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【doc】克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究

2017-11-13 10页 doc 28KB 26阅读

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【doc】克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究【doc】克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究 克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、 外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究 四川生理科学杂志2005;27(1)l 克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内,外刺激肺上皮细胞分泌IL一8的研究 周敏燕,王国兴,冯云,黄宁,王伯瑶,吴琦" (四川大学华西医学中心感染免疫研究室,成都610041) 摘要目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsidlapneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺 上皮细胞...
【doc】克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究
【doc】克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究 克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、 外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究 四川生理科学杂志2005;27(1)l 克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内,外刺激肺上皮细胞分泌IL一8的研究 周敏燕,王国兴,冯云,黄宁,王伯瑶,吴琦" (四川大学华西医学中心感染免疫研究室,成都610041) 摘要目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsidlapneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺 上皮细胞株II,8分泌的影响,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制.:实验分为两组.一组使用能 使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理.而另一组不处理分别用Kp03183的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激 肺上皮细胞株A549.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL_8表达水平.并用RT-PCR的方法检测肺上皮细胞胞内模式识另U受 体NOD1的表达.结果:Kp培养上清对未经digitonin处理的细胞lL.8分泌无明显增强作用.与对照相比差异无显着意义(P>0. 05).菌体成分能刺激lL_8分泌增加(P<0.01),但增高不超过一倍.经digitonin处理使细胞膜通透性增加后.Kp培养上清及菌体 成分刺激细胞IL_8的作用都增强,菌体成分刺激IL_8效果更为显着.为对照的3倍,而培养上清作用相对较弱.RT-PCR检测结果 表明,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体N()D1.结论:菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细 胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节.肺上皮细胞表达胞内模式识别受体N0D1,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌 菌体成分,值得进一步的研究. 关键词肺炎克霄伯杆荫;人肺上皮细胞;白细胞介素.8 克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)是目前较为常见的 医院内机会致病菌?】.近年来由于抗生素,特别是广谱抗生素 的广泛应用,使细菌耐药性问题愈加突出.治疗克霄伯引起的 肺部感染也更困难.克雷伯杆菌引起的肺部感染,临床表现为 快速进展的多囊性肺脓肿.发病率和致死率都相当高.因此, 深入研究克雷伯杆菌的致病机制,包括细菌与宿主L皮细胞的 相互作用.肺组织炎症反应的分了机理,宿主对细菌的防御机 制.将有助于从免疫生物学的角度探讨该病新的防治. 白细胞介素一8(1nterleukin.8.IL-8)又称中性粒细胞活化蛋 白1.属于13种人CXC趋化因子家族成员之一.Il.8不仅是 重要的炎症趋化因子,也是重要的免疫及炎症反应调节因子并 与血管生成,肿瘤发生及转移等相关【2】.