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肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望

2017-09-25 50页 doc 1MB 29阅读

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肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望 前言 肿瘤转移是造成大部分癌症患者死亡的主要原因。近年来,人们对此领域重拾兴趣,对肿瘤转移的相关机制形成了新的见解并在治疗方法上取得了新的进展。此外, 研究人员还构建了多种相关研究模型,并确认了多种信号通路在肿瘤转移中的重要作用。例如,上皮细胞-间质细胞的转换赋予了肿瘤细胞胚胎干细胞样的特性,增 强了它们扩散、存活以及在远隔器官处生长的能力,从而让人们确信肿瘤细胞具有胚胎的特征;另外,原发性肿瘤细胞以及肿瘤转移细胞周围的微环境被看作一个重 要的、潜在的转移性调节因素而有利于确定转移的方向。...
肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望
肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望 前言 肿瘤转移是造成大部分癌症患者死亡的主要原因。近年来,人们对此领域重拾兴趣,对肿瘤转移的相关机制形成了新的见解并在治疗上取得了新的进展。此外, 研究人员还构建了多种相关研究模型,并确认了多种信号通路在肿瘤转移中的重要作用。例如,上皮细胞-间质细胞的转换赋予了肿瘤细胞胚胎干细胞样的特性,增 强了它们扩散、存活以及在远隔器官处生长的能力,从而让人们确信肿瘤细胞具有胚胎的特征;另外,原发性肿瘤细胞以及肿瘤转移细胞周围的微环境被看作一个重 要的、潜在的转移性调节因素而有利于确定转移的方向。 新型基因标签的应用,可帮助人们预测肿瘤的转移倾向并判断肿瘤是否在体内形成,这对于肿瘤转移患者来说,意味着可以更早地获知自身病情的发展趋势, 从而制定最佳的治疗措施。事实上,最近有证据表明,肿瘤发生转移的时间可能比人们预期的要早。因此,抑制促进肿瘤转移的信号通路的疗法或促进其它肿瘤转移 抑制蛋白重新表达的疗法正蓬勃发展。 本期《生命奥秘》选取了几篇关于肿瘤转移与治疗的文章,希望能起到抛砖引玉的作用,给读者带来新的启发。 目录 一、肿瘤转移:从细胞扩散到在特定远隔器官克隆性增殖 二、肿瘤转移抑制蛋白——抗癌治疗新希望 三、miRNA——新型肿瘤转移调控器 四、人体肿瘤平行转移模型 五、转移生态位——适宜肿瘤细胞生长的沃土 六、上皮细胞间质细胞转换机制 上皮细胞获得干细胞表型或恶性变的途径 —— 一、肿瘤转移:从细胞扩散到在特定远隔器官克隆性增殖 肿 瘤能从原发灶处转移至远隔器官,这是大部分恶性肿瘤都具有的一大特征。但是不同的肿瘤,其转移的过程也是各不相同的。从肿瘤细胞的起源、细胞的内在固有特 征、与组织的亲 和力,到细胞在人体内的循环模式,这一切因素都共同决定了肿瘤在人体内传播的范围,以及肿瘤转移至重要器官的过程和转移灶的严重程度。不同 肿瘤的转移过程之间具有如此明显的差异,这让我们想到一个重要问题,肿瘤的转移性状是否也存在进化呢,肿瘤转移的遗传决定因子是什么,又是何种机制对转移 细胞进行选择的呢, 我们通常都把肿瘤的转移过程分成多个步骤。首先,肿瘤细胞从原发灶处脱离下来,在体内传播至另一远隔器官,然后在该部位克隆性增殖形成转移灶。针对 不同的肿瘤,该步骤会出现在不同的器官组织内,出现的速度也有所差异,在临床上采取的治疗方法也有所不同。因此,我们目前面临的问题是如何在现有的肿瘤转 移研究模型中加入多种生物学的因素。 肿瘤转移最为突出的一大特征就是各种不同的肿瘤能在人体内相同或不同的部位形成转移灶(表1)。虽然我们已经找到部分促进肿瘤转移的基因,但到目前 为止还没弄清楚不同的肿瘤细胞是如何利用这些基因,以及在何种程度上利用这些基因,来帮助肿瘤细胞转移到体内同一部位的。有些肿瘤的转移目标器官要比其它 肿瘤特异得多,比如前列腺癌几乎只会转移到骨,而眼黑色素瘤毫无例外地只会转移到肝脏。另一项重要的因素就是肿瘤转移的时像问题,比如乳腺癌和肺腺癌都会 在相同的几个器官,例如骨、肺、肝脏和脑部发生复发,但是这两种肿瘤转移的动力学特性却完全不同。乳腺癌复发通常都发生在几年甚至是几十年之后,但是肺腺 癌通常在几个月之后就会在远隔器官发现新的转移灶。由此可见,肿瘤细胞侵入其它器官的能力并不总是与它们侵入远隔器官之后继续克隆性增殖的能力正相关的。 肿瘤细胞浸润远隔器官与在该处克隆性增殖之间的这段时间差就是临床上所说的转移潜伏期。那么在人体内散播的肿瘤细胞又是如何在新的“领地”开始克隆性增殖 的呢,又是什么使得这些细胞能够在获得克隆性增殖能力之前一直以潜伏浸润的方式生存下来的呢,很多有关肿瘤转移器官特异性的问题与肿瘤起源及其转移潜伏期 之间关系的问题我们都还无法回答,但是最近的科研进展为我们提供了一些线索和科研框架,凭借这些基础,我们将有望解答上述问题。 1. 肿瘤转移的步骤、目的地以及转移过程 我 们通常都将肿瘤转移过程简单地分为以下几个步骤,即局部浸润(local invasion)、渗入血管(intravasation)、随血液循环系统转移并在其中存活、移出血管(extravasation)、在新的部位定 居并增殖。这种概括很好地体现了恶性肿瘤转移行为复杂的生物学过程(图1)。我们已经逐渐弄清楚了上述这些步骤的具体过程,也发现了一些参与肿瘤转移过程 的遗传以 及表型决定因子。其中第一个发挥作用的机制就是基因突变从而导致细胞癌变,即细胞获得了永生能力,可以耐受细胞分裂时发生的错误以及不稳定的基因 组等致死因素,并一直都保持原始表型;同时激发其它细胞的自主性功能,比如转化细胞使其形成肿瘤细胞等等。恶性细胞可能在后来的转移过程当中继续发生致瘤 性突变,因为我们发现,在条件依赖致癌基因Erbb2(也被称为Neu基因或Her2基因)小鼠乳腺癌动物模型中,转移灶会随着该基因的出现或消失而出现 或消退。此外,如果使用ERBB2抗体来治疗ERBB2基因阳性的人乳腺癌患者,则可以提高处于病情无进展阶段患者的存活率。 