TCR信号传导与T细胞的阳性选择和阴性选择

TCR信号传导与T细胞的阳性选择和阴性选择 TCR 信号传导与 T 细胞的阳性选择和阴性 选择 郑明珠，鲁林荣 (浙江大学医学院免疫学研究所，杭州 310058) 5 摘要:T 淋巴细胞是参与适应性免疫的重要细胞之一，能直接介导细胞免疫，也可以在体液 免疫中起到辅助 B 细胞的作用。T 淋巴细胞在胸腺中发育，多能造血干细胞从骨髓迁移到胸 腺之后，经过淋巴样干细胞、祖 T 细胞、前 T 细胞等发育阶段，最后经过阳性选择和阴性 +或 CD8+单阳性细胞，并输出到外周发挥作 选择发育为成熟的具有自身免疫耐受性的 CD4 用。T 细胞发育异常会导致免疫功能的紊乱和相关疾病的发生，因此深入了解 T 淋巴细胞的 10 发育过程和调控机制对该类疾病的治疗将起到指导性的作用。本综述对近年来 αβ T 细胞发 育的研究进展进行简要概述。 关键词:免疫学;胸腺 T 细胞发育;阳性选择;阴性选择 中图分类号:R392 15 TCR signaling and the positive and negative selection of thymocytes Zhen Mingzhu, Lu Linrong (Institute of Immunology,Zhejiang University School of Medicine, HangZhou 310058) 20 Abstract: T lymphocytes are key components involved in adaptive immunity. They can destroy virally infected cells and tumor cells directly or assist other white blood cells in immunologic processes, including maturation of B cells into plasma cells and memory B cells, and activation of macrophages. T cells are developed in thymus. Hematopoietic progenitors from bone marrow populate the thymus and generate a large population of immature thymocytes. They finally go +CD8- or CD4-CD8+) through positive and negative selection and mature to single-positive (CD425 thymocytes that are then released from the thymus to peripheral tissues. In this review, we summarized the recent research progress in the area of αβ T cell development . Keywords: immunology; thymocyte development; positive selection; negative selection 30 0 引言 人体免疫系统是机体抵御微生物入侵最重要的保护系统，它能有效发现并清除异物和 外来病原微生物。免疫系统具有高度的辨别力，能精确识别自己和非己物质，以维持 机体的相对稳定性;同时还能接受、传递、扩大、储存和记忆有关免疫的信息，针对 免疫信息发生正或负的应答，并不断调整其应答性。免疫应答主要包括固有免疫和适应 性免疫两种，在机体抵抗外界侵染时均发挥重要作用。固有免疫主要由吞噬细胞介导，在病 35 原体早期识别和急性炎症反应中起作用，而适应性免疫主要通过 T 和 B 淋巴细胞的参与来 实现。适应性免疫通过激活抗原特异性的 T 和 B 细胞的活化增强了免疫反应的强度和特异 性，并能对特异性的抗原产生记忆性反应，能在之后遇到相同病原时更快速地启动免疫反应。 T 淋巴细胞是主导整个适应性免疫反应的核心，它不仅能介导细胞免疫，同时能辅助 B 细胞 产生抗体，促进体液免疫。T 淋巴细胞又包括了 αβ T 细胞和 γδ T 细胞两大类，参与适应性 40 免疫的主要是 αβ T 淋巴细胞，本文综述的内容将主要针对 αβ T 淋巴细胞来讨论。 