凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在 中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义

凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在 中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 凋亡抑制蛋白Livin及Survivin在 中耳胆脂瘤上皮中 的表达及意义 暨南大学硕士位论文 凋亡抑制蛋白 Livin 及 Survivin 在 中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 硕士研究生杨 宁 指导教师蒋立新教授 摘要 背景与目的 胆脂瘤是由于鼓膜、外耳道的复层鳞状上皮经穿孔向中耳腔生长堆积成团 块,其外层由纤维组织包围,内含脱落坏死上皮、角化物和胆固醇结晶,其形成 的确切机制尚不清楚,目前主要有袋状内陷学说和上皮移入学说两种。近 10 年 来,各种细胞因子在胆脂瘤中耳炎发病的始动与发展过程中的作用受到越来越多 的关注。昀近,又有研究者认为胆脂瘤中耳炎的发病过程是一个细胞增殖与凋亡 失衡的过程,许多文献相继在胆脂瘤中耳炎中发现了细胞凋亡过程的异常, 并与多种细胞因子异常表达有关。通过研究凋亡抑制蛋白 Livin及 Survivin 在胆 脂瘤上皮与正常外耳道骨部皮肤中的组织学表达,探讨 Livin及 Survivin 的表达 与胆脂瘤中耳炎的关系和 Livin与 Survivin之间的相关性,探讨两者在中耳胆脂 瘤发病中的可能机制,为其治疗提供理论依据。 方法 选取符合纳入标准的暨南大学附属第一医院耳鼻咽喉科胆脂瘤中耳炎住院 患者 25 例作为实验组,采集手术切除标本 25 份,同时选取其中 15 例患者外耳 道骨部皮肤作为对照组,采集正常外耳道皮肤组织标本 15 份。所有标本按 以福尔马林固定,石蜡包埋。每例标本做苏木素一伊红染色确定病理诊断。采用 免疫组化二步法 25例中耳胆脂瘤上皮(胆脂瘤组)与 15例外耳道骨部皮肤 组织(皮肤组)中 Livin及 Survivin 的表达,采用末端转移酶介导的原位缺口末 端标记染色TUNEL技术检测两者组织的凋亡状态,并分析二者之间的相关性。 应用 SPSS13.0 软件进行统计学分析。 结果 1、25 例胆脂瘤标本中有 5 例 Livin 阳性表达,可在基底层、基底上层观察 I暨南大学硕士位论文 到 Livin阳性细胞,其中 4例呈+,1例呈++,20例呈阴性。15例正常外耳道 骨部皮肤标本中有 9 例可见到 Livin 蛋白的阳性表达,6 例呈阴性。与正常外耳 道皮肤上皮比较,Livin 在胆脂瘤上皮的表达明显下调,而且表达强度也显著降 低,差异有统计学意义α0.05,P0.01。 2、25例胆脂瘤标本 7例均有 Survivin蛋白表达,显色于胆脂瘤上皮的基底 层和基底上层细胞的细胞核和或细胞质,其中 6 例 4 例呈+,1 例呈++,18 例呈阴性。15例正常外耳道骨部皮肤标本中 10例可见到 Survivin蛋白的阳性表 达,5 例呈阴性。两组比较,Survivin 在胆脂瘤上皮的表达明显下调,而且表达 强度也显著降低,差异有统计学意义α0.05,P<0.01。 3、Survivin 和 Livin在胆脂瘤中表达的相关分析采用 Spearman等级相关,一 致性采用 Kappa分析,在胆脂瘤上皮中 Survivin的表达与 Livin的表达呈正相关, 一致性较好。r 0.749,P<0.01,Kappa 值为 0.688。 s 4、胆脂瘤上皮中细胞凋亡显著高于正常上皮组织,在胆脂瘤上皮中,Livin 及 Survivin的表达与凋亡呈负相关。 结论 1、凋亡抑制蛋白 Livin 及 Survivin 在胆脂瘤中的表达明显下调,与胆脂瘤 上皮的凋亡密切相关,提示 Livin及 Survivin可能参与胆脂瘤上皮的凋亡调控过 程在胆脂瘤的发生、发展过程中起重要作用。2.、凋亡抑制蛋白 Livin 及 Survivin 在胆脂瘤中的表达呈正相关,它们可能 在胆脂瘤的发生、发展过程中起协同作用。3、 凋亡抑制蛋白 Livin及 Survivin与细胞凋亡呈负相关,通过调整凋亡抑 制蛋白的表达也许可以有效地控制或减缓中耳胆脂瘤鳞状上皮细胞的增殖,从而 有望成为治疗胆脂瘤中耳炎的一条新途径。 关键词 中耳 胆脂瘤 凋亡 Livin Survivin II暨南大学硕士位论文 Expression and significance of apoptosis inhibitory proteinsLivin and Survivin in human middle ear cholesteatoma epithelium Graduate YANG Ning Academic advisor JIANG Li-xin Abstract Background and Objiective Cholesteatoma is due to the stratified squamous epithelium of the tympanic membrane and external auditory canal piercs into the middle ear