不过,致癌性转化(Oncogenic transformation)还不足以赋予肿瘤细胞转移的能力,因为在很多致癌性转化的小鼠模型中都没有观察到肿瘤自动发生转移的现象,我们也没有发现 有哪些患者体内的肿瘤散播细胞没有形成转移灶。因此,发生致癌性转化的细胞还必须获得其它的能力才能冲破体内的重重阻力,发生转移。除了在局部形成侵袭性 病灶之外,肿瘤细胞还必须要能够进入循环系统转移到远隔器官。一旦肿瘤细胞浸润到新的组织器官,只要能在该处存活下来,就一定会形成一个侵袭性的克隆,并 逐渐侵蚀整个器官。因此,浸润远隔器官并在此处克隆性增殖,是原发灶肿瘤形成转移灶必须经历的两大步骤,这两大步骤之间的间隔时间,即介入潜伏期 (intervening latency)的时间长短依不同类型的肿瘤而各有差异。 如果说上述这些肿瘤转移过程中依次发生的各个事件是衡量肿瘤转移的一个维度的话,那么肿瘤转移的动力学特性就是衡量肿瘤转移的另一个维度,而肿瘤转 移到的新部位就是衡量肿瘤转移的第三个维度。每一个组织器官的微环境以及它们赖以抵挡肿瘤细胞浸润的屏障都是各不相同的(图2)。因此,从大体上来说,肿 瘤转移的步骤对所有类型的肿瘤来说可能都一样,但是不同的肿瘤要转移到不同的器官则还是需要各不相同的浸润以及定居和克隆增殖能力的,正所谓八仙过海,各 显神通。 2. 肿瘤转移基因 所 有参与肿瘤转移事件的基因大致可以分为以下几类,即转移起始基因(metastasis initiation gene)、转移进展基因(metastasis progression gene)和转移毒力基因(metastasis virulence gene)(图1)。 所谓肿瘤转移起始基因,就是那些在原发灶部位或转移灶部位能促使已转化肿瘤细胞侵入周围组织并吸引支持性间质(supportive stroma)促进肿瘤细胞分散的基因。这些基因能够增强肿瘤细胞的活动力,如促进上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transition, EMT),促进细胞外基质降解,促进骨髓原始细胞动员(bone marrow progenitor mobilization),促进血管生成以及帮助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀灭等。比如EMT过程就受到机体发育过程的调控,而机体的发育过程又受到 一系列转录因子,如TWIST1、SNAI1和SNAI2(也被称为SLUG)等的调控。还有一些因子参与决定肿瘤细胞的浸润,比如肝细胞生长因子受体 (hepatocyte growth factor receptor, HGFR)信号通路组份,乳腺癌患者常见的异粘蛋白(metadherin),以及结肠癌中的转移相关结肠癌1基因(metastasis- associated in colon cancer 1, MACC1基因)等。肿瘤转移细胞的生长还会因为一些非编码RNA的抑制而启动,比如乳腺癌中的miR-126和结肠癌中的miR-335等。这些转移起 始基因的表达以及它们靶点的表达都预示着患者的预后不佳。 处于循环系统中的肿瘤细胞侵入远隔器官的过程还包括细胞穿越毛细血管壁的过程以及在被侵入器官存活的过程。从原发灶处新鲜脱落的恶性细胞必须具有上 述这两项能力才能成功形成转移灶。这些能力都是肿瘤细胞在脱离原发灶之后,由于某些基因被激活从而赋予转移细胞的。不过虽然这些基因是在转移过程中发挥作 用,但是它们在原发灶细胞中可能已经能够大量表达了。我们将这些基因称为转移进展基因。 转移进展基因在原发灶与转移灶分别发挥的作用与由转移起始基因介导的肿瘤浸润过程完全不同。我们将在背景知识1和图3中详细介绍转移进展基因及其作 用机制。由于人体不同器官毛细血管的结构与血管壁的组成情况,以及血管周围的组织情况各不相同,因此,针对不同转移器官(部位)的转移细胞的浸润能力、存 活能力和定居繁殖能力也会有所差异。如此说来,在原发灶细胞中表达的能够促使肿瘤转移的基因应该能够向我们提供一些信号,帮助我们判断出肿瘤可能会转移到 什么部位。 还有一些基因能够帮助肿瘤细胞在转移部位定居、繁殖,这些基因的表达就只有在肿瘤细胞成功转移到达目的地之后才能被检测到了。我们将这类基因称为转 移毒力基因,因为这类基因的表达能够真正展现出转移肿瘤细胞的组织偏好性。比如,破骨细胞活动因子(osteoclast-mobilizing factor)、甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHRP)和白介素11(interleukin 11, IL-11)并不能为原发灶处的乳腺癌细胞提供任何帮助,但是它们能够帮助乳腺癌细胞转移到骨组织并形成转移灶。如果转移毒力基因的表达失控,得以大量表 达,那么它们对细胞造成的影响就不仅会是像在基因组不稳定情况下那样造成随机的效应,而是会给肿瘤细胞造成一种稳定的选择优势,使肿瘤细胞非常适合在某种 组织中生长。不过转移毒力基因无助于对肿瘤做出任何预测。 小贴士 肿瘤转移过程可以被看做由一系列先后发生的独立事件所组成,这些事件分别受到不同类型的肿瘤转移基因调控。 对于每一种肿瘤来说,它们肿瘤转移的动力学特征和转移靶点都是不一样的。 某些肿瘤具有很长的转移潜伏期,说明这些转移细胞在新的寄生地也发生了进一步的进化。如果肿瘤细胞在原发灶处就已经获得了它所需要的转移能力,那么它形成转移灶的速度就会快得多。 肿瘤转移细胞的组织特异性是由它们特异性的浸润和定居繁殖能力所决定的。 我们在制定治疗时应该认识到肿瘤转移潜伏期和组织特异性这两大特征的重要性。 背景知识1:能够调控原发肿瘤转移的因子 在原发肿瘤细胞里能调控肿瘤转移活性的基因也会表达,这似乎看起来很矛盾。为什么这些只会在远隔器官处发挥作用的基因在原发灶部位就开始表达,此时原发灶 细胞并没有受到转移灶部位微环境的选择压力呀,根据最近的研究进展,我们可以得出多种不同的答案。原发灶肿瘤细胞中肿瘤转移起始基因会表达是因为肿瘤细胞 要向外发展就需要有运动能力、侵袭能力、血管生成能力和免疫逃避能力。相比之下,原发肿瘤细胞里肿瘤转移进展基因的大量表达则有着更为复杂的机制。