孕酮对卵巢去势大鼠的神经保护作用（可编辑）

孕酮对卵巢去势大鼠的神经保护作用（可编辑） 孕酮对卵巢去势大鼠的神经保护作用 ? 论文作者签名: 指导教师签名: 论文评阅人: 评阅人: 评阅人: 委员会主席: 盆丞压』敛援』土渔銮通太堂基趟医堂院 委员: 一 工垂堡』数援』回溘太堂医堂瞳一 委员: 吐堂揸』数援』浙江太堂生邀堂暄 答辩日期: 生月鱼旦浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经 发 或撰写过的研究成果,也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构的学位或证 书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者始嘶撕期:少辨多月?日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅.本人授权浙江太堂可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名: 导师签名:/勿莎‘巧. 学位嚣荔,蔫纂翻械榔:疡豸。驽. 况耨 ?日 ;月日 签字日期: 签字日期:沙年 ?年弓月致谢 浙江大学硕上学位论文 谢 致 本论文是在方马荣老师和韩曙老师的悉心指导下完成的,从课题的设计、技 术路线的构思、实验工作的开展,到论文的撰写,自始至终都得到了两位老师的 细致关心和指导。他们实事求是的科学态度,严谨的治学态度以及对工作认真负 责和诲人不倦的精神都给我留下难以磨灭的印象,使我受益良多。在此向他们表 示衷心的感谢和深深的敬意。 其次要感谢凌树才老师,和实验室周婧、徐麟浩、尹一飞、黄检英、韩飞、 何大强、孙雅谊、杨静、李贵发等众多师兄妹给予我的无私帮助,与你们相处的 日子将令我终生难忘。 藉此机会特别要向我的家人表示感谢,他们一直以来的关心和支持是我前进 路上最大的动力,也是我克服困难的最坚实后盾。 最后再次感谢所有关心支持我的老师,亲人、同学和朋友。 王静 年月日浙江大学硕.学位论文 摘要 孕酮对卵巢去势大鼠的神经保护作用 浙江大学医学院 人体解剖与组织胚胎学 硕士研究生 王静 导 师 方马荣 摘 要 目的:妇女在绝经期后,激素丧失会使认知能力减退,有研究提示激素替代治 疗 玎能减少痴呆发病的风险,改善脑部功能退化、延缓或预防的发生. 雌激素和孕酮的保护作用已被广泛用于各种实验模型。本研究的目的是探讨 孕酮 对卵巢去势大鼠学习记忆的作用及其机制。 方法:月龄健康雌性大鼠只.随机分为六组:正常组、卵切组、卵切孕 酮组、卵切芝麻油组、假手术孕酮组及假手术芝麻油组。孕酮组皮下注射孕 酮 /、芝麻油组皮下注射等体积的无菌芝麻油;以后每天给药次,共 次。给药周后采用水迷宫进行学习记忆能力检测,用免疫组化和 方法检测.、.、.、.和? 蛋白在海马神经 元中的表达水平,同时,用透射电镜和州分别观察大鼠脑中海马神经细胞的 超微结构和细胞凋亡情况。 结果:.水迷宫潜伏期结果显示,卵巢切除去势后逃避潜伏期明显延长 .、平台次数明显减少.,外源性孕酮使逃避学习成绩明显提高 .、找到平台的次数稍有改善.. .免疫组织化学结果可见,正常组、卵切孕酮组和假手术组的免疫反应强 度比卵切组、卵切芝麻油组弱.,免疫反应阳性细胞数少于卵切组,卵 切芝麻油治疗组,有统计学意义。正常组、卵切孕酮组和假手术组的. 浙江大学硕上学位论文 摘要 免疫反应强度比卵切组,卵切芝麻油治疗组弱.。正常组、卵切孕酮治 疗组和假手术组的..免疫反应强度比卵切组,卵切芝麻油治疗组强 .。正常组、卵切孕酮治疗组和假手术组的.免疫反应强度比卵切组、 卵切芝麻油治疗组强.。正常组、卵切孕酮治疗组和假手术组的 免疫反应强度比卵切组,卵切芝麻油治疗组弱.。 .结果显示,卵切组与正常组相比,灰度值较高.,卵切 孕酮组与卵切组比较,灰度值明显低.。卵切组与正常组比较,的 灰度值明显低.,卵切孕酮组与卵切组、卵切芝麻油组比较,灰度值 明显强,分别.和.。卵切组与正常组比较,一的灰度值明显高 .,卵切孕酮组与卵切组,卵切芝麻油组比较,灰度值明显低,分别 .和.。 卵切组与正常组比较,..的灰度值明显低.,卵切孕酮组与卵切组, 卵切芝麻油组比较,灰度值明显强,分别.和.。卵切组与正常组比较, 的灰度值明显高.,卵切孕酮组与卵切组比较,灰度值低 ’ .。 .州染色显示卵切孕酮,假手术组的凋亡细胞比卵切组明显少.. .电镜结果显示: 正常组,非卵切孕酮组和非卵切芝麻油组:突触数量比较多,结构清晰突触 前膜和突触后膜清晰,两膜之间有明显的突触裂即突触间隙,突触后膜有致 密的 电子物质,还可见很多线粒体,并且细胞器结构完整。 卵切组和卵切芝麻油组:可见突触部分变性,数目减少,突触间隙增厚,突触 后 膜致密物质变弱,细胞器变形,突触前终末内线粒体混浊肿胀。 卵切孕酮组,突触后膜的致密电子物质增强,细胞器完整。 结论:孕酮能明显缩短潜伏期,增强空间探索能力,降低、.和 ,升高.、一在大鼠海马内的表达,减缓神经细胞凋亡,维持 神经元的存活率,起到改善大鼠学习记忆的功能,提示孕酮在改善脑部功能 退化、 延缓或预防发生等力面具有治疗作用。 关键词孕酮,卵巢切除,凋亡,神经保护,。认知功能 时 ‰ 柚 啦 : 姗 . 王江 , ‰ ., , ., 仃 . 谢 丑’. 巧 : ?, , 啪 : 肌,, 撕,锄 ,锄 锄,锄锄.锄 硒 , 锄 /,恤锄 坷锄 , 眦.、耽 . ,?,一’,锄 切『 ? 锄仃锄 ,龇锄 , 觚 锄臼. : 咖 勰蛳 仃 浙江大学硕:学位论文 . .仃 、? .. 印 锄. . . 蛐 姗、 .眄 、锄、锄. , 】 肌、 、 锄、 . 一 锄. 啪 . 、、锄、 锄、? . . 、? 、】【、. . 啪 肌、、锄、锄 、, . . 、?. 。 一 ;. . 咖 锄 硒 ., 嬲 肌 .. 锄 ., 尸. .胁 .伊 :., 、? 也 锄曲 . .. ? . . . . 印 锄 、? .. . : 觚, 、?, 撕 ,, :, 、. 、锄, , ,鼬 , 们, .,玛 浙江大学硕二卜学位论文 ., 伊 ,唱锄 够 锄 : , . 只?柚 , 仃,一 锄,? 印, ,, 锄 . ’ 锄锄 巧. , 锄 缩略语 浙江大学硕上学位论文 缩 略语 缩写 英文全称 ’哑姆浙江人学硕上学位论文 目次 目 次 致谢 摘要?.??。 缩略语?? 目次 引言?. 材料和方法??. .材料和仪器 .实验方法? 实验结果??. .行为学实验结果一 .电镜结果. .免疫组化结果?一 . 结果?。 . 检测? 讨论??. 结论??.. 参考文献. 综述。 作者简历及在读期间所取得的科研成果??.引言 浙江大学硕上学位论文 孕酮对卵巢去势大鼠的神经保护作用 浙江大学医学院 人体解剖与组织胚胎学 王静 硕士研究生 导 师 方马荣 引言 每年大约有万妇女面临着预防性双侧卵巢切除与子宫切除的手术【】。 “对卵巢切除术和老龄化的研究发现,在自然绝经前移除双侧卵巢的妇女得 帕 金森综合症的风险增加,还会出现认知障碍或痴呆,抑郁和焦虑等症状‘。。 因 此,近年来科学家们对性类固醇激素雌激素和孕激素在认知功能效果的研究 方面产生了很大的兴趣,部分临床研究结果表明,绝经期后激素水平的降低可能 与记忆下降有关舯。所以用激素替代治疗法来降低痴呆的发病率成为一种 趋势。强等【删发现,卵巢切除后的雌性小鼠,通过服用雌激素合剂,预防了 对脑血管的损害作用。 近年研究表明,性类固醇激素孕激素、雌激素在神经系统内发挥促进神 经元成活和维持神经功能的多种作用.雌激素对大脑记忆的影响已得到广泛的研 究。