cavity and the accumulation of the mass,the outer layer of it is surrounded by fibrous tissue containing deciduous epithelial、cutinized mass and cholesterol crystal,and the exact mechanism of its form is not clear yet, though there are two theories, one is the pocketinvagination doctrine and the other is epithelial immigration doctrine. In the past 10 years, more and more attention were paid to the role of a variety of cytokines in the pathogenesis of cholesteatoma otitis media .Recently,researchers believed that the incidence of cholesteatoma otitis media was an imbalance in the process of cell proliferation and apoptosis,and some researchers reported that lots of cholesteatoma were found to have relationship with abnormal apoptosis and abnormal cytokine expression.In this research we study the expression of the Livin and Survivin in the tissue of Cholesteatoma and normal external auditory canal skin,To investigate the relationship of the expression of Livin、 Survivin and the cholesteatoma otitis media, and to explore the correla tion of the Livin and Survivin, and the possible mechanisms in the pathogenesis of middle ear cholesteatoma,and to provide a theoretical basis for treatmentMethods According to the standards,we selected 25 cases of cholesteatoma otitis media st patients from the ENT department in 1 Affiliated Hospital of Jinan University as experimental group, collected 25 surgical resection specimens, and at the same time toIII暨南大学硕士位论文 select 15 cases of bone with external auditory canal skin in these patients as a control group,collected 15 normal skin samples of the external auditory canal. All specimens required to formalin-fixed, paraffin-embedded. Each of the experimental specimens were done with hematoxylin and eosin staining to determine the pathological diagnosis. Detecting the expression of Livin and Survivin in 25 cases of middle ear cholesteatoma cholesteatoma group and 15 cases of external auditory canal skin and bone tissue control group by using two-step immunohistochemical,and using terminal transferase-mediated in situ nick end labeling staining TUNEL to detect the apoptosis status of both tissues and to analyze the correlation between themSPSS13.0 system was used to perform the statistical analysisResult 1、There were 5 patients in 25 cases of cholesteatoma specimens had positive expression of Livin, Livin-positive cells was observed in basal、 upper-basal cells, among them 4 cases were +,1 case was + +,20 cases were negative. 