在试验 中发现,乳腺癌细胞中如果有前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2, 又名COX2)的表达,基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1)的表达以及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)的配体——外调蛋白(epiregulin)的表达都能促进血管生成。当这些基因有表达的细胞进入血液循环系统之后,这些基因还能增强 肿瘤细胞移出血管进入肺实质的能力。这些肿瘤转移进展基因在原发灶肿瘤细胞内大量表达,是因为它们能通过一种特殊的效应帮助肿瘤细胞 生长。但它们在转移灶 细胞中表达后则会通过另一种效应帮助转移细胞生长。 肿瘤转移起始基因和肿瘤转移进展基因之间的划分并不十分明确。我们最开始认为,肿瘤转移过程的调控因子是针对一个进程发挥调控作用的,但实际上它们也可能 会参与到对其它转移过程的调控之中。比如,低氧调控基因(hypoxia-regulated gene)——赖氨酰氧化酶基因(lysyl oxidase)被认为是导致人乳腺癌复发的元凶,但它最初被发现是因为它能够增强肿瘤细胞的侵袭能力。最近的研究表明,赖氨酰氧化酶在肺脏和肝脏系统中 的分泌可能会通过细胞外基质的作用促进机体中的散播肿瘤细胞定居到这两个器官,因为细胞外基质可以通 过招募CD11b骨髓细胞形成一个促进转移灶形成的微 环境。 在另一些情况下,原发灶肿瘤细胞中促转移基因(pro-metastatic gene)的表达可能也是众多对原发细胞成瘤毫无帮助的事件之一。比如,这些促转移基因的表达可能是肿瘤细胞对肿瘤所处微环境中细胞因子的一种反应(图 3)。骨髓前体细胞、内皮细胞、巨噬细胞以及其 它骨髓细胞和间充质前体细胞等间质组成细胞都能释放旁分泌因子(paracrine factor)来应对恶性细胞。虽然这些信号中有一些信号也能帮助肿瘤细胞生长,但是还有很多信号对肿瘤细胞的生长没有促进作用,不过有可能能帮助肿瘤细 胞转移。CCL5是由骨髓来源的间充质前体细胞分泌的细胞因子,该细胞因子浸润到乳腺癌组织中,能够促进肿瘤细胞转移到肺部,但不会影响原发灶肿瘤的发生 过程。转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGFβ)是在肿瘤病灶微环境中表达量很高的细胞因子,它能诱导乳腺癌细胞中大量基因表达,比如血管生成素样因子4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4)。该因子能破坏内皮细胞间的连接,但是对肿瘤细胞似乎没有任何帮助。不过肿瘤细胞离开富含TGFβ的原发灶之后继续表达ANGPTL4蛋 白会增强它的侵袭能力,尤其是在肿瘤细胞达到肺血管之后。我们对其它类 型肿瘤里的肿瘤转移进展基因还不清楚,尚需进一步研究。 3. 肿瘤转移的时像问题 各 种不同类型的肿瘤,以及肿瘤在不同患者体内形成转移灶的时间都不尽相同。由于各种肿瘤的动力学不同,它们穿透的生理屏障也不尽相同,因此各种肿瘤形成转移 灶的潜伏期长短也各有差异。每一种肿瘤的病程发展背后都隐藏着肿瘤转移细胞获得器官偏好性的进化经历(图4)。在雌激素受体阳性的乳腺癌患者、前列腺癌患 者和眼黑色素瘤患者体内,哪怕手术切除原发灶时肿瘤还非常小,在几十年之后还是有可能出现明显的转移病灶。这些肿瘤不会马上复发,说明它们在转移到新的部 位之后不能马上迅速增殖,侵蚀整个器官。较长的潜伏期给了转移细胞充分的时间继续恶性变,也给了肿瘤细胞充分的时间适应、改变新的生存环境,为将来的继续 增殖积蓄力量,创造条件。 不过还有一些类型的肿瘤可以迅速“占领”体内多个器官,这些肿瘤细胞适应新环境的时间非常短。比如肺癌和胰腺癌细胞就能够快速获得浸润其它器官并在 其中克隆性增殖的能力,体现在临床上就是我们熟知的肺癌和胰腺癌的转移速度非常快的现象。这些潜伏期非常短的肿瘤在原发肿瘤阶段就已经获得了非常强大的转 移能力,因此也就不需要更多的时间去适应新的繁殖环境了。 结肠直肠癌是一种典型的在原发部位完成肿瘤细胞形成以及获得转移能力的肿瘤。结肠直肠 癌都是通过基因突变造成癌的病程转变,比如从结肠直肠异常增生到形成腺瘤,再到浸润性 的,上述整个病理过程可以长到30年。最初,由于腺瘤性结肠息肉病肿瘤抑制蛋白(APC)突变而失活,或者是由于β连环蛋白(β- catenin)活化,经典的Wnt途径被激活,从而导致结肠直肠肿瘤发生。正常细胞向肿瘤细胞转化的过程中同时伴有KRAS基因突变激活,随后PI3K 信号通路被激活、TP53基因失活、转化生长因子β(ΤGFβ)抑癌信号通路失活等等。一旦结肠癌细胞突破了结肠壁,肿瘤就可以“畅行无阻”地发生转移, 并且不需要潜伏期了。结肠肿瘤主要是沿着肠系膜循环途径转移至肝脏,约有80%的患者会因肝脏出现转移灶而肿瘤复发。据估计,与肿瘤转移有关的绝大部分基 因突变都是在疾病发展到侵袭性肿瘤阶段时出现的。极少情况下,形成远距离肝转移还需要额外的遗传事件发生。因此,结肠直 长时间,但从侵袭性癌到发生肿瘤转移则只需要很短时肠癌就表现出发展为侵袭性癌需要很 间的临床特征(图4)。 4. 肿瘤转移的普遍规律以及器官特异性浸润 肿 瘤细胞为了能够进入循环系统并转移到远隔器官,它们首先就必须能够侵入周围组织。肿瘤细胞使用好几种不同的机制来达到侵入周围组织的目的,比如通过细胞主 动运动或者降解基底膜等方式进入循环系统。诸如RHOC一类的细胞支架修饰因子失调也能特异性地增强肿瘤转移能力。发育转录因子的异常表达可能会激活 EMT途径,这也与细胞的可塑性和侵袭性有关。 肿瘤细胞的扩散能力可能早在细胞恶性变之前就已经具备了。我们一直认为很多正常的细胞在发育成熟的过程当中都参与了复杂的细胞迁移过程和侵袭过程。 我们已经发现了肿瘤细胞转移、定居于骨髓来源的骨髓前体细胞、内皮前体细胞和间充质前体细胞周围组织的过程。正常的上皮细胞也是具有运动能力的。拿乳腺来 说,正常上皮细胞形成乳腺小叶过程中采用的侵袭和迁移机制也在乳腺增生的过程中发挥了作用。在乳腺癌早期,有一部分管腔前体细胞(luminal progenitor)可能也是运用这种侵袭和迁移机制转移到肺部的。根据细胞起源 不同,离开原发灶部位的上皮干细胞(epithelial stem cell)或前体细胞可能就已经具备了侵袭能力,尽管此时它们并没有恶性变。实际上,有一部分正常鼠类的癌变前乳腺细胞(pre-malignant mammary cell)在进入循环系统之后就已经能够浸润到肺部了。