基金项目:教育部博士点基金(20090101110112) 作者简介:郑明珠，(1985-)，女，博士研究生，主要研究方向为 T 细胞分化发育。 通信联系人:鲁林荣，(1970-)，男，教授，主要研究方向为免疫调节和自身免疫性疾病的发病机制。E-mail: linrong.lu@gmail.com -1- 1 T 淋巴细胞及其功能 T 淋巴细胞是指在细胞面表达 T 细胞受体 (T-cell receptor， TCR，主要是 αβ TCR) 和 CD3 分子复合物(图 1)的淋巴细胞。TCR 是由两条不同肽链构成的异二聚体，根据所 45 含肽链不同可以分为 αβ TCR 和 γδ TCR，分别因为表达 TCRαβ 链或 γδ 链而被命名。人体 内大多数为 αβ TCR，仅少数为 γδ TCR。构成 TCR 的两条肽链均是跨膜蛋白，胞外区由可 变区(V)和恒定区(C)构成，可变区是 TCR 识别抗原肽-MHC 复合物的功能区。跨膜区 通过盐桥与 CD3 分子的跨膜区连接，形成 TCR-CD3 复合物。由于构成 TCR 的两条肽链的 胞浆区很短，不具有信号转导的功能，因此 TCR 识别抗原所产生的活化信号由受体复合物 中的 CD3 分子转导至 T 细胞内。T 淋巴细胞是机体获得性免疫应答的重要组成部分，其正 50 常发育是机体对外来微生物入侵产生有效免疫应答的基础，其发育异常则是免疫缺陷和自身 免疫性疾病的基本病因之一。根据其分化特征，αβ T 细胞可以分为不同的亚群，发挥不同 [1]， 的作用:在细胞表面表达 CD4 分子的 T 细胞被称为辅助 T 细胞(helper T cell，Th 细胞) Th 细胞在不同的细胞因子或微环境下又分别能分化成 Th1、Th2、Th17 等亚型，其中 Th1 细胞主要参与细胞免疫和迟发性超敏性炎症反应;Th2 可辅助 B 细胞分化为抗体分泌 55 细胞，参与体液免疫应答; Th17 主要介导炎症反应和组织损伤，特别在上皮与粘膜 TCR V CD3 CD3 C α β 细胞外 γε εδ 细胞膜 ITAM 细胞内 ζ ζ T 细胞 图 1 TCR-CD3 复合物 60 免疫中起主要作用;近年来的研究发现在 CD4+ T 细胞中还存在一类具有免疫调节能 力的调节性 T 细胞(regulatory T cell， Treg)能负责调节机体免疫反应，在维持自身免疫 耐受和避免自身免疫反应中起到重要作用[2]。而表面表达 CD8 分子的 T 细胞则被称为细胞 毒性 T 细胞(cytotoxic T cell，CTL)，具有直接杀伤感染的细胞的能力[3] ; 2 T 细胞发育过程 免疫细胞来源于造血干细胞。在骨髓，多能造血干细胞最初分化为定向干细胞，包括淋 65 巴样干细胞和髓样干细胞。淋巴样干细胞继续分化为 T 细胞、B 细胞、NK 细胞等;髓样干 细胞最终分化为红细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞、树 -2- 突状细胞、肥大细胞等。在骨髓中，前 B 细胞继续发育为成熟 B 细胞，而前 T 细胞则经过 血液循环到达胸腺，在胸腺微环境中进一步分化为成熟 T 细胞。T 细胞在胸腺的发育过程可 70 以根据其表面 CD4 和 CD8 的表达，分成三个主要阶段，包括双阴性(double negative，DN， -CD8-)、双阳性(double positive，DP， CD4+CD8+)和单阳性(single positive，SP) CD4 阶段。其中的 DN 阶段又可以根据 CD44 和 CD25 的表达分 DN1(CD44+CD25-)、DN2 (CD44+CD25+)、DN3(CD44-CD25+)和 DN4(CD44-CD25-)四个阶段(图 2)。 胸腺主要包括髓质(cortex)和皮质(medulla)，以及被膜下层(subcapsular)和皮髓 质接合区(cortico-medullary junction，CMJ)(图 2)[4]。DN 阶段的发育主要在皮质区进行， 75 大约 15 天。皮质上皮细胞为胸腺 T 细胞的早期发育提供了一个极为重要的微环境，目前为 止发现了许多参与调控上皮细胞和胸腺细胞相互作用的基因，比如 TSOIC12，Tlp， 皮质区 DN3 DN4 DN2 DP DP DP DP DP DN1 DP DP 皮髓质接合区 Blood vessel SP 髓质区 图 2 胸腺结构及 T 细胞发育过程 80 MT-SP1 等。