /。测试底液为. .溶液。 .结果与讨论 ..电极修饰过程的表征 ... 表征 图. 电极修饰过程表征图图:/;图: /../;图://、?../ 免疫传感器制备过程中电极表面不同组分的微观结构采用扫描电子显微镜 进 行表征图.。其中图.为表面修饰...复合膜的图,从 图中可以清晰的看到大量的的管状结构,复合膜成功的修饰于玻碳电极表面。图. 为/.../电极的图,可以清楚的看到金纳米粒子均匀的 分散在碳纳米管表面,说明纳米金被很好的吸附到复合膜上。图.为 .//.?./电极的图,其表面形态发生了明显变 化,大分子的云片状覆盖于修饰电极表面,表明抗体已成功地被固载于修饰电极表面。 ...电化学表征 电极的修饰过程的电化学性质采用循环伏安法进行表征。图.中,曲线为修饰上 ?.复合物后的循环伏安图,可明显观察到一对氧化还原峰,这是由 于是良好的电子媒介体。当通过的氨基的结合作用和的静电作用吸附到 电极表面,由于纳米金具有良好的电子传输能力加速了电子的传递,使得氧化还原峰电 流升高曲线。曲线,分别为抗体和被修饰在电极上后的循环伏安图,氧化还原 峰电流值较曲线有明显的降低,这是由于两者都是大分子非导电物质,阻碍了电子的 传递。曲线为免疫电极孵育 后的循环伏安图,由于抗原抗体结合形成的 / 复合物阻碍了电子的传递,氧化还原峰电流值进一步降低。 图.不同修饰电极的循环伏安图 为了证明碳纳米管的作用,对比和...复合物电 极的氧化还原峰。从图.可看出,使用...膜修饰电极曲线 明显比膜修饰电极曲线的氧化还原电流大得多。这表明由于碳纳 米管扩大了电极的比表面积和促进了电子传输能力。 图.膜修饰电极的表征膜修饰电极的表征 对不同扫描速度下免疫电极的循环伏安曲线进行了表征,图.是免疫电极在. /磷酸缓冲溶液 .中,从里到外扫速分别为的循环伏安图。从图中可以看出, 随着扫描速度的不断增加,氧化还原峰电流值明显增大,从插图可以看出,在 /范围内,氧化还原峰电流值与扫描速度呈现正比,表明电极氧化还原反应受 表面吸 图.电极在不同扫速下的循环伏安图,插图:峰电流与扫速的关系曲线 ..实验条件的优化 测试底液的免疫传感器的性能有很大影响。本实验用循环伏安法考察在 ..的范围内对循环伏安峰电流的影响。从图.可以看出,.时峰电流值最 达到最大,因此,.的缓冲液中被选定为进一步实验的测试底液。 图. 对免疫传感器的影响 本实验还研究了孵育时间对免疫传感器响应的影响。如图.所示,随着孵育时 间的 增加,氧化峰电流值逐渐下降,当孵育时间到达 后,曲线开始趋于平缓,即此 时 抗原.抗体免疫反应已基本达到平衡,故本实验选择 为免疫电极的最佳孵育时间。两南大学硕学伊论文 第章 图.孵育时间对免疫传感器的影响 ..免疫传感器的响应特性 // 图.峰电流与浓度的关系曲线 将制备的癌胚抗原免疫传感器分别孵育不同浓度的后,在优化的实验条件下, .的缓冲溶液中进行循环伏安检测,得到氧化峰电流随浓度变化的关系 于 图。如图.所示,免疫电极的峰电流与的浓度在.. /和.~ / 的范围内呈良好的线性关系,线性方程分别为欺衅./..和欺四 . //。与其 /一.,相关系数分别为.和.,检测限为. 他一些方法制备的癌胚抗原免疫传感器相比【,本实验制备的传感器具有更高的灵敏 度、更宽的线性范围和更低的检出限,其主要归功于以下两点: 碳纳米管的使用, 增大了电极的比表面积,增加了普鲁士蓝和纳米金在电极表面的固定量; 普鲁士 两南大学硕十学伊论文 第苹 蓝、碳纳米管和纳米金在协同作用下促进了电子的传递。 ..传感器的稳定性、选择性和重现性 研究不同物质对电极响应的影响。有两组测试液包括: 酌蛳焦芦液, 包括 /甲胎蛋白, /牛血清蛋白, / , /半胱氨 酸和 / 溶液。试验结果表明,浸泡在中的 / 物质的 免疫传感器和浸泡前相比响应稍有变化,相对标准偏差小于.%,说明该免疫 传感器具 有良好的选择性。 在 溶液进行孵育中,将制免疫电极于相同条件下重复测定次,次峰 / 电流值分别为..,.,一.,一.,一. /。次的相对标准偏差为.%,说 明传感器重现性良好。 本实验分别从连续扫描和长时间贮藏两个方面考察了电极的稳定性。将免疫 电 极放置于缓冲溶液连续扫描圈,其电流响应下降了.%。将电极悬置于缓冲液 上方 于 下放置天,其响应电流为初始响应电流的.%,表明该传感器有较好的稳定 性。 ..回收测定 / 将. .作为稀释液,把配制成不同浓度的待测品,将该免疫 电极置于样品溶液中孵育 后,按实验方法测量电流值,然后通过回归方程求出 样品的浓度,结果如表.,其回收率在...%,因此本文制备的免疫传感器在临 床上有潜在的应用价值。 表. 免疫传感器的回收结果 .结论 本实验制各一种新型、简单的检测的方法,即把抗体固定在纳米金和 ??.复合物修饰的玻碳电极上。该方法有以下几个突出优点:在 由于其具有的高灵敏度,低成本,便于携带等特点,而被广泛关注。因此,大量 的电化学免疫传感器被广泛的应用于肿瘤标志物的检测【。?。 由于大部分免疫蛋白分析物为非电活性物质,因此,电化学免疫传感器需要 使用氧化还原活性物质。一些文献报道了将二茂铁及其衍生物作为氧化还原探针 固定到电极表面的方法,如:利用活性蛋白物质【或惰性蛋白【】与二茂铁直接键 和。但这些方法存在不足,与活性蛋白的共价键和会使二茂铁的催化活性丧失, 而与惰性蛋白的结合,制得的传感器灵敏度较低。 壳聚糖由于具有良好的成膜能力,优良的生物相容性,无毒性,被广泛的用 作免疫传感器的固定生物分子的材料【】。但由于相对较差的导电性,通常将 壳聚糖和金属纳米粒子、碳纳米管或氧化还原活性物质相结合【‘引,来增强壳聚 糖膜的传导性能。 因此,本文制备了.半胱氨酸羧基二茂铁.壳聚糖复合膜,该 复合膜不仅具有有效的氧化还原活性,还具有良好的成膜能力,从而可以很好的 固定在电极表面,避免的从电极表面脱落。利用复合膜的活性基团进一步固定纳 米金,再利用纳米金吸附抗体。为了进一步提高免疫传感器的灵敏度,本文使用 葡萄糖氧化酶代替牛血清白蛋白来封闭免疫电极上的非特异性吸附 位点,在进行测定时,利用对葡萄糖的催化作用,放大响应电流信号,提 高灵敏度,从而制得一种性能优良的新型无标记免疫传感器。将制备的传感器用 于癌胚抗原的测定,实验表明,该传感器具有灵敏度高、检测范围宽、检测限低 等特点。 .实验部分 , ..试剂和仪器 癌胚抗原及抗体郑州博赛生物技术研究所;壳聚糖、 氯金酸、柠檬酸三钠、牛血清蛋白、羧基二茂铁.、.半胱氨酸、葡萄两南人 学硕十学伊论文 第章 糖氧化酶公司;葡萄糖重庆化学试剂公司;.羟基琥珀酰亚胺、 .乙基..二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐上海有限公司。 其它试剂均为分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水。