而且,有些人体乳腺上皮细胞的转移能力要比将几种癌基因转入细胞之后获得的实验转化细胞的转移能力 更强。能够诱发EMT转变行为的信号也能进一步增强肿瘤细胞的扩散能力,同时,这些信号也能增加祖细胞样癌细胞的比例。 (又名KAI1),脉管系统的某些特点也非常适合肿瘤细胞扩散。比如肿瘤转移抑制蛋白CD82在正常情况下能够通过与Duffy抗原趋化因子受体 (Duffy antigen chemokine receptor, DRAC)间的相互作用将肿瘤细胞锚定在内皮细胞上。因此,如果体内缺乏CD82蛋白,就会促使肿瘤转移。肿瘤细胞与血小板间的相互作用也能促进肿瘤细胞 发生转移。因为肿瘤细胞可以凭借这种作用形成聚集物,从而逃避机体免疫系统的监视,而且这种肿瘤细胞与血小板间的相互作用在肿瘤细胞移出毛细血管时也发挥 了积极的作用。 虽然各种类型的肿瘤细胞脱离原发灶到达远隔器官的过程中有一些普遍的机制,但是在转移到某些特定器官的过程中还是需要一些特殊的转移机制。临床上最 常见的四个肿瘤转移部位分别是骨髓、肺、肝和脑。肿瘤细胞转移到这些器官的过程会部分受到循环模式的影响。以结肠癌为例,正是因为源自肠道的肠系膜循环 (mesenteric circulation)以及肝血窦的高通透性特点,所以结肠癌才容易转移到肝脏。肝脏的血流和降结肠(原发灶部位)的血流又都回流到肺脏,因此结肠癌第 二多见的转移部位就是肺部。然而,除了循环系统的影响之外,结肠癌细胞本身也比较容易与肝脏和肺脏的内皮细胞相粘连,这说明还存在着某种特殊的分子间相互 作用,能够帮助肿瘤细胞滞留在这些器官里。我们已经发现,乳腺癌细胞会过量表达细胞粘连分子异粘蛋白。这些异粘蛋白能与内皮组织表面分子发生相互作用,帮 助扩散细胞滞留。在小鼠模型中发现,异粘蛋白能特异性地与肺血管系统相结合,促进肺转移灶的形成。 除了这种器官特异性内皮细胞粘连相互作用方式之外,我们还必须考虑到不同器官毛细血管壁的结构特点的不同也会影响肿瘤细胞的浸润(图2)。骨髓中的 毛细血管被称为血窦,它是由多孔的内皮细胞组成的,主要负责运输造血细胞。因此,多孔的骨髓血窦就极有可能受到循环肿瘤细胞的侵袭。肝毛细血管也是多孔的 血窦状结构,因此相比其它器官,肝脏也是非常容易受到肿瘤细胞“攻占”的一个器官。相比之下,肺毛细血管在内皮细胞外还有一层基底膜和肺泡上皮细胞包绕。 基底膜就构成了阻挡肿瘤细胞的一层屏障,除非肿瘤细胞能够表达某种特殊的因子以帮助自己跨越内皮细胞,否则就无法穿越基底膜。肿瘤细胞与基底膜之间的接触 可能会促进肿瘤细胞浸润靶器官,比如乳腺癌细胞表达的α3β1整联蛋白(integrin)与肺毛细血管基底膜上的层粘连蛋白5(laminin 5)之间的相互作用就能促进肿瘤细胞形成肺转移灶。血脑屏障是由紧密排列的内皮细胞和星形胶质细胞环绕而成,因此是人体内最坚固的“堡垒”,肿瘤细胞要想 进入脑组织除非拥有“特异功能”,不过我们现在对这些“特异功能”还知之甚少。 最近我们又发现了几个因子,它们能调控乳腺癌肿瘤细胞从肺血管中渗出过程。这些因子在有肺转移乳腺癌患者的原发灶乳腺癌细胞中的表达都是上调的。这 些因子包括外调蛋白(epiregulin)、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2, 又名COX2)、基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP1)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 1, MMP2)。它们不仅能促进原发灶处的血管重构,也能帮助肿瘤细胞从肺血管中渗出,进入肺实质。还有一个能够帮助肿瘤细胞从肺血管中渗出、进入肺实质的重 要因子就是血管生成素样因子4(angiopoietin-like 4, ANGPTL4)。该因子能促进肿瘤细胞浸润肺实质,因为它能促使血管内皮细胞间的连接解离。由于没有什么乳腺癌原发灶肿瘤的基因表达与肿瘤骨转移之间具 有很明显的关联,这可能说明骨血窦的高通透性使得肿瘤细胞不需要什么渗出“本领”就能轻松地转移到骨髓当中。 5. 不存在潜伏期的肿瘤转移 肿 瘤转移过程中的潜伏期以及在潜伏期阶段肿瘤细胞所处的潜伏部位都与肿瘤细胞发展出靶器官特异性有关。但是还有一些肿瘤细胞,比如肺腺癌细胞和胰腺癌细胞, 它们在浸润远 隔器官之后不久就能生成转移灶。这两种肿瘤也是常见的高复发率、高致死率肿瘤,哪怕是在发现早期原发肿瘤的患者人群中复发比例也很高。比如, 在I期肺腺癌患者中,5年不复发的比例为60%~70%,这个比例在I期乳腺癌患者人群中高达98%。这种复发率的差别不是由于诊断方法不同造成的。局限 期小细胞肺癌(limited-stage small-cell lung cancer)患者在确诊时也已经非常容易出现转移病灶了。而且肺腺癌还有一个特点,就是常常同时转移到脑、骨、对侧肺部等多个器官。恶性皮肤黑色素瘤也 很容易发生转移,它主要侵犯表皮组织、肺、肝、脑和骨等部位。一般来说,在确诊黑色素瘤两年之内,会出现转移灶,很少有人会在5年之后才出现转移灶的。同 一种肿瘤不同亚型细胞之间的转移能力也有差异,比如basal乳腺癌就比导管乳腺癌转移得早。 上述这些肿瘤的潜伏期都很短,表明这些肿瘤细胞可能具有转移到多个器官的能力。它们也许是在细胞恶性变之前就已经具有了这种能力,或者是在细胞恶性 变的早期就获得了这种能力。细胞在早期就获得这种多向靶器官转移能力可以使得肿瘤细胞不再需要额外的时间去适应各个不同靶器官处的各种微环境,为尽快形成 转移灶打下了基础。不过,究竟是什么因素赋予细胞这种“超能力”我们还不清楚,现在,这个问题已经成为了肿瘤转移研究领域的热点问题。肿瘤细胞及其靶器官 组织的某些特性可能会给我们解答上述问题提供一点思路。比如在黑色素瘤的发展过程当中,黑色素细胞会在小眼畸形相关转录因子(MITF,该转录因子是决定 黑色素细胞存活的关键因子)这种谱系决定癌基因的作用下发生转化。还有一种可能是因为黑色素细胞源自神经管嵴,所以还保留了某些胚胎细胞的可塑性。转录因 子SNAI2是神经管嵴细胞迁移所必须的因子,在小鼠模型中发现,SNAI2因子表达能促使黑色素细胞转移。 这种前体细胞的表型状态对于细胞转移能力具有影响的理论也适用于其它类型肿瘤。