但是孕酮对于海马生理上的研究确实很少。传统认为孕酮只与生殖有关,但 一系列实验发现孕酮对急性中枢神经系统损伤有保护作用,包括对脑外伤、中风、 缺氧性脑损伤、脊髓损伤的保护作用【,减少水肿【的作用,促进行为恢复的作用 【,还有减少氧化应激,保持膜稳定性的作用【?。孕激素可提高实验鼠的空间方位 认知、学习及长期记忆力,研究表明,应用孕激素类药物能减少患的危险【。 另有研究表明,孕酮在不同的神经变性动物模型中能防止神经元的减少。但有关 孕激素对脑损伤动物模型的学习和记忆影响,不同的动物模型研究结果不尽相同浙江大学硕十学位论文 引言 并缺乏深入的机制研究。这些研究成果令研究者们很困惑。以往的研究表明,孕 酮能增强中年和老年女性的记忆能力【】。但是对于年幼的大鼠却鲜有报道。而且 孕酮剂量的不同,效果也不同,中低剂量的孕酮对衰老脑有神经保护作用,但是 高剂量/反而是有害的。有文献报道高剂量孕酮/对内侧额 叶皮质挫伤没有保护作用【。 实验中,之所以成为研究指标之一是因为是星形胶质细胞中的一 种标志蛋白,它参与神经元内环境的维持和血脑屏障.在脑损伤的炎症中会出现 以胶质纤维蛋白为特征的纤维化,这种纤维化形成“疤痕”,有隔离和控制细胞 外液离子和分子成份如,神经递质等的作用。表达增强,提示星形胶 质细胞增生,星形胶质细胞增生肥大,是脑损伤的常见反应,有时甚至先于神经 元改变,目前已被公认为脑损伤的早期指标。而细胞凋亡无论在正常中枢神经系 统的发育中,还是在神经退行性疾病的发病机制中【删,都有不可或缺的作用。 大量研究表明,慢性应激会在重性抑郁症的发病进程中【产生应激诱导的变化, 包括大脑皮质的萎缩、功能障碍等。现有的文献业已证明慢性应激能够伴随神经 退行性病变,激活细胞凋亡.因此,我们的一个研究重点是探讨这种卵巢去势创 伤是否会对细胞凋亡进程造成影响。一是多种凋亡途径的共同下游效应部 分,为细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。加等认为凋亡可能就是 蛋白酶级联反应切割底物的过程,.受上游蛋白酶的切割活化,活 化的唧一又切割活化下游底物,参与断裂和核固缩现象的发生,其在凋 亡过程中起着决定性的“总阀门”作用。卢节平等观察到后神经元和胶质细胞 均可见.阳性表达。目前认为.基因是与缺血性脑损伤后细胞凋亡关系 最为密切的凋亡基因。在细胞凋亡的过程中,.家族起着重要的作用。.家 族是哺乳动物细胞中调节凋亡的重要因子,主要是通过调节线粒体或内质网等细 胞内膜结构的通透性,改变与细胞生理功能密切相关的离子或蛋白质因子在细胞 内的分布,从而影响细胞的生命活动过程【。另外,.作为神经递质,主要分 布于松果体和下丘脑,可能参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节。中枢神经 系统中一在人类和动物的精神及行为学调控方面也起着举足轻重的作用,有研 究发现中央执行功能、工作记忆和空间认知能力等人类认知能力受多巴胺、 谷氨 浙江大学硕十学位论文 引言 酸和一羟色胺递质系统中一些编码受体、转运体和酶的有关基因的影响。等 【蜊的细胞学实验表明,..受体激动后通过释放二酰基甘油增加可溶性淀粉样 前体蛋白锄 ,的分泌,而淀粉样蛋白 ,的发生、发展中有着重要 .,在阿尔茨海默病. 作用,所以..成为我们实验中的一个重要指标。同时,.是广泛存在于 真核细胞内的一种很重要的转录因子,调控许多炎性和凋亡相关基因的表达,从 而调控炎症反应、免疫应答、细胞增殖、分化和凋亡等重要的病理生理过程,对 临床许多疾病的发生及发展起重要的作用。但目前其具体的转录机制不是十分清 楚。近年来,许多实验都证实在中枢神经系统中,尤其是在发生神经退变的部位 可以检测到被特异激活的.,但是关于?