15 cases of the normal external auditory canal skin samples had 9 cases of positive expression of Livin protein,6 cases were negative. Livin expression and the intensity of the expression in cholesteatoma epithelium significantly reduced compared with normal external auditory canal skin, and the difference had statistical significance α 0.05, P 0.012、There were 7 patients in 25 cases of cholesteatoma specimens had positive Survivin protein expression,it expressed in the nuclei andor cytoplasm of the basal and upper-basal layers of the cholesteatoma epithelium, among them 6 cases were +, 1 case was + + , 18 cases were negative. 15 cases of the normal external auditory canal skin samples had 10 cases of positive expression of Survivin protein,5 cases were negative. Compared with the control group,Survivin expression and the expression intensity in cholesteatoma epithelium significantly reduced,the difference had statistical significance α0.05,P<0.013、 By using Spearman rank correlation analysis to analyze the expression of Survivin and Livin in the cholesteatoma epithelium,using Kappa analysis to checkIV暨南大学硕士位论文 regularity. The expression of Survivin and Livin in the cholesteatoma epithelium was positively correlated,and the regularity was fairly finer 0.749,P 0.000, s Kappa0.6884 、The apoptosis status of cholesteatoma epithelium was significantly higher than normal epithelium,the expression of Survivin and Livin was negatively correlated with apoptosisConclusion 1、The expression of apoptosis inhibitory proteins Livin and Survivin were significantly reduced in Cholesteatoma ,and they were closely related to the apoptosis of the cholesteatoma epithelium,suggested that Livin and Survivin might be involved in the regulation of apoptosis process of the cholesteatoma epithelium,which play an important role in the occurrence and development of cholesteatoma2、 The expression of apoptosis inhibitory proteins Livin and Survivin was positively correlated in cholesteatoma, they might cooperate in the occurrence and the development of cholesteatoma3、 Apoptosis inhibitory proteins Livin and Survivin and apoptosis was a negative correlation, adjust the expression of apoptosis inhibitory proteins Livin and Survivin might be a new way to treat the cholesteatoma otitis mediaKey Words middle ear Cholesteatomas apoptosis Livin Survivin V暨南大学 硕士位论文 目录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„? 