实际上,各种实体瘤,只要它们的转录模式与胚胎干细胞的转录模式相 同,它们的转移能力就要比其它肿瘤高得多。侵袭性肿瘤细胞所具有的这种胚胎细胞样可塑性反映(模拟)了其来源干细胞或者前体细胞的某些特点,这些特点被细 胞表型调控因子部分保留了下来。这些调控因子,比如多梳染色质重构复合体(polycomb chromatin remodelling complexe)和microRNA等当中有一些就与肿瘤转移有关。肿瘤细胞也会通过有选择地激活某些发育通路来强化这种细胞可塑性,增强其多器官转移 能力、侵袭能力和对所处微环境的适应能力。对肿瘤细胞缺乏明显潜伏期的这种特点进行研究,可以帮助我们发现新的治疗靶点来对肿瘤进行早期干预。 6. 肿瘤转移的潜伏期及其转移靶点 与 在原发灶确诊之后能快速在远隔器官形成转移灶,即潜伏期很短的肿瘤不同的是,还有一些肿瘤能在早期就能有效地侵袭其它器官,但是不能快速形成新的转移灶。 在乳腺癌中,散播的肿瘤细胞(disseminated tumour cells, DTC)会进入潜伏期,即在临床确诊原发灶之后到临床检出转移灶之间的这一段时间。乳腺癌肿瘤早期散播的恶性细胞可以以单个细胞或微小细胞簇转移灶的形式 在机体的某个部位,比如骨髓定居下来,但不会形成临床可见的巨大转移灶。这些DTC细胞可能是缺乏繁殖能力或者由于环境因素的限制而无法开始增殖。结果, DTC细胞就会进入休眠状态。或者,在微小转移灶中,DTC细胞的繁殖速度与细胞的死亡速度相当,即形成了肿瘤细胞团块休眠(tumour mass dormancy)现象。这两种潜伏模式之间互不矛盾,在某些患者体内还会共存(图5)。 器官微环境和肿瘤细胞的癌基因背景都会在肿瘤转移、潜伏现象中起到重要作用。比如在多瘤中间T抗原(polyoma middle T antigen)小鼠动物模型中,缺乏β1整合素的肿瘤细胞就无法感知周围环境中的纤维连接蛋白信号,从而导致其生长停滞。外来微环境中的应急信号也能促 使肿瘤细胞进入休眠状态,这是应急信号对DTC细胞中Erk和p38 MApK蛋白比例调控的结果。有趣的是,我们将从转基因动物模型获得的DTC细胞移植到野生型受体动物骨髓中,结果发现这些DTC细胞能够在受体动物骨髓 中很好地生长,说明DTC细胞的休眠状态可以因为细胞微环境的改变被迅速终止。肿瘤转移抑制基因的表达也能促使细胞进入潜伏期,比如KISS1基因就能阻 止浸润到远隔器官的肿瘤细胞进入生长状态。还有一个肿瘤转移抑制蛋白——G蛋白藕联受体56(GPR56)能够与细胞外基质中的组织转谷氨酰胺酶 (transglutaminase)发生相互作用,如果黑色素瘤细胞不表达GPR56蛋白,肿瘤细胞就会 快速向外生长。另外,宿主的多态性(host polymorphisms)也能调节肿瘤转移过程,比如我们在小鼠中发现的Sipa1多态性就具有这种调控作用。由于局部存在的抗血管生成因子,比如血 小板凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)的作用使得微小转移灶无法启动血管生成开关,这也是机体抑制肿瘤转移的一种机制。 虽然大部分进入循环系统或者浸润到远隔器官的乳腺癌细胞都会因为各种各样的宿主微环境 生存条件。骨髓是一个高因素而死亡,但是还有一些因素可以为这些肿瘤细胞创造出合适的 通透性的环境,非常适合造血干细胞的转运和生长,但同时,它也是正在接受化疗的肿瘤患者体内肿瘤细胞的天然避难所。这说明骨髓能为 DTC细胞提供了适合的生存环境。C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是骨髓间充质细胞分泌的细胞存活趋化因子间质细胞来源因子1(SDF1,又名 CXCL12)的受体。而CXCR4又是乳腺癌细胞的分子标志物,它能介导乳腺癌细胞转移到骨髓,因此,SDF1和CXCR4都是帮助潜伏期DTC细胞在 骨髓中存活的重要因子(图5)。 为了日后能继续繁殖形成巨大的临床可见的转移灶,潜伏期DTC细胞不仅需要生存下来,还需要获得继续繁殖的能力,一旦时机成熟,就东山再起。DTC 细胞在患者体内发展形成巨大转移灶的过程是DTC细胞肿瘤繁殖表型的体现,也是肿瘤干细胞表型的体现。在小鼠体内,分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation 1)和分化抑制蛋白3的表达能帮助乳腺癌细胞抵抗细胞衰老,并转移到肺部继续生长。另外,basal乳腺癌细胞和三阴性乳腺癌细胞,即雌激素受体ER、孕 激素受体PR和人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性的乳腺癌细胞中ID1和ID3的表达,也都与肿瘤肺转移有关。这些事实说明,转移细胞是否能在 转移器官处再次开始繁殖是可以根据我们最近发现的这些肿瘤细胞与转移靶器官微环境间的相互作用进行预测的。当然,这也是肿瘤细胞自身的遗传背景所决定的。 弄清楚各种能够影响DTC细胞转归并帮助细胞在潜伏期维持活性状态的信号途径可以为我们针对微小残存病灶(minimal residual disease)开展治疗提供有益的线索。 7. 肿瘤转移的器官选择机制 乳 腺癌和前列腺癌的潜伏期通常都很长,在这段时间里,到达转移靶器官的DTC细胞会不断进化,获得在此处继续繁殖的能力。骨髓、肺、脑和肝实质等部位会对转 移肿瘤细胞带来不同的选择压力。因此,暂时处于潜伏状态的DTC细胞最终要在这些部位形成转移灶还需要拥有其它的特殊本领才行,即要产生器官特异性的转移 细胞。实际上,乳腺癌患者通常都会先在某一个特定的器官形成转移灶,然后才会在其它器官形成转移灶。但令人吃惊的是,前列腺癌似乎只能转移到骨,这说明转 移前列腺癌细胞并不能在其它器官定居繁殖。 DTC细胞簇发生细胞遗传或表型变动、细胞所处的微环境出现局部或整体的改变,这些因素最终都有可能会赋予肿瘤细胞继续繁殖的能力,帮助其生存下 来,并形成转移灶。在宿主微环境的选择压力作用下,细胞的进化机制会产生不同的转移细胞,这些转移细胞中有一些就非常适宜在此处生长,这就是在同一患者体 内的不同器官有由不同的转移细胞形成的转移灶的机制。在晚期转移患者体内,从远隔转移器官释放出来的转移细胞也会进入循环系统和淋巴系统中,这些细胞可以 为我们打开一扇窗,帮助我们了解患者体内共有哪些种类的转移细胞。