有研究表明,11.-8可 促进呼吸道一l-.皮细胞防御素HBD-2的表达[3B].II,8的分泌 是机体炎疗防御反应开始启动的标志.作为条件致病黹的肺 炎克雷伯杆菌,在感染肺部的致病过程中,往往产生严重的炎 症反应.肺炎克雷伯杆菌是否首先通过刺激肺上皮细胞而触 发炎症.肺炎克雷伯杆菌主要的炎症活性成分是什么,另外J 皮细胞炎症反应的识别受体及信号传递途径,这些问题目前还 知之甚少.本研究旨在对这些问题作初步的探讨. 1材料和方法 I|I肺炎克雷伯杆菌培养上清的制备肺炎克雷伯杆菌临床 分离株编号03183(以下简写为K1~3183)由四川抗生素研 究所惠赠.接种于TsB培养基(Sigma).37?振荡培养72h. 10000g,4?离心30min,收取上清.用分子截留量1000道尔顿 的YM1超滤膜(Millipore)超滤浓缩约5倍.浓缩上清液用0. 2邮1滤器滤过除菌.一80?保存待实验用. 国家自然科学基金(No.30270688)7LCMB基4~(No.98—861)资助 ;关琦(1963一).男.教授.研究方向:感染免疫 1.2肺炎克雷伯杆菌菌体成分的制备.Kp03183接种于TSB 培养基,37?振荡培养过夜,离心收集细菌.PBS洗涤细菌三次. 每次均用5000g,4"C离心5min沉淀细菌.最后活菌重悬于适量 的PBS.调节细菌浓度,使得紫外分光光度计测定600nmOD为 1.0.取50ml菌液在冰浴下进行超声处理.每次超声1分钟.共 5次.超声后的菌液用0.22urn的滤器滤过除菌,一80?保存待 实验用. 1.3肺上皮细胞培养肺上皮细胞株A549(本实验室保存)用 含10%新生小牛血清,100U/m1青霉素,100p-g/ml链霉素的 DMEM(Gl),37?,5%()02常规传代培养.并以8loU:/L 接种于48孔板,待细胞生长到基本完全融合时(大约I.510 个细胞/孔)进行实验. I.4细菌培养上清及菌体成分在细胞内及细胞外刺激肺上皮 细胞细胞通透性增加缓冲液为50raMHEPES,pH7,100raM KCl.3mMMb,0.1mMDTT.85mMsucrose,0.2%BSlmM FPand0.1mMGTP以及digitonin(1Oug/m1),非digitonin处 理细胞实验组中使用的缓冲液与之相同,但不含digitonin.细 菌培养上清及超声处理的菌体成分用上述缓冲液稀释,使其终 浓度为20%(v/v),以大豆培养基(TSB)作为阴性对照将配 好的细菌培养上清或菌体成分加入培养有A549细胞的48孔 板,每孔500ul.每个样品作三复孔.37?.孵育30分钟,然后将 孔内液体吸去,用PBS洗细胞一次,再加入30WBI含5%小牛血 清的DMEM培养基继续培养24h后收集细胞J二清,用ElISA 测定IL_8浓度. 1.5ELISA检测II一8表达量及统计学处理人II一8EIISA 试剂盒为美国R&Dsystems公司产品.严格按说明操作.BIO- ,IL8浓度检测上限 RAD550型酶标仪490nm测定样品0D值 2四川生理科学杂志2005;27(1) 为2000pg/ml.实验数据以SPSS进行统计学处理,数值以?s 表示.采用t检验. 1.6RT-PCR检测肺上皮细胞NOD1的表达根据C-enBank 中NOD1基因cDNA序列(登录为NM一006092)引物一对. k游引物::Tr(:AG()(]((G,rrr(:T(:A.下游引物: 陬,(:AAA(?T()(:A(_Tvr(rCG—L下游引物在基因组 上间隔13600bp,PCR预期产物长度为491bp.用Trizol试剂 (Invitrogen)提取肺上皮细胞株A549细胞总RNPu利用Super- scriptII反转录酶(Invitrogen)合成cDNA第一条链.以此为模板 进行PCR扩增.PCR条件是94?预变性3rain;94?变性35s. 52?退火35s,72?延伸2min.重复30个循环;72?延仲10min. 取10ulPCR产物电泳.EB染色.数码凝胶成像系统拍照. 2结果 2.1克雷伯杆菌培养上清刺激肺上皮细胞分泌IL-8的情况 在未加入digi【tonin的实验中.Kp03183株培养上清对A549细 胞IL-8分泌没有明显的刺激作用.ELISA检测IL-8分泌水平 细菌培养上清实验组为1094.8?66.5pg/m1.而TSB照为组 1029.7?60.9pg/ml,统计学处理没有显着差异(P>0.05).在 加入digitonin使细胞通透性增加的实验中Kp03183株培养上 清刺激A549细胞IL一8分泌的作用增加.实验组为1316.6? 80.3pg/m1.对照为941.9?58.8pg/ml(P<0.05),但增加的幅 度不到1倍一结果见图1. 图1见宙伯杆菌培养上清胞内外刺激细肥泌11,8 2.2克雷伯杆菌菌体成分刺激肺上皮细胞分泌IL-8的情况 在未加入dig/tonin的实验中.肺炎克雷伯杆菌菌体成虽然能够 刺激A549细胞分泌IL-8增加(实验组为1302.7?69.8pg/m1. 对照为804.9?80.5pg/m1.P<0.01),但增加的幅度不到1倍. 在用digitonin使细胞通透性增加的实验中,菌体成分刺激A549 细胞IL-8分泌的活性显着增加(实验组为2183.5?92.8r,g/m1. 对照为774.6?77.2pg/m1.P<0.01).实验组为对照组的3倍. 