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„? 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„16 讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 附图及说明„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„28 英文缩略词„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30 在校期间发表论文„„„„„„„„„„„„„„„„„„„31 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 VI暨南大学硕士位论文 前言 1、胆脂瘤的分类及特点 中耳胆脂瘤是临床常见病,因其对周围骨质的直接压迫,或由于其基质及基 质下方的炎性肉芽组织产生的多种酶如溶酶体酶、胶原酶和前列腺素等物质的 作用,致使周围骨质脱钙、骨壁破坏,炎症由此向周围扩散,可导致一系列严重 颅内外并发症,胆脂瘤中耳炎是一种严重威胁人类健康的中耳疾病,故又称“恶 性中耳炎”,因本病药物治疗无效,必须手术才能根治,所以中耳胆脂瘤的研究 一直受到国内外学者的重视。该病病因复杂,受许多因素的影响,胆脂瘤细胞的 高增生性,骨质破坏吸收及凋亡抑制均与细胞因子有直接或间接的关系,其临床 病理特征主要表现为大量增殖的角化鳞状上皮和邻近骨质的破坏,以及程序性角 化细胞凋亡,导致腔内角化碎屑的堆积。 根据病因的不同,可将胆脂瘤分为两类:先天性胆脂瘤congenital cholesteatoma 和获得性胆脂瘤 acquired cholesteatoma。先天性胆脂瘤来源于 与形成原始脊索相同的外胚层,这种外胚层胚胎细胞残留可发生于颅骨的任何部 [1] 位,但昀常见于颞骨 。获得性胆脂瘤的发病机理包括:上皮移行侵入,种植侵入 [2,3] 和上皮化生和基底细胞增生过度 。上皮移行侵入学说与咽鼓管功能障碍有关, 并可形成两种胆脂瘤。一种是原发性获得性胆脂瘤,由于咽鼓管功能障碍导致鼓 膜内陷袋的形成,随后上皮碎屑的堆积,昀后形成胆脂瘤。另一种是继发性获得性 胆脂瘤,上皮细胞通过鼓膜穿孔边缘移行进入中耳。外伤或手术导致的鳞状上皮 细胞种植于中耳腔也可形成继发性获得性胆脂瘤。这些医源性胆脂瘤常常因为鼓 室成形术和鼓膜置管将鳞状上皮细胞带入并封闭于鼓室内所致。上皮化生学说认 为,由于慢性感染的长期存在,正常立方上皮转化为角化鳞状上皮,从而形成 胆脂 [2] [3] 瘤 。有人认为基底细胞增生过度也是胆脂瘤形成的原因之一 。 中耳胆脂瘤是耳科常见病之一,主要特征是在中耳腔内的高度角化鳞状上皮 增生,引起邻近的骨质破坏。它具有侵袭性、破坏性、迁移性、非正常调控下的 增殖性、分化变异性、复发性等类似于恶性肿瘤的生物学特征,但在病理上确属 [4] 良性病变,而非恶性肿瘤 。胆脂瘤上皮的特点是上皮细胞有高度增生的能力, 但是其细胞的增殖并不是没有控制的,细胞增殖增强的同时,细胞的凋亡也加速, [5] 这与肿瘤不同 。国内外学者对中耳胆脂瘤的发病机制做了大量研究,主要集中 1暨南大学硕士位论文 在上皮过度增殖、骨质破坏吸收和细胞凋亡机制三方面。随着科技的发展,分子 生物学技术在研究工作中大量应用,学者们开始从分子生物学角度研究胆脂瘤上 皮的特征和演变、骨质破坏、免疫细胞浸润、细胞因子表达与相互作用,把 中耳 胆脂瘤的病因及发病机制的研究带到了一个新的领域。 2、凋亡抑制蛋白 Livin 目前人类 IAP 家族已发现有 8 个成员, NAIPBIRC1 , cIAP-1HIAP-2/MIHB/BIRC2,cIAP-2HIAP-1/MIHC/BIRC3,XIAPhILP/MIHA/ BIRC4,survivinTIAP1/BIRC5,apollonBruce/BIRC6,hILP-2Ts-IAP,LivinML - [6] IAP/KIAP/ BIRC7。 2.1 Livin基因及蛋白结构 Livin是由 4个不同的实验小组几乎在同一时期所发现,上述实验小组均采用 IAPs 同源序列BIR或 RING寻找的方法,分别从人类基因组 cDNA文库中克隆得 [7] [8] 到。Kasof 等 将该基因命名为 Livin;Lin等 由于是从人胎肾 cDNA文库中分离 [9] 到该基因,故将其称为 KIAPkidney IAP;Vucic 等 因该基因在人黑色素瘤细胞中 [10] 高表达,所以称之为 ML-IAPmelanoma IAP;Ashhab 等 明确了该基因存在 2 个剪接变异体,分别命名为 Livin α 和 Livin β。