的活化究竟是参与神经退变还是 神经保护机制,一直争论不休,所以我们把.作为实验指标之一,探讨基于 .途径的一些有望应用于临床的治疗措施。 因此,本研究的目的是探讨外源性孕酮对三月龄大鼠学习和记忆的作用。卵 巢切除是为排除内源性卵巢激素的影响,我们用卵巢切除诱发记忆障碍的 模型来观察孕酮的疗效;浙江大学硕:学位论文 材料和方法 材料和方法 .材料和仪器 ..材料 雌性大鼠,购于浙江大学动物中心。饲养环境:昼夜循环周期为:: 开灯,:关灯,自由饮水饮食,室温士?.适应一周后,正式开始实验, 所有的动物实验的操作程序均遵守浙江大学动物管理委员条例。 无菌芝麻油、多聚甲醛、水合氯醛、戊巴比妥钠、,.丙二醇、甲醇、乙醇、 乙醚、溴酚蓝、甘氨酸、二甲苯、明胶、中性树脂、甘油、琼脂糖、乙酸、 焦油 紫、、、、、、、酚红、、、 嘶 .、晡、、.、、?等均为国产纯,实验室常备。 ..主要试剂 名称 公司 .之公司 丙烯酸胺溶液 “公司 ?“公司 过硫酸铵 ?“公司 . “公司 预染蛋白分子量标准破 .公司 蛋白测定试剂盒 .公司 试剂盒 博士德公司 公司 凋亡检测试剂盒 兔.多克隆抗体 博士德公司 兔.受体多克隆抗体 博士德公司 博士德公司 兔.多克隆抗体 博士德公司 兔多克隆抗体 浙江大学硕:学位论文 材料和方法 兔多克隆抗体 博士德公司 标记的二抗抗兔 博士德公司 ..主要试剂配制: 名称 配方 缓冲液 .; .; .; . 加 定,容至 ., 。 缓冲液 临用加.% % 在水中溶解,加热至?溶解, 加定容至高压灭菌。 .;搅拌混匀后,加 /%?. .; 入浓盐酸约.,调至.,定容至 。 / ;搅拌混匀后, . .; 加入浓盐酸约砌,调至.,定容至 。 .电泳缓冲液 .; 甘氨酸.; ;加 定容至。 ...电转缓冲液 .;甘氨酸.; .;甲醇 加定容至。 封闭液 ,混匀。 脱脂奶粉,加至 . ? . .; ×上样缓冲液 .或 矸 巯基乙醇./.;甘;溴酚蓝.; 加定容至。 % ,混匀。 过硫酸胺, / .; 蛋白裂解液砌 ‘. .; 删. .;蒸馏水至;混匀后?保 浙江大学硕::学位论文 材料和方法 存,使用时,加入至终浓度为肛‖同时 加入 印。 牛血清白蛋白 . ,加 .胎牛血清白蛋白溶于 “?,混匀。 枸橼酸缓冲液 ;溶 溶液:枸橼酸钠.溶于 十 液:枸橼酸 .溶于 混匀,得到.枸橼酸缓冲液。 多聚甲醛 多聚甲醛,温热一?的蒸馏水约 ,加入适量助溶,搅拌至透明;加入 .的 ,调节值至.?.,蒸 。 馏水定容至 甲醇.溶液 %的 ,加入纯甲醇中,充分混 匀即可,使终浓度为%。缓冲液 .; .; .;.,加定容至。 缓冲液 临用加.%。 % 在水中溶解,加热至?溶解, 加定容至高压灭菌。 .; .; 儿. 搅拌混匀后,加入浓盐酸约.,调至., 定容至. /;搅拌混匀后,加 ?. .; 入浓盐酸约,调至.,定容至。 .电泳缓冲液 .; 甘氨酸.; ;加 定容至。 电转缓冲液 .;甲醇 .;甘氨酸.; ... 加定容至。 材料和方法 浙江大学硕士学位论文 封闭液 ,混匀。 脱脂奶粉,加至 . ? . .; ×上样缓冲液 .; 行 或巯基乙醇.‖. ;甘油;溴酚蓝 。 加定容至 .; % ,混匀。 过硫酸胺, / 蛋白裂解液砒 ?..; .; . .瑚;蒸馏水至;混匀后? 保存,使用时,加入至终浓度为咖 同时加入 印。 . 牛血清白蛋白 ,加 .胎牛血清白蛋白溶于 .,混匀。 枸橼酸缓冲液 ; 溶液:枸橼酸钠.溶于 ; 溶液:枸橼酸.溶于 混匀,得到.枸橼酸缓冲液。 多聚甲醛 多聚甲醛,温热??的蒸馏水约 ,加入适量助溶,搅拌至透明;加入 .的 ,调节值至.?.,蒸 馏水定容至。 甲醇一溶液 %的,加入纯甲醇中,充分混 匀即可,使终浓度为%。 ..