循环伏安测量差分脉冲 伏安 测量采用 电化学工作站上海辰华仪器公司,其他实验仪器与第章中 仪器相同。 .. .半胱氨酸羧基二茂铁.壳聚糖复合物的制备 首先,用%醋酸将.配制成浓度为 /溶液,然后加入一定量 的、和半胱氨酸,充分搅拌 ,制的.半胱氨酸复合材料。然后, 用%醋酸配制质量分数为%的溶液,最后将制的.半胱氨酸复合材料加入 溶液中,同时加入一定量的和,搅拌 ,制得复合材料。 制备的复合材料 的冰箱保存,备用。 ..修饰电极的制备 玻碳电极电极的预处理方法见第章,将止的复合物滴加于已 经处理干净的电极表面,于室温下晾干。然后依次于纳米金和癌胚抗原于 浸 泡 。最后,将上步制好的电极浸在质量分数为.%溶液中 以封闭 非特异性结合位点,清洗后晾干。将制备好的电极悬于溶液于 的冰箱 保存,待用。免疫传感器制备的具体过程如图.。 :三囝. 簧 参 俩 图.免疫电极的组装过程 ..检测方法 / 采用循环伏案法和差分脉冲伏安法,整个实验在. .,含. /葡萄糖中进行,电位区间为一.~. ,扫描速率 /。 将免疫传感器发生免疫反应前测得的稳定的峰电流记为乃,当免疫电极孵育 抗原, 完成免疫反应后测得的峰电流记为,则免疫电极的响应电流变化?为: 一~ 两南大学硕十学位论文 第章 .结果与讨论 ..电极修饰过程的电化学表征 图.是电极每一步修饰过程的图。曲线为裸玻碳电极的循环伏安图。与 曲线相比,曲线中出现一对明显的氧化还原峰,这是因为具有氧化还原活性 的 复合材料被修饰到电极表面,当纳米金被吸附到电极表面后,氧化还原 峰电流值明显升高曲线,这是由于纳米金具有良好的电子传输能力,有助于 电子传递。然而当抗体以及作为封闭剂的固定到电极上后曲线和,氧化 还原峰电流均下降,这是因为抗体和都是生物大分子,均不导电,它在电极 表面占据了部分扩散通道,阻碍电子传递。这同时也表明抗体和成功地被固 载在电极上。 图.电极制备过程的循环伏安表征 图.不同扫速下的循环伏安图,从里到外分别为,,,,,,,,,, / 和 两南大学硕十学位论文 第章 / 图.是免疫电极在. .中,在一.~. 电位范围内, 以不同扫描速度进行测定的循环伏安图。如图所示,在. /范围内,氧化 还原峰电流值随着扫描速度的不断增加而明显增大,从插图中可以看出,电 流值 与扫描速度的平方根成正比,符合兰德雷斯~谢夫契克方程式【而】:厶.× . 也陀/,说明电极氧化还原反应受扩散控制。 ..免疫传感器的信号放大作用 /葡 图.免疫电极在加入葡萄糖前后的循环伏安图:测试底液不含葡萄糖含. 萄糖,含. 葡萄糖,含. /葡萄糖 图.是免疫电极在加入葡萄糖前后的循环伏安图。从图中可以看出,加入 葡萄糖之前,循环伏安图表现出可逆性良好的氧化还原峰曲线,当向测试底 液 中加入葡萄糖后,还原峰电流减小而氧化峰电流增大曲线,,,从曲线,可 以看出,随着葡萄糖浓度的增加,其催化效果加大,这说明采用催化放大 响应信号的方法简单可行。 ..实验条件优化 ...测试底液酸度的优化 一方面能影响抗原和抗体的活性,不适宜会导致蛋白质的变性。另 一方面对亲和性的影响。本实验用考察了在...的范围内对免疫电 前后的电 极的影响。图.给出了在不同下,免疫电极在孵育 / 流变化情况,从图中可以看出,当《.时,电流变化值达到最大,因此,本 实验选择测试底液的为.。 两南大学硕十学伊论文 第章 图. 对免疫传感器的影响 ...孵育时间的优化 / 图.孵育时间对免疫传感器的影响 免疫反应完成的程度还与反应时间有关。