同时上皮细胞还能表达各种趋化因子、选择素和整合素受体，诱使不同发 育时期的 T 淋巴细胞有不同的空间定位[4]。造血祖细胞由皮髓质接合区血管进入胸腺，发育 为 DN 细胞，T 细胞在 DN3 完成 TCRβ 链重排后，能与此时在在 T 细胞表面表达的 TCR pre-， 链(pTα)形成有功能的 pre-TCR 受体复合物。不能表达 pre-TCR 的 DN 无法进一步增殖而 85 被清除。这是 T 细胞发育的第一个检查点，因为需要 TCR 受体 β 链的表达而被称为 β-selection。表达 pre-TCR 的 DN 细胞进而发育成 DP 细胞，并在此阶段完成 TCRα 链的重 排，在细胞表面表达成熟的 TCR。 DP 阶段持续约 2 天。进而这群 DP 细胞，经过阳性选择 +或 CD8+ (positive selection)获得对自身 MHC-II 或 MHC-I 类分子的识别能力，分化为 CD4 SP T 淋巴细胞进入胸腺髓质，这些细胞将在此停留约 7-10 天，经历阴性选择(negative selection)，从而获得对自身抗原的免疫耐受，最终成熟的 CD4+ 或 CD8+ SP T 细胞被释放 90 到外周发挥其免疫功能[4]。 -3- 3 阳性选择 阳性选择是胸腺 T 细胞发展到双阳性阶段经历的一个特定的检查点，在细胞表面成功 表达 TCR 的 DP 胸腺细胞中，很多是没有功能的，因为不能与抗原肽-MHC 结合。而阳性 95 选择正是针对 T 细胞表面的 TCR 与抗原肽-MHC 分子结合能力的筛选过程。细胞表面 TCR 能与抗原肽-MHC 相互结合的 T 细胞被保留，而表面 TCR 未能与抗原肽-MHC 分子有效结 合的双阳性细胞在胸腺皮质中发生凋亡，此类凋亡细胞占双阳性细胞的 95%以上。 +CD8+双阳性阶段的时候，其表面开始表达 TCR，TCR 和胸腺 胸腺 T 细胞发育到 CD4 皮质中自身 MHC 多肽复合物相互作用，能激发细胞内的细胞信号传导，而这些胞内信号正 是使双阳性 T 细胞维持存活，并进一步增殖分化的先决条件(阳性选择)。胸腺 T 细胞 TCR 100 信号传导在 T 细胞发育中起到关键作用，当 TCR 接收到适当的刺激信号时，能将此信号传 递给 CD3 分子，Lck 激酶被招募，Lck 使 Zap-70 磷酸化，Zap-70 能进一步使接头蛋白 LAT 磷酸化，LAT 同时招募 PLCγ1 和 Gads/Slp76/Itk 复合物， PLCγ1 能水解细胞膜上的磷脂酰 肌醇二磷酸(PIP2)产生三磷酸肌醇(IP3)和甘油二脂(DAG)，分别激活钙离子信号通 路和蛋白激酶 C(PKC)通路，从而引起下游基因转录。正因为如此，参与 TCR 信号转导 105 的信号分子也都在此过程中起到举足轻重的作用。近年来，利用基因敲除方法，许多与胸腺 T 细胞发育分化相关的重要因子先后得到鉴定，其中大部分都是参与 TCR 信号传导的信号 分子或是受到 TCR 信号调控表达的蛋白[4, 5]。TCR 信号分子如 Zap70、Itk、Lck 和 Fyn 等激 酶或鸟苷酸交换因子 Vav 的突变，都会导致阳性选择的障碍[6, 7]。此外，TCR 介导的钙信号 激活也是另一个与 T 细胞的阳性选择密切相关的信号途径[8, 9]。除此之外，TCR 重排发生障 110 碍也会导致 T 细胞发育受阻，早在 1992 年，哈佛医学院 Fred Alt 实验室，通过基因敲除实 验证明，重组激活酶 Rag2 缺失会使 TCR 和 BCR 重排无法完成而到导致 T 和 B 细胞发育受 阻[10]。 还有一些其它类型的分子参与 T 细胞发育和选择:一些细胞周期分子、磷酸酶或泛素 连接酶等，能直接或间接地影响到信号传导和细胞的存活而影响到 T 细胞发育。关于 T 细 115 胞发育分化机制现有的假说正是基于对这些信号传导途径和关键分子的研究。特别是近年 来，对一些参与 T 细胞发育新分子的研究，揭示了一些不依赖于任何已知调控机制的新机 制。2009 年 8 月有文献报道了一个与胸腺细胞阳性选择密切相关的基因 Themis(Thymus expressed molecule involved in selection)。Themis 是一个在双阳性和单阳性 T 细胞中特异 性高表达的未知功能基因。