实际上,将从乳腺癌患者胸腔积液中分离出来的恶性细胞和细胞系接种到小鼠体内就会形成好 几个亚群细胞,这些亚群肿瘤细胞各自具有针对某个器官的偏好性或极性。值得注意的是,这些器官特异性的肿瘤细胞在体外是稳定的,说明它们在小鼠体内经过进 化之后,基因型和表型都已经固定下来了。按照这个理论,在二次转移器官里,潜伏期DTC细胞也会重新经历一次进化(恶化)过程(背景知识2)。 对于骨转移病灶肿瘤细胞的器官特异性增殖功能我们已经了解得很清楚了。乳腺癌细胞能形成典型的溶骨性骨转移病灶,这需要破骨细胞激活因子 (osteoclast-activating factor),比如PTHRP、IL-11、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等的参与。PTHRP、Il-6、Il-11和TNFα能作用于破骨细胞,促进其分泌核因子κB受体 激动子配体(RANKL)。RANKL能够促进破骨细胞形成。GM-CSF也能直接促进破骨细胞形成作用。这些因子的表达似乎不是为了给肿瘤细胞提供一个 选择优势,而是为溶骨性病变的形成打下基础(图5)。我们还没有在其它器官,比如脑或肝等部位的微环境中发现肿瘤增殖调控因子。不过,组成脑组织的多种细 胞也可能为脑肿瘤转移提供一个机会,有可能肿瘤细胞会通过与脑基质细胞之间的相互作用转移进入脑内,已经有证据支持这种假说,比如我们在人体转移灶组织样 品中就曾经发现明显的神经胶质细胞增多现象,而且也有体外实验证据表明,神经胶质细胞能够促进转移肿瘤细胞的生长。 背景知识2:从散播肿瘤细胞到转移肿瘤细胞 散播肿瘤细胞(DTC)是原发灶被切除(治疗)的患者体内与肿瘤转移复发有关的细胞,意即DTC细胞是肿瘤复发的原因。DTC细胞最初 是在骨髓当中被发现的,后来在外周血和淋巴结中也有所发现。由于DTC细胞缺乏特征性的分子标志物,也很难从其它器官中分离获得,因此我们很难知道它们是 在体内广泛分布还是主要集中在骨髓当中。如果骨髓是DTC细胞的储存库,那么DTC细胞就能从危害性相对较小的细胞发展成可怕的骨转移灶,或者换句话说, DTC细胞会在此处进化发展,直到它们能再次发生转移侵袭到其它器官,比如肺和脑,到了这些新的转移部位之后,DTC细胞又会再次进行器官特异性的进化。 如果不考虑远隔器官的位置,DTC细胞也会受到与原发灶器官完全不同的选择压力的作用。DTC细胞可能因为不能与新的生存环境建立繁殖性相互作用而无法生 存。或者,DTC细胞也可能会利用已有的细胞机制(机器)从新的生存环境中发展出生存优势从而继续存活下去。DTC细胞会有哪种结局完全取决于在新的生存 环境当中存在何种信号,以及DTC细胞对这些信号作出何种反应。有一些DTC细胞能继续生长,也有可能会进入生长与凋亡的平衡状态,直至它们积累了足够的 遗传突变或表型改变,能够适应新的生存环境,继而继续繁殖形成转移灶。我们将这个过程称为转移细胞形成过程。 来源于同一患者骨髓、淋巴结和血液的DTC细胞可能会有非常复杂多样的遗传状态。使用单细胞比较基因组杂交技术(single-cell comparative genomic hybridization),我们发现取自原发灶已切除患者骨髓的DTC细胞的畸变情况要比该患者原发灶肿瘤细胞的畸变情况少得多。在肿瘤早期即有乳腺 癌细胞扩散现象,以及这些细胞的遗传多样性状况出现,这表明转移灶细胞和原发灶细胞是各自独立发生进化的。不过我们还不清楚转移灶的生长是否主要源于这些 早期转移的DTC细胞,还是源自晚期更富有侵袭性的原发灶种子细胞(seeding cell)。实际上,好几个研究都表明,明显的转移灶和更富侵袭性的原发灶具有某些共同的基因表达模式,说明至少有一些转移肿瘤细胞的性状是转移细胞和某 些阶段原发灶细胞所共有的。对DTC细胞起源及命运的研究以及对DTC细胞如何成功形成转移灶的研究可以帮助我们了解肿瘤转移细胞形成的过程。 8. 治疗措施对肿瘤转移过程的影响 肿 瘤复发是恶性肿瘤的最终结局,而且在临床上,肿瘤复发一般都是很难治疗的。在经过系统性治疗之后肿瘤仍然会复发,这一般都是因为细胞内在的机制,比如经过 一段时间的化疗之后,肿瘤细胞出现了基因突变从而产生了耐药性等等。EGFR激酶抑制剂对上皮细胞生长因子受体(EGFR)发生突变的肺腺癌细胞有治疗作 用,但是一旦该肿瘤细胞再次发生EGFR受 体突变,那么EGFR激酶抑制剂就不会再有治疗作用了,因此会经常出现肿瘤复发的情况。有些抗药机制会同时发挥 作用,帮助肿瘤细胞转移。比如,有一个亚群的EGFR受体突变的肺腺癌细胞对EGFR激酶抑制剂吉非尼替(gefinitib)和埃罗替尼 (erlotinib)不敏感,这是因为这些细胞内MET基因出现了大量扩增,MET基因是编码酪氨酸激酶受体HGFR的基因。HGFR受体活化后上调了 EGFR信号通路,促进了依赖EGFR信号通路的肿瘤细胞的存活。而且,HGF在细胞发育和细胞迁移过程中也起到了直接的作用。此外,MET基因表达过程 还受到异粘蛋白(metadherin)的调控,这也是细胞耐药和肺转移的一条重要机制。由此可见,HGF-HGFR通路被激活的细胞产生耐药机制的同时 也获得了能帮助其转移的功能。 另一方面,临床治疗可以间接影响肿瘤转移的进程和转移模式,因为治疗可以推迟肿瘤的进展,也可以促使特定的靶器官出现转移灶。比如我们熟知的 ERBB2阳性的乳腺癌患者在使用ERBB2抗体曲妥单抗(trastuzumab),又名赫赛汀(Herceptin)治疗之后,脑转移的发病率会增 多。导致这一现象的原因十分有趣,是与脑部“庇护所”的特点有关。在中枢神经系统里生存的肿瘤细胞会被血脑屏障屏蔽起来,因此化疗药物很难杀灭这些肿瘤细 胞,同时这些肿瘤细胞还会受到脑部微环境里存活信号的保护。佐剂可能会起到一定的治疗作用,但它会增加脑部潜伏肿瘤细胞出现的机会,这样,DTC细胞会被 迫适应并发展出新的能适应中枢神经系统生存环境的能力,从而继续繁殖形成巨大转移灶。 其它器官特异性的微环境在人体接受化疗时也会对肿瘤细胞起到类似的保护作用。比如骨髓中的DTC细胞是处于休眠状态的,因此对乳腺癌患者施用细胞毒 性化疗药物会出现治疗无效的情况,因为有15%~20%的患者在接受了完整的细胞毒性化疗药物和内分泌激素治疗联合疗法之后,体内仍然有残余的肿瘤细胞。 从这个角度来说,发现组织特异性的预后信号可能会为我们提供更详细的临床治疗方案。