为避免混淆,我们将其统称为 Livin。 Livin 基因位于人染色体 20q13.3,全长 4.6 kb,包含 7 个外显子。基因转录产物 mRNA长 1.4 kb,这与 Livin全长 cDNA大小相一致。此外还发现存在长约 2.2 kb, 2.8 kb和 4.0 kb的转录子,这可能与 mRNA 3′端非翻译区多腺苷酸化或存在未剪 接加工成熟的前体 RNA 有关。 Livin 蛋白 N 端仅包含一个 BIR 结构,C 端含一 个 RING 环指结构。Livin α 和 Livin β 分别由 298 和 280 个氨基酸组成,二者相差 的 18个氨基酸由介于 BIR和 RING结构之间的第 6外显子 5′端 54 bp的基因序列 编码。Livin BIR与 XIAP BIR2 结构相类似,包含 4个 α 螺旋和 1个三股抗平行 β 片层,与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。Livin BIR也具有一个 C末端延伸 结构,这与 cIAP-1 BIR3 类似。 Livin氨基酸残基 C124,C127, H44 及 C151与 锌原子结合,借以稳定整个重叠结构。 Livin α 和 Livin β蛋白 Mr 分别为 39 000和 [7-10] [7] 37 000, Livin主要表达于胞质 但 Kasof等 认为 Livin的细胞内分布与 Survivin 相似,即 Livin既在胞质内呈丝状表达,同时也表达于胞核,并认为 Livin C末端 的 RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。2暨南大学硕士位论文 2.2 Livin抗细胞凋亡作用 [9] ?抗死亡受体介导的细胞凋亡作用: Vucic 等 将 Livin 基因转染乳腺癌 MCF7 细胞,证实转染细胞对 Fas,TNFR1tumor necrosis factor receptor 1, [7] DR4death receptor 4及 DR5 介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。Kasof等 将 livin 基因转染 HeLa 细胞,结果显示转染细胞可有效阻断由 FADDFas-associated protein with death domain,Bax,RIP,RIP3 及 DR6诱导的细胞凋亡,Livin抗细 胞凋亡的作用甚至略强于 Survivin。在 Jurkat 人 T 淋巴细胞株中,Livin 可明显抑 [10] 制由 TNF α 及抗 CD95 抗体诱导的细胞凋亡,其抗细胞凋亡作用强于 Bcl-2 。进 [7,9] 一步研究表明 Livin抗细胞凋亡的作用依赖于 BIR结构的完整 。 ?抗线粒体介导的细胞凋亡作用:星状孢子素Staurosporine, STS是一种 蛋白激酶 CPKC抑制剂,可诱导线粒体释放细胞色素 C,后者可进一步激活细胞 凋亡的下游通路。 Livin α 对 STS诱导的 Jurkat 细胞凋亡表现出一定的抑制作用, 但作用弱于 Bcl-2;而 Livin β 则无此作用,显示了 Livin α 和 Livin β 的抗细胞凋亡 [10] 作用存在一定差异 。 ?抗化疗药物介导的细胞凋亡作用:许多化疗药物可导致细胞 DNA 的损伤而 诱导细胞凋亡。转染 Livin基因的 MCF7 细胞可有效对抗阿霉素,4-TBP4-tertiary [9] butylphenol诱导的细胞凋亡 。 Livin β 可显著抑制依托泊苷etoposide诱导的 [10] Jurkat 细胞凋亡 。 2.3 Livin抗细胞凋亡调节机制?抑制 Caspase 途径:Livin可与介导细 胞凋亡的下游效应 Caspase,即激活形 式的 Caspase-3和 Caspase-7结合,并抑制其活性。Livin还可与未加工的或断裂形 式的 Caspase-9结合,可抑制由 Apaf-1apoptosis protein-activating factor-1,细胞 色素 C及 dATP诱导的 Caspase-9激活作用。 Livin与 Caspase的结合抑制作用具 有高度的特异性和亲和性,这有赖于其 BIR 结构域的完整,BIR 结构域内单个氨 基酸的突变即可导致 Livin 与 Caspase 的结合作用及 Livin 抗细胞凋亡作用的明显 [7,9] 降低甚至完全丧失 。 ?激活 TAK1/JNK1 信号传导途径: Livin 可激活 MAPmitogen-activated protein激酶 JNK1 和 JNK2,对 JNK3 无激活作用,而 Livin 对 JNK1 的激活作用 远远强于 JNK2,并且是 Livin 对抗 TNF α 和 ICE介导的细胞凋亡作用的一条重要 3暨南大学硕士位论文 途径。 JNK蛋白家族可直接由 MKK4/MKK7 激活,但 Livin对 JNK1 的激活并不 依赖于 MKK4/MKK7 信号途径,而是通过 TAB1/TAK1 途径实现。TAK1 是一上 游 MAP3 激酶,在 TGF β1 的刺激下可激活 JNK1。 