主要仪器设备 全自动高压灭菌锅,,印 电热恒温干燥箱,,咖 电子天平,,,姗 磁力搅拌机,一, 微波炉,, 制冰机,,协 浙江大学硕上学位论文 材料和方法 高速冷冻离心机, ., 台式普通离心机,肌 电泳仪、电泳槽,., 微量移液器,..,.,., 伯乐酶标仪, ., 纯水仪, , 录像机,, 荧光显微镜,,肌 , 红外成像系统,. 栅。超低温冰箱一?,, 水迷宫 透射电子显微镜日立. .实验方法 ..双侧卵巢切除术 三月龄健康雌性大鼠只,体重士,随机分为组,每组各 只.只大鼠行卵巢切除术:采用复合麻药./的剂量对大鼠 进行腹腔注射麻醉后,大鼠仰卧位,沿下腹部正中线剪开腹部皮肤切开肌肉, 开 腹,切口约... ,找到字型子宫,沿子宫找到卵巢,结扎并切除双侧卵 巢后缝合腹腔。只进行假手术,手术流程同卵巢切除,只是不切除卵巢。 正常组,不作任何处理 卵切组 假手术组,给予皮下注射芝麻油 假手术组,给予皮下注射孕酮 卵切组,给予皮下注射芝麻油 一 卵切组,给予皮下注射孕酮 ?.: 动物在术后分别给予等体积的芝麻油和孕酮/【,以后每隔七天给材料和方法 浙江大学硕:学位论文 药一次,一共四次。给药三周后做水迷宫实验,后处死取海马。 .. 盯水迷宫 术后周做水迷宫实验。水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的站台 组成。水池高,直径,站台直径,水池上空有一个数字摄相机,其 与计算机相连接。预先在水池中注入清水,水深,加入碳素墨水使池水变为 不透明的黑色,站台表面为黑色,使小鼠不能看到,水面高出站台表面.。水 温控制在士.?,在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置 于离入水点较远的象限中间,实验过程保持站台位置不变。每次实验以为限, 记录动物从入水点到达站台所需的时间以及穿越平台的次数,若在设定时间 内未 找到站台,计算机停止跟踪,记录时间为。每次实验在隔音的房问内进行, 水池,光源,鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。前天训练,若动物在 内找到站台,让其在站台上停留,若动物未找到站台,将其放在站台上使其停 留。于第天进行水迷宫测试。 ..组织固定、取材与切片 玎测试完后,对大鼠进行腹腔注射麻醉,打开胸腔自左心室插入静脉套 管至升主动脉,切开右心耳,快速灌注?生理盐水 左右,待流出的血液变 清时,换用%多聚甲醛约 先快后慢灌注固定约 ,而后取完整大脑组 织。大脑取出后放入%多聚甲醛中?过夜,之后移入%蔗糖溶液中,?放 置待组织块下沉。修整脑块包含海马部分,包埋,冰冻连续切片,片厚 “。 ..免疫组织化学技术三步法 . 冰冻切片,贴附于经明胶防脱处理的载玻片上,?烤片; . 的振荡冲洗;滴加含%的甲醇溶液浸泡,室温孵育,以 阻断内源性过氧化物酶的活性;.洗;滴加正常山羊血清封闭 液,?孵育,甩去多余液体;分别滴加不同的稀释于.%的一抗 。用代替一抗作为 、、.、.、.:: 阴性对照,置于湿盒中?孵育过夜;次日上午取出切片,.振荡洗涤 ;滴加稀释于.%的标记的二抗工作液:,?孵育 浙江大学硕上学位论文 材料和方法 ;.振荡洗涤;显色:取显色试剂盒中的、、 试剂各一滴,加入蒸馏水中,混匀后加至切片,室温下显色,显微镜下控制 反应时间,略显棕黄色阳性染色时,自来水冲洗,终止反应;一系列酒精脱水, 二甲苯透明:%乙醇一%乙醇一%乙醇一%乙醇 ?一无水乙醇呻无水乙醇?一二甲苯.二甲苯 一中性树胶封片;光学显微镜下观察并照相.光学显微镜下观察结果, 胞浆为棕黄色者为阳性细胞,否则为阴性细胞。高倍视野下×,每张切片 相同区域个视野,记数平均阳性细胞数。 ..脑组织匀浆 取大鼠新鲜脑的海马区组织约,于冰上用蛋白裂解液匀浆. 岬离心,吸取上清,即得到提取的全蛋白。