将制备好的免疫电极放入 / / 溶液中孵育不同时间,用于. .中测定其响应电流的 变化情况,从图.中可以看出,电流的变化随着孵育时间的延长而增大,并在 后趋于平衡,即使延长时间其响应电流无明显变化,因此,将 作为本 实验的孵育时间。 ...葡萄糖浓度的优化 免疫传感器的响应与葡萄糖的浓度有关。由图.可知电极随着葡萄糖浓度 的增加氧化峰电流的变化值明显增大,当葡萄糖浓度为. /时反应趋于平 衡。故本实验选用. 为葡萄糖最佳浓度。 两南大学硕学伊论文 第章 图.葡萄糖浓度对免疫传感器的影响 ..免疫传感器的响应特性 // 图.峰电流与抗原浓度的关系曲线,插图为免疫电极孵育不同浓度的溶液后 的图 本实验用在最优的实验条件下,测定了免疫电极对的响应电流变 化的标准曲线。在图.中,为本实验所制备的免疫传感器,浓度在. /范围内与峰电流呈良好的线性关系。线性方程为欺雌./ .,相关系数为.,检测限为. /。为采用作为封闭剂所 制备的免疫传感器,其线性范围为. /,线性方程为欺吣./ .,相关系数为.,检测限为. 。对比用作为封闭剂制得 的免疫传感器,该免疫传感器具有更高的灵敏度、更宽的线性范围和更低的 检测 限,这主要归功于对葡萄糖的催化放大作用。两南大学硕十学伊论文 第章 ..传感器的稳定性、选择性和重现性 将免疫传感器分别置于下面两种溶液中, 标准溶液, / 含有相同浓度干扰物质的 /的溶液。干扰物质包括,,, ,.,?,多巴胺和抗坏血酸。从实验结果来看,两组响 应电流值差距不大,说明该传感器具有良好的选择性。 将免疫电极连续扫描圈后,电流响应值比初始值下降.%。另一方面,将 . 电极于 下悬于 上方,‘期间每天测试一次,天后,峰电流值为初 始电流值的.%,表明该传感器有较好的稳定性。 六支修饰好的电极在 溶液中孵育来研究其再现性。这一组六个 / 不同的电极相对标准偏差..为.%。这表明免疫传感器有着良好的重现性。 .结论 信号放大和噪音减小构建高灵敏度生物传感器的重要因素。本文通过 对葡萄糖的催化作用构建了信号放大的电流型免疫传感器。它具有以下几点优 势:第一,复合材料具有良好的稳定性,生物相容性和成膜能力,可 以很好的固定在电极表面,以及避免氧化还原探针从电极表面脱落;第二,通过复 合材料巯基和氨基键和作用来固定的纳米金,提高了电极的稳定性,并且纳米金 在固定抗体的同时能保证生物分子的生物活性;第三,利用代替作为 封闭剂,利用对葡萄糖的催化作用,较大的增加了响应电流,从而提高灵 敏度。 西南大学硕十学论文 第章 第章基于纳米铂与酶作为二抗标记物的电流型免疫传感 器的研究 酶联免疫分析是以生物酶为标记的免疫分析方法,它将酶的高效催化放大作 用与抗原和抗体反应的特异性相结合,既保持了酶的催化放大的敏感性,又保持 了抗原和抗体反应的特异性,因而极大地提高了免疫分析的灵敏度。双抗体夹心 法是酶联免疫分析使用较多的一种分析方法。在免疫分析中,用于标记的酶一般 是辣根过氧化物酶,因为它在合适的电子媒介的辅助下可以检测过氧化氢的 电催化还原信号。纳米尺寸的金属纳米粒子具有大的比表面积,好的生物相容性, 适用于各种生物活性分子的表面固载,同时能有效的加速电子传输速率,因此它 对许多分子具有良好的催化作用【。纳米铂由于其优越的催化性能而受到人们 广泛的关注】。 本实验利用铂纳米粒子和作为信号放大标记物标记二抗,构建了夹心式 电流型免疫传感器。