TAB1 是 TAK1 的共反应子 coactivator,TAB1本身对于 JNK1无激活作用,但可促进 TAK1介导的 JNK1 激 [11] 活作用。Livin 可与 TAB1 结合,并进一步激活 TAK1 。此外,SMAC second mitochondrial activator of caspases及活性肽片段可与 Livin的 BIR结构域特异性结 合,抑制 Livin与 caspase 的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由 SMAC 介导 [12] 的对 Livin抗细胞凋亡作用的负性调节机制 。 3、凋亡抑制蛋白 Survivin [13] Survivin 是 1997 年耶鲁大学 Ambrosini 等 利用效应细胞蛋白酶受体 -1effector cell protease receptor EPR-1的 cDNA 在人类基因组库中筛选克隆出来 的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成员。细胞周期与细胞凋亡是具有着密切联系的 生命活动。这个新的抗凋亡蛋白?Survivin 蛋白,昀近被发现同时具有调控细胞 凋亡和细胞周期的双重功能。这为细胞周期与细胞凋亡之间存在紧密联系提 供了 有力的证据,且细胞凋亡抑制与恶性肿瘤的发生发展以及放化疗不敏感有着密切 关系,另一方面,在成人终末分化组织不表达而选择性地表达于肿瘤组织,这种 独特的表达特性使其成为恶性肿瘤诊断与治疗研究的新靶点。 3.1 Survivin 蛋白结构与功能 肿瘤和部分干细胞处于活跃的细胞周期之中,它们的细胞周期的调节主要受 细胞因子和内外环境的影响,如果这些因素发生变化,就会影响正常的周期活动, 部分细胞有可能进入凋亡,Survivin 具有调控细胞凋亡和细胞周期的双重功能, 对它的探讨有可能对肿瘤治疗开辟新的途径。 IAP家族是一类在进化中高度保守 的凋亡抑制蛋白,一般包含 2 个或 3 个串联的含有半胱氨酸/组氨酸的杆状病 毒 IAP 重复序列(Baculoviral IAP Repeat,BIR)。BIR 结构发挥抗凋亡作用, 与此相联的羧基末端含有一个指环结构。Survivin 是 IAP 家族中昀小成员, Survivin 基因全长 14.7Kb,定位于染色体 17q25,有四个外显子和三个内含子, 编码产生一个与 EPR-1 互补的 142 个氨基酸组成的相对分子量为 16.5kD 的 胞浆蛋白,其结构较为独特: Survivin 蛋白只包含两个特定的结构: N 端 BIR 单 拷贝,C 端疏水 α 螺旋。4暨南大学硕士位论文 ?N 端 BIR:仅含有一个 BIR 功能区,即 BIR2,Cys46-Pro47-Thr48三个 氨基酸插入序列将 BIR 分子分成两半。BIR 结构中心是一个由三条反平行的肽 链组成的 β 片层,周围是四个短 α 螺旋。BIR 中心富含酸性氨基酸,是 Survivin 蛋白配体结合区,该区域被磷酸化酶磷酸化后,与配体结合能力更强, Survivin 的 磷酸化修饰是决定其功能的重要因素,Survivin 的磷酸化位点是 Thr34, Thr34ProGluArg 被认为是周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)结合位点,当 D71A(Asp71 突变为 Ala71)改变以天冬氨酸为中心的 负电荷晶体表面,或是 T34A(Thr34 突变为 Ala34)阻断 Survivin 的磷酸化 均会使 Survivin 丧失功能;BIR 另一特点是 Zn2+处于 Survivin 蛋白 BIR 单 拷贝上的 Cys57、Cys60、His77 和 Cys84 构成的四面体内,以配位键将此四个 氨基酸残基联结形成锌指模式,这个结构对 Survivin 蛋白抗凋亡功能很重要。 研究发现,Survivin 蛋白突变体 C84A(Cys84 突变为 Ala84)为不具备抗凋亡 功能,而 Pro26 突变为 Ala 或 Leu64突变为 Ala64 则功能正常。 ?C 端疏水 α 螺旋: Survivin 羧基末端缺乏锌指结构代之以一个由 42个氨 基酸组成的 α 螺旋, α 螺旋上的残基 126-142 构成 C 端疏水域,调节 Survivin 与纺锤体的微管蛋白结合,研究发现 Survivin 蛋白单体结合成蝴蝶结样对称二 聚体,这种二聚体化是 Survivin抗凋亡功能所必须的,通过 G76A(Glu 突变为 Ala),H80A(His 突变为 Ala)的突变影响二聚体联的形成,导致细胞凋亡和 异常分裂。 Survivin 蛋白与中心粒微管蛋白的结合对于蛋白发挥抗凋亡促增殖作 用也是必须的,切断 C 端 α 螺旋上的残基 126、142,虽然二聚体仍然形成, BIR 也正常折叠,但是蛋白无法定位于中心粒,无法使 CDK4,P21、Caspase-3 [14] 在微管组装中心聚集,从而失去调控凋亡和细胞周期的功能。Mahotka 等在人 类发现两种具有不同特性的 Survivin 剪接异构体(splic variants),一种缺乏外 显子 3 的 Survivin-DeltaEX3、一种保留了部分内含子 2 作为隐性外显子的 Survivin-2B,这两个剪接异构体导致蛋白质结构发生显著变化,包括 BIR 结构 域的改变。