一?保存. 法测定蛋白浓度 根据样品数量,按体积试剂加体积试剂:配制适量 ‘ 工作液,充分混匀. 完全溶解蛋白标准品,取用稀释至,使终浓度为./。 将标准品按,,,,,,,“加到孔板的标准品孔中,加 液补足到. 加适当体积样品到孔板的样品孔中,加用于去离子水到?. 各孔加入工作液,?放置。 测定,根据标准曲线计算出蛋白浓度。 调整蛋白质浓度至‖,每个泳道上样量约为. 一聚丙烯酞胺凝胶电泳.. 正确安装电泳装置。 按下表制备分离胶和浓缩胶。 .配置%分离胶: %胶成分 块胶 材料和方法 浙江大学硕士学位论文 将上述分离胶混匀,灌注于立式电泳仪两层玻璃板之间,留出灌注积层胶所 需 空间,在胶上轻轻覆盖一层蒸馏水,室温垂直放置直至聚合。 .配置浓缩胶: %胶成分 块胶 . 去离子水 . %巧锄 %. . % 聚合后,待聚合完全,倒出顶层蒸馏水,用滤纸吸干,灌入浓缩胶,并立 即插入梳子,动作轻柔,避免形成气泡。浓缩胶聚合后,移入电泳槽中,小心移 出梳子,在电泳槽中贮满%一甘氨酸电泳缓冲液,排出气泡。 ?煮沸,使蛋白质 取待测样品加入等量上样缓冲液,连同冰 变性。冷取后,加入加样孔内. 电泳:连接电源,以电压电泳,然后以电泳约,当样品电 泳至分离胶底部时,断开电源,将凝胶取出。 转膜 矾锄滤纸。将膜、滤 电泳结束后,剪一张大小合适的膜和张 纸在转移缓冲液中浸泡,将海绵彻底浸泡,赶走空隙中的气泡。将转膜电泳 仪的转膜夹子用转移缓冲液涂湿后,将海绵、滤纸、膜、凝胶、滤纸、海绵 浙江大学硕十学位论文 材料和方法 依次叠放于夹板上,保证海绵、滤纸、膜和凝胶精确对齐,排出气泡,盖好 上盖,连接电极,膜一侧接正极,凝胶一侧接负极,冰上电转移. 封闭 转移结束后,取出膜做好标记,用. 洗次,加入封闭液,室温 封闭。 杂交 一抗孵育:将膜放入孵育盒中,加入%牛奶稀释的一抗;; ;一.;;::,?过夜。洗膜次,每次。 二抗孵育:将膜放入塑料袋中,加入%牛奶稀释的二抗,稀释比例:, 于摇床上室温孵育,洗膜次,每次。 .显色材料和方法 浙江大学硕上学位论文 ..统计分析 .版统计学 所有数据均以平均值士标准差士..表示,应用 软件处理,各组数据比较采用单因素方差分析检验,以.为具有统计学意 义。浙江大学硕:仁学位论文 实验结果 实验结果 .行为学实验结果 水迷宫潜伏期的结果显示:卵切组潜伏期时间最长,卵切芝麻油组次之,其 他各组潜伏期较短。其中卵切孕酮组与卵切组.,卵切孕酮组与卵切 芝麻油组.之间有显著性差异,有统计学意义。卵切孕酮组与正常组 .、卵切孕酮组与假手术孕酮组.之间无差异,孕酮治疗后 的大鼠记忆能力恢复的很好。见表,图 表 各组大鼠的水迷宫平均潜伏期秒士 组别 潜伏期士 正常组 .士. 卵切组 .士. .士. 卵切孕酮组 .士. 卵切芝麻油组 .士. 假手术孕酮组 .士. 假手术芝麻油组 幽正常 瞄卵切 ? 自卵切孕酹 皿衄卵切芝麻油 蒙 眩翻缓手术孕酮 摹 寰 墨墨缎手术芝麻油 霹 势 掌‘.?.惦,%‘..,, 《..。.协,?《.霉.?心琵 图:各组潜伏期比较 穿越平台次数的结果显示:卵切组穿越的平台次数最少,卵切芝麻油组次之, 实验结果 浙江大学硕:学位论文 其他各组穿越的平台次数较多。其中:卵切组和正常组.,卵切芝麻 油组和正常组.,卵切组与卵切孕酮治疗组.,有统计意 见图 义。 耄 ? 静 ? 芎 ‘ : 穸??,?, 图:各组穿越平台次数比较 .电镜结果 电镜结果显示:见图 正常组,非卵切孕酮组和非卵切芝麻油组:突触数量比较多,结构清晰突触 前膜和突触后膜清晰,两膜之间有明显的突触裂即突触间隙,突触后膜有致 密的 电子物质,还可见很多线粒体,并且细胞器结构完整。 卵切组和卵切芝麻油组:可见突触部分变性,数目减少,突触间隙增厚,突触 后 膜致密物质变弱,细胞器变形,突触前终末内线粒体混浊肿胀。 