利用功能化的和纳米金作为固载基质来固定抗体,可 增大电极的比表面积,从而提高抗体的固定量,并且改善电极表面和生物分子间 的电子传输能力。采用双抗体夹心免疫分析模式,将和纳米铂标记的二抗结 合到电极上,最口制得免疫传感器,该免疫传感器利用铂纳米粒子和同时对 催化放大作用,有效放大电流响应信号,提高免疫传感器的灵敏度。此外,该免 疫传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性。 .实验部分 ..试剂与仪器 。 。 人绒毛膜促性腺激素抗体及抗原均购置于郑州公司,壳聚糖%脱 乙酰度,牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶、对苯二酚、氯金 / / 酸、氯铂酸、柠檬酸、均购于美国公司。由. 和. 以及. /支持电解质配制的磷酸盐缓冲溶液。其它 试剂均分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水。实验仪器与第章中仪器相同。 .. .的制备 .% 参照文献【,硎并做少量修改制备..复合物,首先,将 ,在搅拌下加入. ,加热至 %新制的溶液,溶液由无色 变为黑色,持续加热搅拌 ,冷却至室温,即制的纳米铂。然后取 纳米铂溶 液,加入柠檬酸钠溶液,碳酸钾,搅拌,再加入 /的,,混合溶液 持续搅拌 后,于, 离 ,并用和水洗次,最后将得到 在西南大学硕十学位论文 第章 曼笪曼曼寡量曼曼曼曼量曼喜罡量曼量量量曼曼量曹量皇曼量曼暑量曼量 曼皇曼曼量舅量量曼置量量量曼曼曼量量曼篁邑曼曼鼍量量量童皇曼置量量皇 量曼皇曼曼皇曼 的固体,用 含%分散,即制得冲..复合物。 ..免疫传感器的制备 在处理好的玻碳电极表面,滴加一定量的功能化的,于室温下晾干, 洗净后将电极浸入纳米金溶液中约 ,,随后置于?溶液中于 下浸泡过 夜,最后将此电极在.%的溶液中于室温下浸泡 ,以封闭电极上可能存在 的非特异性活性位点,用和蒸馏水冲洗干净,即得免疫电极。免疫电极的修饰 过程如图.所示。 图.免疫传感器的组装过程 ..双抗体夹心法测定过程 具体免疫测定过程如下:制备好的修饰电极置于钡试液中孵育 ,用 清洗后,再与纳米铂和标记的而抗结合,用清洗。电极制备过程的循环伏 安表征在含 / / /并. 的 .溶液中进行,在免 疫反应完成后,于含有. /对苯二酚的. / .测试底液 中测定,测定完后取出,向上述测试底液中加入. /的,然后再测定。 通过两次测定还原峰的?睐对进行定量分析。扫描速率均为 /。 .结果与讨论 ..传感器制备过程的电化学特性 图.给出了免疫传感器在不同修饰过程的图。与裸电极曲线相比 较,当电极修饰后,由于促进电子的传输因此氧化还原峰电流明 显增大曲线;而当纳米金吸附于电极表面的图,由于纳米金良好的导电作两 南人学硕十学位论文 第章 用,峰电流上升曲线;当固定上.后,峰电流明显减小曲线,说明抗 体成功固定到电极表面。用封闭电极表面可能存在的非特异性活性位点后, 峰电流进一步减小曲线。孵育抗原后,生成的抗原抗体复合物导致峰电流进 一 步减小曲线。 图.电极不同修饰过程的循环伏安图 图.免疫传感器的循环伏安扫速图 / 图.是免疫电极在. .溶液中于不同扫描速度的循环伏 安图。从图中可以看出,在至 /范围内,峰电流值与与扫描速度成线 性关系,这说明了该氧化还原反应是受表面吸附控制的。 ..免疫电极的信号放大作用. . . . . . . . . 吣. .. 