虽然这些例子表明,临床治疗可能会对肿瘤细胞带来选择效应,产生具有某 些特殊性状的肿瘤细胞,但是如果不予治疗,侵袭性转移肿瘤细胞仍然有可能出现,仍然会具有抗药性。这种情况对于进展迅速的肿瘤,比如肺癌和黑色素瘤尤其常 见,面对这些肿瘤,除了手术,暂时还没有更好的办法。 9. 前景展望 随着临床肿瘤学的不断发展,现在已经步入了个体肿瘤医学时代,因此,我们对肿瘤转移生理学的需求就更加显得迫切。在过去几年里,我们见证了这个领域的蓬勃发展,同时技术上的进步也给我们研究肿瘤转移带来了更大的帮助。对肿瘤转移的了解也能帮助我们更好地改进治疗措施。 有三点问题应该重点解决 第一:如何将临床上观察到的肿瘤转移发生的步骤、转移部位以及时间资料构建到实验动物模型当中; 第二:弄清楚与肿瘤器官特异性转移相关的细胞及分子机制; 第三:运用这些研究成果,以分子标志物对肿瘤进行更好的分类。这些分子标志物是有关肿瘤转移能力以及潜伏期和活动期肿瘤细胞对治疗手段反应性的标志物。我们充分相信,在未来的几年里一定能够解决上述问题。 小词典 上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transitions, EMT)上皮-间质转化是指上皮细胞在形态学上发生向成纤维细胞或间充质细胞表型转变并获得迁移的能力。EMT是胚胎发育中的一个基本过程,它使在特殊部 位产生的上皮细胞从上皮组织分离并迁移到其它位置,是 正常发育、伤口愈合以及恶性上皮肿瘤发生的基础。 PI3K信号通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族参与多种信号通路,调节细胞的主要功能。正常情况下,由其活化而产生的类脂产物3,4-二磷酸磷脂酰 肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]作为第二信使结合并激活多种细胞内的靶蛋白,形成一个信号级联复合 物,最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。 浸润(Infiltration)即肿瘤细胞通过侵入和从血管中渗出并进入远隔器官的行为称为浸润。 定居、繁殖(Colonization)即肿瘤转移细胞适应了远隔器官的微环境之后在该处生长的行为。 潜伏期(Latency)即从临床上确诊原发灶到发现转移灶之间的这段时间称为潜伏期。 内渗进入血管(Intravasation)即肿瘤细胞进入血液循环系统的过程。 外渗入血管(Extravasation)即肿瘤细胞离开毛细血管进入实质器官的过程。 Basal乳腺癌(Basal breast cancer)是一种更富侵袭性的乳腺癌亚型肿瘤,一般都缺乏雌激素和孕酮受体。 管状乳腺癌(Luminal breast cancer)起源于正常乳腺导管的乳腺癌。 休眠子(Dormancy)即停滞在G0期,呈休眠状态的细胞。对于肿瘤病灶整体来说,休眠子是介于繁殖细胞和凋亡细胞之间的一种平衡状态。 血管生成开关(Angiogenic switch)负责调控肿瘤血管的生成过程,为肿瘤生长提供营养支持。 肿瘤繁殖表型(Tumour-propagating phenotype)浸润肿瘤在转移灶部位能够重新开始生长繁殖的表型。该表型也被某些研究人员称为肿瘤干细胞表型。 转移肿瘤形成过程(Metastatic speciation)即肿瘤细胞从原发灶脱离之后由于受到各种不同的选择压力作用,异质性的肿瘤细胞发生进化,最终形成新的转移灶的过程。 神经胶质增生(Gliosis)即脑部受损之后在损伤区域会出现神经胶质细胞增生的现象。 原文检索: Don X. Nguyen,Paula D. Bos and Joan Massagué. (2009) Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews CanCer, 9:274-285. 筱玥/编译 二、肿瘤转移抑制蛋白——抗癌治疗新希望 肿 瘤转移抑制蛋白(Metastasis suppressor protein)能够在肿瘤转移的多个步骤中发挥调控作用。这些步骤包括肿瘤细胞侵入血液循环系统及淋巴系统并在其中存活、随其转运以及到达远隔器官并在 其中克隆性增殖等。因此弄清楚肿瘤转移抑制蛋白的生物学功能可以为我们开发出更有效的疗法来为肿瘤治疗提供更多、更好的思路。有好些研究者已经报道使用转 基因等技术介导基因表达恢复了肿瘤转移抑制蛋白的功能,并由此弄清楚了肿瘤转移抑制蛋白的下游信号通路情况。虽然目前这些研究方法还没有在临床上得到广泛 应用,但是其中有一些已经进入了临床前检测阶段甚至进入了临床试验阶段。 人体内有无数的致癌基因与抑癌基因在发挥作用,它们参与了肿瘤转化和发生的过程。这些基因分别对随后的原发灶肿瘤的发展过程起到了正向和负向的调控 作用。现在,我们又发现了一大类新基因。这些新基因能够在肿瘤转移(血道或淋巴道转移途径)的过程当中起到促进或抑制的作用。这些在转移过程中发挥作用的 基因与上述在肿瘤发生发展过程中发挥作用 的基因一样,既有促转移基因,也有抑制转移基因,正如既有Ras基因和SRC基因,也有PTEN基因和p53基因 一样。 在上述参与调控肿瘤转移过程的基因中,如果有一些基因不表达或者无功能,那么肿瘤就会发生转移,这些能够抑制肿瘤侵入、散播、停滞与存活,并开始新 一轮克隆性生长的基因就是肿瘤转移抑制基因,但是肿瘤抑制基因并不会抑制转化细胞在原发灶形成肿瘤的过程(这 移抑制基因以及它们在肿瘤治疗工作中的意是抑癌基因的工作)。本文将向大家介绍肿瘤转 义和作用,并对这方面的临床操作实际可行性问题展开讨论,同时还将介绍几例已经初步展现出治疗前景的实例。 1. 肿瘤转移抑制基因简介 直 到最近几年,被我们发现的肿瘤转移抑制基因才逐渐多了起来。就在5年以前,我们只知道8个肿瘤转移抑制基因。广义上说,这些基因都具有一个共同的功能,即 调控关键的信号通路,比如G蛋白藕联受体信号通路(G-protein-coupled receptor signalling)、酪氨酸激酶受体信号通路(tyrosine kinase receptor signalling)、小GTP酶信号通路(small GTPase)和MAPK信号通路等等。后来几年又陆续发现了更多受到肿瘤抑制基因调控的信号通路。