卵切孕酮组,突触后膜的致密电子物质增强,细胞器完整。浙江大学硕上学位 论文 实验结果 .. 受体的表达与分布 阳性星形胶质细胞外形似树根状,中央为胞体,由胞体向四周伸出许多 突起,用染色法显色后,胞体和纤维突起均呈棕褐色,细胞核的位置着色较 淡。 正常组、卵切孕酮组、假手术组海马区可见少量阳性细胞,突起细长, 胞体形态不清晰,如细长蜘蛛,呈散在分布;卵切组和卵切芝麻油组?心阳性 细胞表达量多,均表现为胞体增大,染色加深,分支突起增多,变粗图,六 组所观察到的细胞数结果图显示,正常组、卵切孕酮治疗组和假手 术组的免疫反应强度比卵切组,卵切芝麻油组弱.,免疫反应阳性 细胞数少于卵切组,卵切芝麻油治疗组,有统计学意义。 譬鼍::霹::》?霉鼍 ” ,‘’ ’,。 .’.’? 飞.夥 。。,,?.。‖、.?擘 誊巍..薅 分。一..。’?‘。‘:?: 萎:。多?‘父。‘‘《 毛夕 矿‖‘.?:。一’ 图各组的免疫组化阳性结果阪 :正常组;:卵切组;:卵切孕酮组; :卵切芝麻油组;:假手术孕酮组;:假手术芝麻油组 奠皇蕾正常 盥卵切 《 昌卵切孕酮 翟 衄田卵切芝麻油 器 正 眩墨假手术孕酮 ? 墨墨假手术芝麻油 .垤.× 埋鼍?,竺.,%叼..,, ,. . 图各组的免疫细胞柱状图 .. 嬲鼬受体的表达与分布 一免疫反应阳性产物为棕黄色,苏木素复染,细胞计数发现,正常组、卵 应强 度比卵切组,卵切芝麻油治疗 切孕酮治疗组和假手术组的一免疫反 组弱.,免疫反应阳性细胞数少于卵切组,卵切芝麻油治疗组见图 和。 。 ,:。:. ..?‘ 。.: ’ .?.’ . .?。. :. . .‘: ?, :::乙.。妊。.“?。盎.?。《 ~埘 ‘‘‘‘妊?.?赴最:,“氨州譬 图 各组的躯?.免疫组化阳性结果 :正常 组;:卵切组;:卵切孕酮组 :卵切芝麻油组;:假手术孕酮组;:假手术芝麻油组实验结果 浙江人学硕.:学位论文 幽正常 皇宙卵切 目卵切孕酮 也?卵切芝麻油 弦盘假手术孕酮 墨盘假手术芝麻油 ..屯.一.丘曩一叩.曩一 稃..,%..×,,《.. ,‘..× 图各组的鼬.免疫细胞柱状图 .. .蛋白的表达与分布 一免疫反应阳性产物为棕黄色,细胞计数发现,正常组、卵切孕酮 治疗组和假手术组的.耵免疫反应强度比卵切组,卵切芝麻油治疗组强 .,免疫反应阳性细胞数多于卵切组和卵切芝麻油治疗组见图和。 器善器?露 萋,葛’ ’,歹;:,』:;笺 妙‘..毒.。.,.笆’霉 翳.’:。.?蔫 》?:一.。‘’..:.,.一.:委 萝’:’专?;:.:’三?:差 意 山瓤江矗.勉矗螽 浙江大学硕:学位论文 实验结果 幽正常 圈卵切 昌卵切孕酮 簟 誓 吐曩卵切芝麻油 焉 弦盔假手术孕酮 毒 墨墨假手术芝麻油 啊 却?国.们垤正常,巾‘.们垤卵切,.国.卵切孕酮,%田.垤卵切芝麻油 图各组的.免疫细胞柱状图 .. 蛋白的表达与分布 .免疫反应阳性产物为棕黄色,细胞计数发现,正常组、卵切孕酮治疗 组和假手术组的.免疫反应强度比卵切组、卵切芝麻油治疗组强., 免疫反应阳性细胞数多于卵切组、卵切芝麻油治疗组。见图和。’ ?弘、”盯’一‘了??.’:: ’ ???‘聪群?譬零黔叩 ’ ’’ ., 、 ’。 》, :‖:?’ ;象, ’ ’. 一‘。 咤 .。,‘潭一 :’’ ‖’.?一:。稚,,,‘ 至’ 钐. , ’.、 . :.‘ ?? :. ’ : ’’ 一 ‘ ~ 酽.? . 知 .‘。; ? , . 管, ~.. ,. .:知 。,.矗健。。屯麓二?。魁勰 话理?々磐爰墓镶蓬盛 害 “ :?童毛蜘,私 稿‰ , 工 ?~ 寸 .吁 。’‘;.,翟 ’ . ‘. 、磕 ?一翼 . ’ ‘ ” ? 一, ? . ? ? ? 警. ?、~ , . ’’镭 ’ .《 ‘ ’麓 ‘ ’ 德 。 . 、 .’‘ : 。, ”.罐 《’。矗 ‖.?? 。,?,,慧?‘‖、。 ,、.。;. 图各组的.免疫组化阳性结果 :正常组;:卵切组;:卵切孕酮组; :卵切芝麻油组;:假手术孕酮组;:假手术芝麻油组 衄正常 嘲卵切 目卵切孕酮 可 血?卵切芝麻油 ? 艺囱假手术孕酮 量 墨图馁手术芝麻油 弓 襻‘.垤.%.垤.×, .垤.×’.垤.硎 图各组的.免疫细胞柱状图 .“。、瓤浙江人学硕.学位论文 实验结果 .. 蛋白的表达与分布 ’‘’‘;一.《 譬‘?‘?爹笺。?、孓.:曩一?逮 琴簟鬻鬻嚣臻簿鋈辫 陵誊纛?童一撬遂翌 黪溺 蛰一.::‘。, 蠢 疆。一‘』’,一:毒 釜?主?羔蠹薹耋 图各组的出免疫组化阳性结果 :正常组;:卵切组;:卵切孕酮组; :卵切芝麻油组;:假手术孕酮组;:假手术芝麻油组浙江人学硕学位论文 实验结果 蕾?正常 簟 囡卵切 霉 暑卵切孕酮 蒙 筝 皿墨卵切芝麻油 三 弦盔假手术孕酮 置 墨四假手术芝麻油 卸‘.们垤正常,.垤弗切,%昨.们?卵切孕酮 。‘.垤卵切?芝摩油 图各组【免疫细胞柱状图 . 结果 ,染色阳性细胞为棕黄色,位于细胞核内,呈颗粒状,细胞核浓缩。假 手术芝麻油组海马区阳性细胞数极少见;卵切组和卵切芝麻油组海马区阳性 细 胞数明显增多;卵切孕酮组海马区阳性细胞数相对较少。浙江大学硕:学位论 文 实验结果 :卵切组;:卵切孕酮组;:卵切芝麻油组;:假手术芝麻油组 卵切 墨置卵切孕酮 卵切芝麻油 墨衄假手术芝麻油 ,‖/’ 却?国.们垤舅切?旧.们垤鼻切?孕一.%呻.们垤弗切?芝摩? 图各组『阳性细胞柱状图 . 检测 ..四表达量的定量分析实验结果 浙江大学硕上学位论文 幽正常 衄;目切 誊 口羽切孕醑 型 皿皿;切芝嘛油 ? 正 眨盘假手术孕醌 叠 墨对缎手术芝麻油 。 舞文努’ 却‘.?垤正常,%‘.?垤卵切,‘.??赛切芝麻油 图 各组蛋白灰度值比较/? .. .表达量的定量分析 卵切组与正常组比较,.的灰度值明显高,..有统计意义。卵切 孕酮组与卵切组、卵切芝麻油组比较,灰度值明显低,分别.和.,有 统计意义。见图、。 丑‘?‘、? ‘ 一黧荔瀚翳荔缓翳缓缓翳缓缓缓缓缓缓缓缓缓翮 ?幽誓簟誓豳麓?豳誓翻 朔簟?誓鞠?幽?嘲鞠测 图 各组.蛋白表达 图塑坚奎堂堡主兰垡堡奎 实验结果 :::::::: ?????????????????????????????????????????????????一 .. 表达量的定量分析 卵切组与正常组比较,.的灰度值明显低,.,有统计意义。卵切 孕酮组与卵切组、卵切芝麻油组比较,灰度值明显强,分别.和.,有 统计意义。见图、。 鲫?;硼黟?删一”麟‘二 ?嘲麟嗣麟嘲鞠?嘲隧襻蝴黼一 图 . 各组.蛋白表达、 幽正常 衄多母切 口卵切孕醒 掣 衄多日切芝麻油 瓷 眩盟霞手术孕霞 遮 监盘媛手术芝骶油 , ?.、,.鼬,%矿..憾, . , .、噶.. 图 宅 各组蛋白灰度值比较./. .. 一表达量的定量分析 卵切组与正常组比较,一的灰度值明显低,.,有统计意义。卵切 孕酮组与卵切组、卵切芝麻油组比较,灰度值明显强,分别.和., 有统计意义。见图、。实验结果 浙江大学硕十学位论文 姗 ? 脚 篮佃?? 一一 . 图 各组.蛋白表达、 蕾置正常 ?盘雾切 目卵切孕醒 血皿卵切芝麻浊 晕 型 眩盈暖手术孕醌 遂 墨壹霞手术芝麻油 却.。正常,‘.垤卵切.卵切孕酮,,‘‘.垤努切芝赢油 图 各组一蛋白灰度值比较/ .. 表达量的定量分析 卵切组与正常组比较,的灰度值明显高.。卵切孕酮组与卵切 组比较,灰度值低,.。但是卵切孕酮组与卵切芝麻油组没有差异。见 图、。 ?劬;麓缓溺汤磁鳓鹾缓灞鳜黝翰缓缓黪”?穆渤貔汤缴渊 一%;缫缫幽豳缫麓豳?幽缫鞠朔黝绷?缫黝嬲期嬲獭缫黝嬲燃磁 图 各组.蛋白表达