结果见图2 :500 2000 l500 l000 500 0 图2克雷伯杆菌菌体成分胞内外刺激肺上皮细肥泌IL-8 2.3肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1A549的 RNA经RT-PCR扩增.PCR产物凝胶电泳显示490bp左右的特 异条带.表明肺上皮细胞表达胞内模式识别受体N0D1(结果见 图3). bp 2000 1000 750 500 250 l00 图3RT-PCR法扩增的NODIcDNA片段 3讨论 Kp是人上呼吸道的常居菌.在正常人并不致病.说明正常 人对Kp有防御的能力.一J皮细胞是机体防御微生物入侵的第 一 道防线.已有研究证明,呼吸菌上皮细胞能够清除入侵的 Kpf.Kp感染常发生在免疫缺陷和抵抗力下降的人,提示机 体自身防御机制低下是发病的重要原因.对于Kp致病的分子 机理,以及机体对细菌的免疫和炎症反应机理.目前的认识仍 相当有限. 最近Kp致病机制的研究多集中在细菌的侵袭力.实验观 察到Kp牯附并侵入呼吸道上皮细胞,因此细菌侵入细胞的机 理及其病理生理学意义成为致病机制研究的重要.然而 研究Kp感染的发病机制,不仅要探讨细菌对宿主的侵袭.机体 对细菌产生的免疫和炎症反应也是重要的研究内容,从现有的 资料看.这方面的工作还有待开展. 上世纪9【)年代中期,Toll样受体被发现.这是天然免疫识 别最为显着的进展.Toll样受体主要表达于细胞膜.通过感知微 生物保守的成分,它介导宿主天然免疫及炎症反应,并进一步 诱导获得性免疫【5J.Tou样受体研究主要集中在免疫细胞(单 核细胞,树突细胞).j二皮细胞Toll样受体的生物学意义还有待 更多的研究.最近几年,在上皮细胞的胞内又发现一类模式识 别受体.既Nor)分子.识别细菌肽聚糖结构.能够介导_I二皮细 胞天然免疫及炎症反应【6J.Kp刺激_I.皮细胞的炎症反应.主要 是由r0ll样受体介导.还是NOD分子介导.H前还不清楚. 本实验初步观察3-Kp分泌因子及细菌菌体成分刺激肺 皮细胞炎症反应的可能性.digitonin是一种作用温和的去污 剂.在适当的浓度下.digitonin使细胞膜通透性增加.但并不杀 死细胞.因此采用digitonin处理以增加膜通透性.成为研究某些 物资在细胞内外(或细胞器内外)转运的一种常用手段.最近 Girardin采用digitonin处理293细胞.证实肠道致病菌的超声破 碎成分能够激活293细胞内的N()D1分子I7l.我们的试验观 察到在不使用digitonin的条件下.无论Kp的培养k清或菌体 成分对A549细胞IL一8分泌的刺激作用都很弱.然而在digi— tonin增加膜通透性后.它们的刺激活性都得到增强.提示Kp诱 导呼吸道上皮细胞的炎症反应主要不是细菌(或产物)与细胞 膜受体分子的相互作用,而更加依赖于细菌对上皮细胞的侵 袭.也即需要细菌进入到细胞内激活胞内受体.细胞内微生物 识别受体目前主要发现了NOD家族分子(包括多个分子).其 中NOD1识别草兰氏阴性细菌肽聚糖结构.因此我们检测证实 了NOD1在A549细胞的表达,但是Kp是否就是通过NOD1刺 激炎症.或者还有其他分子的参与,需要进一步的实验.另外本 实验观察到Kp菌体成分刺激A549细胞IL-8表达的作用明显 强于细菌的培养上清.提示Kp的致炎成分主要不是来自细菌 四川生理科学杂志2005;27(1)3 的分泌或代谢产物.而是直接来自细菌的菌体. 观察上皮细胞对侵入胞内的肺炎克雷伯杆菌炎症反应.探 讨炎症反应信号传递和分子机制不仅具有学术理论意义.对细 菌感染性疾病的治疗也可能会产生实际指导意义.最近有研 究发现肠上皮细胞NOD信号介导了上皮细胞直接的抗菌活 性,沿着这条思路,有可能发展呼吸道感染新的防治措施. 参考文献 1PtxlschunR,UllmannU.KlebsiellasPp.asI1(x)c0n1ialpathogens:epi. demiology,taxonomy.typingmetlxxls,andl~thogenieityfactors.ClinMi. crobiolRev.1998:11(4):589,603 2MannaSK,RameshGT.Interleukin.8inducesnucleartran~ription factor-kBthroughTRAF6.dependentpathway.JBiolChem.2f~)5;280 (8):7010,21 3TomitaT.NagzL~eTDefensinsasarncchanismofhostdefen~andin. hateimmunityNipponRonenIgakkaiZasahi.2001;38(4):440--3 4Cort~G.AIVal-CZD,Satr~C,eta1.RoleoflungepithelialcelIsinde. feruleagainstKlebsiellapneumoniaepneumonia.Irdec~Immtm.2002;70 (3):1O75 5AkiraS,TakaK,KaishoT linkinginnateandacquiredimmunity "lk~ll—likereceptors:criticalprorein.,~ NatlITIITtHno1.7I101;2(8):675--8() 6NoharaN,NunezG.NOLO:intmcellularprotein.