美国与日本的几家实验室几乎同时报道了对 Themis 基因敲除小 120 鼠的研究，一致发现 Themis 缺失能导致胸腺 T 细胞发育受阻在 DP 阶段，因而确定它是 一个与 T 细胞阳性选择密切相关的基因，但是其生物学功能至今尚未明确[11-15]。2012 年 5 月，本课题组在 Nature Immunology 上报导了一个参与阳性选择的新基因 Tespa1，我们通过 生物信息学筛选，发现 Tespa1 基因在胸腺中有特异性表达。随后通过构建 Tespa1 基因敲除 小鼠， 发现 Tespa1 在 T 细胞的阳性选择(positive selection)过程中起着必不可少的作用， 125 小鼠中 Tespa1 基因的缺失会导致 T 细胞发育停滞在特定的 CD4+CD8+双阳性阶段。进一步 的细胞水平研究显示，Tespa1 对于指导 T 细胞发育的 T 细胞受体(TCR)信号传导起着精 细的调控作用:Tespa1 的缺失导致 T 细胞对 TCR 刺激的反应性显著降低，包括 T 细胞的活 化、增殖以及效应因子的分泌等。最后，我们在分子水平对 Tespa1 的功能进行探究，发现 Tespa1 能与 TCR 信号传导过程中形成的 LAT 信号传导体相互作用，并可能通过协助 LAT 130 [16] 。对这些调控机制的探讨，信号传导体的组装来发挥其在 T 细胞发育过程中的调控作用 -4- 将有助于我们更全面阐述 T 细胞发育分化的机制。 除了 TCR 信号，在 T 细胞发育中起到决定性作用的另一类分子就是各种不同的转录因 子。转录因子的顺序表达精细调控着 T 细胞的发育分化。比如，转录因子 GATA3，Tox， 135 Egr1 和 cMyb 等的表达都受到 TCR 信号的诱导，并起到调控 TCR 信号的作用，因而在 T 细胞阳性选择过程中发挥重要作用[4, 5]。 阳性选择同时决定了 T 细胞的最初分化，如果细胞表面的 TCR 能有效识别胸腺上皮细 胞表面表达的 MHC II 类分子，DP 细胞就能分化成 CD4 T 细胞，反之，如果该细胞表面的 TCR 能有效识别 MHC I 类分子，则会发育成 CD8 T 细胞。而按照胞内信号的假说，TCR 信 号的特性和强弱决定了 DP 细胞向 CD4+或 CD8+SP 细胞的分化方向:如果 TCR 信号持续而 140 较强，T 细胞就会向 CD4+方向分化;反之，如果 TCR 信号短暂而微弱，T 细胞就会向 CD8+ 方向分化[17]。近期的研究阐明了 CD4+和 CD8+T 细胞分化的分子机制。转录因子 ThPOK 和 Runx3 的特异性表达决定了双阳性胸腺 T 细胞在完成了阳性选择后是向 CD4+还是 CD8+方向 发育。ThPOK 是指导 DP 细胞向 CD4+ SP 细胞方向分化的决定性转录因子，ThPOK 基因 敲除会使得原本向 CD4+方向分化的 T 细胞转而发育成 CD8+细胞，而该基因的过表达则可 145 使 CD8+细胞转而分化为 CD4+T 细胞。反之，Runx3 是向 CD8+T 细胞分化的关键驱动因子， 它的缺失会使一些原本沉默的 CD4+T 细胞特异性因子，如 CD4 重新表达于 CD8+T 细胞， CD8+T 细胞的细胞毒性功能也受到影响[18-20]。 4 阴性选择 在经历了阳性选择后，T 细胞还将在胸腺髓质经历阴性选择，T 细胞表面的 TCR 会与 150 胸腺树突状细胞和胸腺髓质上皮细胞上的自身 MHC-抗原肽复合物相互作用。如果表达的 TCR 与自身 MHC-抗原肽复合物以过高亲合力结合，则该 T 细胞会被诱导凋亡(阴性选择)， 以适当(中等)亲合力结合者则转而发育成具有抑制活性的调节性 T 细胞。只有表达具有 和自身 MHC-抗原肽低亲合力结合能力 TCR 的 T 细胞才能存活并成熟[21]。阴性选择能保证 进入外周淋巴器官的 T 细胞库中不含针对自身抗原成分的 T 细胞，这是 T 细胞获得中枢免 155 疫耐受的主要机制。 4.1 阴性选择也由 TCR 信号决定 一般认为，在阴性选择和阳性选择的决定过程中，低亲合力配体激活 TCR 时，导致 Erk 激酶的活化，是 T 细胞阳性选择中所必需的信号。所以，Erk 基因敲除会导致 T 细胞发育阻 断在双阳性阶段;而高亲合力配体对 TCR 信号的激活，能使 Jnk 和 p38 激酶的活化，促使 160 22-24] T 细胞走向凋亡(阴性选择)[4, 。