图.不同电极入前后的图,:测试底液不含;:测试底液含; 修饰电极;.修饰电极 ..实验条件的优化 图. 的优化 实验研究了缓冲溶液的在..范围内对免疫传感器响应的影响。结果如 图.所示,当的值为.时,免疫传感器的电流响应信号最大,因此本实验 选择测试底液的为.。两南大学硕十学伊论文 第章 本实验研究了浓度对免疫传感器响应的影响,图.为在不同浓度下, 测试底液加入前后峰电流变化情况,从图中可以看出,当的浓度达到 /。 /,峰电流的变化达到最大,所以本实验选择的浓度为 本实验还研究了浓度对免疫传感器电流响应的影响,将传感器孵育 后,在加入了不同浓度的测试底液中进行测定,测试底液为含有 . / /对苯二酚的. .溶液。从图.中可以看出,浓度 达. /时,电流响应信号变化不大,所以本实验选用的浓度为. /.。 酬“? 图. 图. 的浓度优化 的浓度优化 ..免疫传感器的响应特性 “/ 图.峰电流与抗原浓度的关系图 将制备好的免疫传感器在不同浓度的溶液中进行孵育,完成夹心程序后, 清洗。在上述优化的实验条件下,通过考察加入前后的峰电流变化,如两南火 学硕七学仲论文 第章 图.所示。以?尉浓度作图,免疫传感器的响应电流变化值随抗原浓度的增 加而逐渐增大,并在.~ /范围内呈良好的线性响应图.插图。线性 /。 响应方程为:./.,相关系数为.,检测限为. ..免疫传感器的再生性 传感器的再生性能是评价免疫传感器一个重要指标。本实验对制备的免疫传 / 感器的再生性进行了研究,利用. 溶液以及 /的尿素作为解 离剂,来解离抗原和抗体的复合物。分别测定孵育. /和. /的 后免疫传感器的响应,实验发现,免疫传感器经过再生次,其变异系数分别为 .%和.%,说明电极具有良好的再生性。 ..免疫传感器的稳定性和重现性 将免疫传感器在测试溶液中连续循环伏安扫描圈后,最后一圈的还原峰 电流值为初始值的.%,不用时,把免疫传感器悬于溶液上方,保存在 的冰箱中。经过天后,电极的响应电流仍达到初始值的.%,实验结果表明, 该传感器具有良好的稳定性。 将五支修饰电极分别与 抗原孵育后,重复测定五次,其值的 / 相对标准偏差...%,说明该免疫传感器具有良好的重现性。 .结论 本文利用功能化的和纳米金作为固载基质,用.标记二抗构 建了信号放大的电流型免疫传感器。该方法的优点在于:第一,利用功能化的 和纳米金作为固载基质来固定抗体,可增大电极的比表面积,从而提高 抗体的固定量,并且改善电极表面和生物分子间的电子传输能力;第二,利用 铂 纳米粒子和对协同催化放大作用,显著的增大电流响应信号,提高免 疫传感器的灵敏度。两南大学硕十学位论文 参考文献 参考文献 【】鞠幌先.电分析化学与生物传感技术,,:. 【】温志立,汪世平,沈国励.免疫传感器的发展概述.生物医学工程学杂 志,,: . 】霍群,蔡豪斌.电化学免疫传感器.临床检验杂志,,:.. 【】钟桐生,刘国东,沈国励.电化学免疫传感器研究进展.化学传感器,,:.. 【】 , , , . :? , ,:?.. 【】刘吉平,廖莉玲,无机纳米材料,,:. ? 】李理,杨丰科.纳米颗粒复合陶瓷材料.材料导报,,:.. , , , 【】 . : ,,: / , , 【】 . / . ,,:?. 【】 , , , , , /, // . ,: . ,& 【】 ,/ .:. 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