~involvedininflam. marionandapoptcx~is.NatRevImmurK~1.2003:3(5):371,82 7GirardinSE.eta1.Ntxlldetectsauniquemuropeptidefromgram-nega. tivebacterialpepridoglycan.Science.2003;300(5625):1584,7 Klebsiellapneumoniaesecretoryfactorsandsonicatedbacterialextractinducing humanlungepithelialcellsIL一8secretionintracelhflarlyandextracelhdarly ZhouMingyan,WangGuoxing,Wuqi (Schoolofbasicandformicmedicine,SichuanUniversity.Chengdu610041) AIKKI'RACr0bjective:Toinvestigatethemechanismsofinflammationsignaltran~uctloninducedbyKlebsidlapneumoniaeinhu. nlanlungpithdbdcellsbymmparingthe11,8expre<sionlevelbetweendigitonin.treatedanduntreatedA549cellsstinmlatedbysecretory factorsandthemnicatedt~ucterialextractofKleiellapneumoniaeMethods:HumanlungepithelialeelIlineA549tr朗tedwithtarwith()ut digitoninwerestimulatedbybacterialsupernatantandsonicatedbacterialextractfromKlebsiellapneumoniaeresl~ctively.Theexpre,Mon llofIL?8vcasdetectedusingElISA.TheintracellularpatternrecxgmitionreceptorNOD1isdetectedinhumanlungepithelialcallsby RF—f】 (1RResults:Bacterialsupern:ttantshowednosignificantlyeffecttantheII.-8exDrei0nlevelinA549cellswithouttheadditionof digitonin,whereastherewg:k~aslightlyincreaseintheexpr~sionof11.8indigitonin.tr~tedcells.Sonicateelbacterialextractcm~sed.Im【x{一 v.st,Ithan1fold,[ncr~t.*ein11?8~cretionbydigitonin.untreated.4549c~llsInthedigitonn—l,ema~tbilizedA549cells.~3nicatedbac. terialextractstronglyinducedtheexpressionofIL-8,a3foldinere~Lseoverthecontro1Fin~dly,theexpreqsionofncdltuRNAinhuman lungepithelialcellsispmvedbyI,.PCRConclusion:SonicatedbacterialextractfromKlebsiellapneumoniaeisamoreeffectiveinflamma. tionstimulatortolungepithelMcdlsthanbacteria,,~cretoryfactorsTheentryofthebacteriaintothecdlsmaybencade&~ryforKlebsidla pneumoniaetoinduceeffectivelyinflammatoryre.slXark'~einvivointhelungepithelialcells. KeywordsKlebsiellapneumoniae;Humanlungepitheli;dcell;lnterleukin一8 穿子L膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞K+电流技术初探 蔡芳,曾晓荣,杨艳,刘智飞,李妙龄,周文,裴杰 (泸州医学院心肌电生理学研究室,泸州646000) 摘要常规全细胞膜片钳模式形成的同时,细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失,此现象对小细胞的影响更为明 显.穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性,它使细胞内环境保持稳定,利于研究胞内信息传导机制.并可改善常 规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏,有望提高实验的成功率.本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上 记录的全细胞K电流和由大电导钙激活钾通道BK(所介导的自发瞬时外向电流ISTOCs. 关键词穿孔膜片钳技术;常规全细胞膜片钳技术;BK(通道;自发瞬时外向电流;两性霉素.B 国家自然科学基金(No:30370527)
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