现有的理论亦认为，强度不同的 TCR 信号诱导 LAT 分子不同位点的磷酸化，从而决定下游信号途径的选择性激活，进而决定 T 细胞最终能够 继续存活还是走向凋亡(图 3)[25]。 -5- 图 3 T 细胞选择模型 165 从目前已知的理论来看，胸腺细胞的阳性选择主要是靠自身抗原肽与配体低亲合力的结 合，引起 TCR 信号和下游 ERK 的活化，从分子水平来研究信号通路，目前认为: TCR?Lck?Zap-70?LAT?PLCγ1?DAG?RasGRP?Ras?MEK?Erk?Egr-1?Id3。而阴 性选择相对比较难以研究，包括了不同的分子在不同发育阶段都有可能发挥不同作用。 170 Nami McCarty 等报道，MINK 是胸腺细胞阴性选择所必 MINK 是丝氨酸-苏氨酸激酶， [26]， MINK 能与接头蛋白 Nck 相互作用，直接激活 TCR 信号介导的 Jnk 的活化，上调 需的 Bim 和 BimEL 促凋亡蛋白。同时 ERK5 也是阴性选择所必需的，ERK5 能激活转录因子 Nur77，与 Bcl-2 相互作用，促使 Bcl-2 转换成促凋亡分子。下游的促凋亡分子 Bim 也被认 为是阴性选择过程中促使自身反应性 T 细胞凋亡所必需的分子， Bim-/-小鼠阴性选择发生 175 [27] 障碍 。 4.2 阴性选择与自身抗原 有效的阴性选择依赖一个重要的前提条件，那就是自身抗原肽能在胸腺髓质中存在。而 胸腺自身抗原的来源一直以来是该研究领域的争论焦点之一。目前研究发现 AIRE 180 (autoimmune regulator)基因能够调节胸腺髓质上皮细胞表达仅存在外周的自身抗原，从而 诱导与自身抗原高亲合力结合的 T 细胞发生凋亡，产生免疫耐受，它的缺失会使机体产生 自身免疫病 APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy)即 [28]。 自身免疫性多腺体综合征 胸腺树突状细胞(Dentritic cell, DC)是参与 T 细胞阴性选择的重要细胞，Thomas Brocker 等证明特异性表达 MHCII 分子的 DC 能够清除能与自身抗原反应的 CD4 T 细胞，而不参与 185 阳性选择[29]。同样的，DC 缺陷小鼠由于正常的阴性选择不能进行，会产生大量非自身耐受 的 CD4 T 细胞，输出到外周，引起严重的自身免疫病[30]。 190 -6- 4.3 阴性选择的主要模型(6 种) 模型 发育阶段 优点 缺点 不能模拟 MHC/抗原肽复合物引 简单，经济 体内注射 anti-CD3 DP 起的 TCR 信号;会产生非特异性 的 DP 细胞死亡 不能模拟 MHC/抗原肽复合物引 内源性超抗原 配体自然存在， DP?SP 起的 TCR 信号;品系杂交使鉴定 (Vβ8.1) 可用 Vβ8 特异性抗体检测 基因敲除的效果变难 会产生非特异性的 DP 细胞死亡; TCR 转基因小鼠在体 许多模型可获得 在缺乏基质细胞时可能会有不同 DP 内或体外用多肽处理 的响应 TCR 的表达以及与配体的结合早 配体自然存在， TCR 转基因小鼠有内 于正常小鼠;可能会产生非生理的 DN?DP 许多模型可获得 源性配体(HY) 结果 配体自然存在， TCR 转基因小鼠有内 可能会产生非生理的结果 DP?SP 许多模型可获得 源性配体(6.5) 需要特定的细胞群;不是所有 接近正常 TCR， TCRβ 转基因小鼠有 DP 的 TCRβ 转基因小鼠都足够高的 表达在特定时期 内源性配体(5C.C7β) 四聚体频率足以研究 DP 细胞 5 结论 195 综上所述，依据目前研究报道，T 细胞的发育过程主要包括功能性 TCR-CD3 复合物的 表达和随后的阳性选择和阴性选择。这个过程十分复杂且高度有序，需要精细的时空调控， 其具体机制仍没有得到完全阐明，而且至今已报道的研究模型也未得到直接验证。今后仍需 要开发和利用新的研究手段，包括大规模筛选等，寻找新的 T 细胞发育相关基因，探索新 的发育机制，以及研究胸腺微环境对于 T 细胞发育的影响，从而为免疫相关疾病如自身免 疫病以及免疫缺陷疾病的深入研究奠定基础。 200 [参考文献] (References) [1] Zhu, J. & 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