在细胞凋亡过程中,从细胞膜有关的死亡信号受体到 Caspase 家族, 均存在凋亡相关基因选择剪切(alternative splicing)以及剪接异构体,在凋亡调 解中发挥重要作用。通过转染实验研究两种剪接异构体的调控,发现 Survivin-DeltaEX3 保留了抗凋亡特性,而 Survivin-2B 抗凋亡特性明显降低, 5暨南大学硕士位论文 但昀近研究发现,Survivin-DeltaEX3 及 Survivin-2B 在细胞有丝分裂中并不起 [15] [16] 作用 。近来 Badran 又发现了一个新的剪接异构体 Survivin-3B,它由 5 个外 显子组成,包括一个从内含子 3 的一个 165bp 长的部分得到的新的外显子 3B 含有单个对凋亡抑制起重要作用的 BIR,但是缺乏羧基末端螺旋结构,提示 [17] Survivin-3B 可能与 G2/M 期无关。另外,Conway 等在人和鼠的组织内发现 了 3 个 Survivin 剪接异构体 Survivin-140,Survivin-121,Survivin-40, 均表达 于胚胎组织,在胸腺和睾丸只有 Survivin-40的高水平表达;Survivin-121可见于 所有分化成熟的组织,前两种具有抑制细胞凋亡的作用,Survivin-40在分化成熟 组织中未见表达。 3.2 Survivin 抗凋亡途径 凋亡是基因诱导下细胞的有序死亡,它在组织分化,个体发育、成长、衰老 的正常生物学过程中起重要作用。诱导凋亡的因素很多(如射线作用、病毒感染、 缺氧、化学试剂等),但总的说来,有两种途径??外源性凋亡途径和内源性凋 亡途径,外源性凋亡途径又称死亡受体途径,是通过细胞膜上的死亡受体(如 TNF 受体),Fas 激活,使细胞发生凋亡,当 Fas 和 Fas 的配体结合以后导致受体聚 合receptor clustering,形成死亡诱导信号复合体death inducing signaling complex, DISC,这个受体通过其凋亡分子 FADD(Fas associated protein with death domain)汇集多个前体 Caspase-8,使其激活。内源性凋亡途径又称线粒体 途径,是细胞外界的信号以及 DNA 损伤通过 Bcl-2 家族提高线粒体膜的通透 性,使线粒体释放出促进凋亡的蛋白质??细胞色素 C,细胞色素 C 连同 ATP 激活凋亡蛋白酶激活因子 Apaf-1(apoptosis protease activating factors),而活化 的 Apaf-1 可以激活 Caspase-9,从而激活 Caspase-3,是一条重要的凋亡产生途 径。而其中 Caspase-3 被认为位于自杀机制的核心,是外源性凋亡途径与内源 性凋亡途径的交叉点,处于凋亡途径的下游阶段。Survivin 可抑制多种因素诱导 的细胞凋亡,如抑制 fas、bax、Caspase、抗癌药物所诱导的细胞凋亡。 ?主要通过直接抑制凋亡终末效应器 Caspase-3、 Caspase-7 的活性阻断各种 刺激诱导的细胞凋亡过程, Survivin 抑制 Caspase 活性的机制目前认为主要是通 过其残基 Tip67、Pro33、Cys84 抑制 Caspase-3、Caspase-7 的活性,从而阻断 细胞凋亡过程。6暨南大学硕士位论文 ?可以通过与细胞周期 G2/M 有丝分裂纺锤体的微管蛋白特异性结合,维 [18] 持有丝分裂的进行,来发挥其抑制凋亡的作用 。 ?Survivin 还可以通过 p21 间接抑制 Caspase,其机制是 Survivin 与周期 蛋白依赖性蛋白激酶(CDK4)形成 Survivin-CDK4 复合体,释放出 CDK4 复 合体中的 p21,p21 进一步与线粒体 Caspase-3 结合,抑制其活性,阻断细胞 [19] 凋亡 。 ? Survivin 可与辅助性线立体源性 Caspase 激活因子( Second mitochondria-derived activator of Caspase,SMAC)结合,SMAC 是一种通过结 合 IAPs 而保护 Caspase 活性的蛋白, Survivin 与 SMAC 结合并对抗之进而抑 [20] 制 Caspase 活性而抗凋亡 。 其他可能抗凋亡途径?Survivin 是周期蛋白激酶 p34cdc2-cyclinB1 的有丝 分裂底物。Survivin 在 Thr34 位点上磷酸化后与 Caspase 结合并抑制其活性, 阻断 Caspase-9 依赖性的细胞凋亡信号传导,抑制细胞凋亡?通过抑制细胞色 素 C 的释放在线粒体水平参与抗凋亡?通过诱导 TNF 受体介导的信号转导中 NF-KB 诱导 Survivin 表达,而 Survivin 大量表达可降解 1-KB,解除 1-KB 对 NF-KB 活性的抑制,使细胞免于凋亡。?Survivin增强 IAP家族其他成员功能。 4、凋亡抑制蛋白 Livin、Survivin 与中耳胆脂瘤 凋亡抑制是中耳胆脂瘤的重要特性之一,与正常皮肤相比,胆脂瘤上皮具有 更强的增殖能力,目前有研究证明,凋亡抑制蛋白在中耳胆脂瘤的异常表达,说 明其在胆脂瘤的发生、发展过程中可能有重要作用。如果我们能通过调整凋亡抑 制蛋白的表达也许可以有效地控制或减缓中耳胆脂瘤鳞状上皮细胞的增殖。这 样,也许就为我们提供了另外一种治疗胆脂瘤中耳炎的新途径和新思路。需要通 过进一步研究 Livin及 Survivin等抑制凋亡因子在中耳胆脂瘤中的定位与表达, 来探讨它们在中耳胆脂瘤的发病机制及病理过程中的作用,从而揭示影响胆脂瘤 中耳炎发生、发展的某些因素,从分子生物学水平上阐明胆脂瘤的发病机制,并 为其治疗提供理论依据。7暨南大学硕士位论文 材料与方法 1. 标本采集 1.1 实验对象与构成 标本取自 2007年3月~2008年9月在我院接受手术治疗的25例胆脂瘤中耳炎 25耳,均经临床和病理检查证实为后天继发性胆脂瘤,其中男性13例、女性12 例,年龄16岁~65岁,中位年龄34.8岁,平均病程约5.4年。15 例外耳道上皮标 本(15耳)取自同一患者外耳道骨部皮肤。用已知阳性切片作阳性对照,PBS液 代替一抗作阴性对照。 1.2 标本采集与处理 以上各例标本均分为一份,用含DEPC的4%多聚甲醛固定,备免疫组化用。 2.主要仪器 2.1 组织包埋及切片制作 生物组织包埋机BM-V型湖北省医用电子仪器厂 超薄切片机 Reichert Jung Ultracut E,德国 CS 型摊片烤片机 湖北孝感医用电子仪器厂 2.2 免疫组化检测Livin和Survivin 1微波炉格兰仕 2电热恒温孵养箱DK-80M型,上海医用恒温设备厂 3CH-显微镜日本Olympus 4DM20显微镜 德国Leica 5DFC280图像采集系统德国Leica 6BI2000图像分析系统 成都泰盟电子有限公司 3.主要试剂及配制方法 3.1 基本耗材 1APES 武汉博士德生物工程公司 2丙酮 广州化学试剂厂 3二甲苯 广州化学试剂厂 4乙醇 广州化学试剂厂8暨南大学硕士位论文 5甲醇 广州化学试剂厂 6多聚甲醛广州化学试剂厂 7氯化钠 广州化学试剂厂 8磷酸氢二钠 广州化学试剂厂 9磷酸二氢钠 广州化学试剂厂 10柠檬酸 广州化学试剂厂 11柠檬酸三钠广州化学试剂厂 1230%过氧化氢分析纯 广州化学试剂厂 3.2 免疫组化检测Livin和Survivin 1Livin兔抗人多克隆抗体(即用型)武汉博士德生物技术有限公司 2Survivin兔抗人多克隆抗体(即用型)北京中杉金桥生物技术有限公司 3PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 4TUNEL凋亡细胞检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 5EDTA乙二胺四乙酸抗原修复液 6PBS缓冲液 配制方法:5000ml去离子水中加入氯化钠42.5g、磷酸氢二钠22g、磷酸二氢钠1.5 g 配制而成。 7柠檬酸缓冲液(抗原修复液) 配制方法:2000ml去离子水中加入柠檬酸0.8g、柠檬酸三钠6g,调节pH 值至6.0。 4. 实验方法 (一)免疫组化检测Livin、Survivin 免疫组织化学的实验过程采用PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒进行检测。 4.1 实验前的准备 1载玻片和盖玻片的准备:先将用清洁剂清洗干净,再浸泡在酸性溶液中24小 时,然后用流水冲洗干净后用蒸馏水清洗数遍,再浸入95%酒精中2小时,用绸 布檫干,放在干净的玻片盒中备用。 2载玻片涂布黏附剂:首先将多聚赖氨酸溶液从冰箱内取出,倒进塑料的容器 中恢复至室温,然后将处理好的载玻片插入玻片架,再将玻片架放入容器中,等 待5分钟,让其孵育。昀后于室温下过夜。9暨南大学硕士位论文 4.2 组织的准备 先准备好棕色小磨口瓶装数毫升多聚甲醛固定液,在瓶外进行编号,然后从-70? 超低温冰箱内取出组织,等待解冻后立即放入对应编号固定液中固定12小时。固 定时在4?冰箱内进行。 4.3 组织块的修整 组织固定后取一新的手术刀片将组织块切取平整,修掉一些不规则的部位,将过 大过厚的组织改小改薄。 4.4 组织的洗涤 用冰冷自来水将固定液冲洗干净。 4.5 组织的脱水 将组织块依次浸泡在冰冷的70%、80%、90%、95%酒精各2小时左右和无水乙醇 中半小时左右进行脱水。 4.6 透明或媒染 脱水后将组织依次浸泡在二甲苯?和二甲苯?中各20分钟左右进行透明。 4.7 浸蜡 1将事先准备好的几只浸蜡杯放置于温度恒定在60?的恒温箱内,然后将 52~54?、54~56?、56~58?固体状的“切片石蜡”分别置于不同的浸蜡杯中,并 在杯上作记号标记以区分软、硬蜡。 2将透明好的组织块从二甲苯中取出,直接投进已经熔化的“浸蜡?”中浸泡30 分钟后,再顺序浸入已经熔化的“浸蜡?”和“浸蜡?”中,每次各1至2小时即可进 行包埋。 4.8 包埋 1先在60?的恒温箱内熔化包埋蜡,点燃酒精灯,将已经熔好的包埋蜡装在有 柄的容器内,置于酒精灯上加热。 2准备好包埋框(蜡块固定器)。 3将熔化好的石蜡倒入包埋框内,用加温后的镊子迅速将浸蜡后的组织块放入 包埋框内,当石蜡即将凝固而还没有凝固时,插入写有标本编号的标签纸,然后 将包有组织的石蜡块放进4?冰箱,等待包有组织的石蜡块自然冷却凝固变硬后, 取下包埋框就完成了组织的包埋。10暨南大学硕士位论文 4.9 石蜡切片 1安装并固定好切片刀,然后固定好蜡块,调整蜡块与切片刀至合适的位置。 2先修出标本,直到组织完全暴露于切面。 3调整切片厚度刻度指针,使切片厚度为3~5 μm。 4开始切片,将切下的蜡带用毛笔将其按顺序存放在培养平皿内,等候染色时 展片和贴片。