最近有一篇综述提到,研究人员已经发现了23种肿瘤抑 制基因,其中包括能调控上述这些信号通路的基因以及能够调控肿瘤细胞粘附、迁移、死亡以及血管生成过程的基因。2008年,人们又发现了一种全新的、能够 抑制肿瘤转移的miRNA。这些miRNA能够与相应被调控靶基因mRNA 3’ UTR结合来发挥调控肿瘤转移的作用。 我们到目前为止只发现了为数很少的几种肿瘤抑制基因是因为不仅需要相关数据信息来发现并确定这些基因,同时还需要用能够真实模拟体内肿瘤自然转移过 程的模型来验证这些基因抑制肿瘤转移的功能。幸好有了免疫缺陷肿瘤异种移植物小鼠动物模型,我们才得以开展肿瘤抑制基因的相关研究工作。有关肿瘤抑制基因 的相关研究工作一般包括:通过对各种转移细胞或组织进行比对,从中筛选候选基因的工作、检验这些候选基因的表达情况或突变情况, 还有最为重要的、必不可少 的一项工作就是进行体内转移试验,来验证这些候选基因是否真的是肿瘤抑制基因,即是否具有抑制肿瘤转移的作用,同时又不会影响肿瘤发生过程以及影响肿瘤细 胞的增殖(背景知识1)。 背景知识1:肿瘤转移抑制基因的发现及验证历程 对具有不同转移能力的肿瘤细胞进行筛选,发现其中表达有差异的基因,通过这种方法来发现肿瘤转移抑制基因 我们使用了很多策略来发现肿瘤转移抑制基因,比如染色体转移技术、差异显示技术、扣除杂交技术(subtractive hybridization technique)、芯片比较技术等。通过这些技术对具有不同转移能力的肿瘤细胞进行筛选。最近,因为肿瘤组织学家们的努力,我们又获得了更多肿瘤细胞 的芯片表达数据。这些数据会更好地帮助我们发现肿瘤转移抑制基因,因为我们可以利用不同阶段的肿瘤数据来对这些候选基因进行验证。 在患者体内如果缺乏上述候选基因就会发生肿瘤转移的现象 对候选基因进行验证包括在人体肿瘤组织,最好是转移瘤组织里验证其表达和功能。不过要获得转移组织一般来说都比较困难。相比之下检测肿瘤的转移能力似乎更加具有可操作性。比如可以验证肿瘤原发细胞中如果缺失了上述候选基因是否会导致肿瘤转移等。 在体内试验中验证其肿瘤转移抑制功能 我们一般都是使用外源表达有上述筛选出来的候选基因的细胞和对照细胞来证实肿瘤转移抑制基因的功能的,这是证明其肿瘤转移抑制基因身份 的必要条件。这些试验常用的方法是将肿瘤来源细胞注入啮齿动物体内,使用自发转移试验检测正位异种移植模型和皮下或异位异种移植模型。这种方法可以检测出 肿瘤转移过程中的大部分步骤,但并非所有类型的肿瘤都有异种移植模型可供试验检测。还有一种试验方法是将肿瘤细胞直接注入动物动脉或静脉内,虽然这样只能 检测肿瘤转移过程里肿瘤细胞进入循环系统之后发生的情况,但是这种方法与自发转移试验相比速度要快得多,重复性也高得多。 肿瘤转移相关背景知识速览 ?肿瘤转移现象是肿瘤(癌症)高发病率和高致死率的原因。有越来越多证据显示,肿瘤细胞在癌症发展的早期其实就已经开始从原发灶脱离并转移到别处了,这和我们以前的观点是不同的。 ?肿瘤转移过程既可以受到一些蛋白的促进,即正向调控作用,也可以受到一些蛋白的抑制,即负向调控作用。 ?肿瘤转移抑制基因编码的蛋白能够在体内阻止或抑制肿瘤转移过程,但不会影响到原发灶肿瘤的生长。这一点与抑癌基因编码蛋白是不同的,抑癌蛋白能够抑制原发肿瘤发生。 ?肿瘤转移抑制蛋白通常都会在肿瘤进展过程中缺如,但是不会在肿瘤细胞转化过程中缺如。 ?直到最近,我们才发现了少数几种肿瘤转移抑制基因。不过我们相信,伴随着基因组学技术的进展,我们会发现更多的肿瘤转移抑制基因,知道这些基因参与了哪些细胞生理过程。 ?我们已经知道肿瘤转移抑制基因参与了肿瘤转移过程中的多个步骤,还发现有几个肿瘤转移抑制基因能够特异性地抑制转移肿瘤的定居繁殖过程,即少数转移细胞在远隔器官处从微小转移灶逐渐生长形成临床可见的、致命的巨大转移灶过程。 ?最近的研究发现,我们可以通过一些方法重获肿瘤转移抑制基因的功能。这些方法包括外源表达或内源表达这些肿瘤转移抑制基因、直接施用这些肿瘤转移抑制蛋白,或者施用针对肿瘤转移抑制基因重要下游靶点的药物等。 2. 从功能基础研究到临床实际应用 开 发针对肿瘤抑制基因疗法的基本原理与开发针对肿瘤转移疗法的基本原理是一样的。不过我们从对肿瘤抑制基因的研究当中发现了转移肿瘤的“致命伤”,即在转移 灶处发生的克隆 死穴”或许就能够解决这一顽疾。有意思的是,循性增殖过程。我们利用转移肿瘤的这一“ 环肿瘤细胞(circulating cancer cell)或者是那些在转移灶部位发现的肿瘤细胞虽然非常常见,而且在患者体内或者在动物模型体内都会在早期被发现,但它们居然都不是我们可攻击的靶标。 不过这些肿瘤细胞到达转移灶之后开始异位克隆性增殖这一过程却是一个效率非常低的过程。甚至在美国的一份流行病学调查报告里也提及了在大部分较常见的肿瘤 里都会出现的这种早期转移现象。Steeg等人仔细搜索了美国国立癌症研究院(US National Cancer Institute)的SEER数据库,分析了几种常见肿瘤确诊时的肿瘤分期情况,结果发现在临床确诊肿瘤时尚未出现明显转移灶的患者人群中,仍然有 29%~ 37%的患者的局部淋巴结呈肿瘤细胞阳性。 简而言之,很多肿瘤在得到临床确诊之前就已经发生广泛转移了。因此,正如一些学者认为的,有些患者虽然原发肿瘤得到了很好的治疗,但如何应对后期肿 瘤复发仍然是一个棘手的问题。这实际上也属于辅助治疗范畴,即在针对原发肿瘤进行治疗的同时或之后,继续针对转移灶进行治疗。对于基于肿瘤转移抑制基因的 疗法来说,我们使用的就不再是传统的细胞毒性抗肿瘤药物了。目前这种基于肿瘤转移抑制基因的疗法的主要目的在于延缓肿瘤的复发,这实际上也就等于“治愈” 了患者,因为肿瘤如果不复发,这些患者也就不会因为肿瘤而致命。 虽然不是所有的肿瘤转移抑制基因都能抑制肿瘤克隆性增殖过程中的限速步骤,但是有好多研究证明,的确有一些肿瘤转移抑制基因是能够抑制肿瘤克隆性增 殖过程中的限速步骤的。在试验中发现,某些肿瘤转移抑制基因的表达能显著地抑制转移灶处于休眠状态的单个或小簇肿瘤细胞的增殖活力,而对照组的肿瘤细胞则 能够明显增殖,形成转移瘤(macrometastatic nodule)。 到目前为止,已经明确具有抑制肿瘤转移功能的基因包括KISS1基因、KAI1基因(又名CD82基因)、NM23基因(又名NM23-H1基因或 NME1基因)以及MAP2K4基因等。需要说明的是,还有一些肿瘤转移抑制基因是针对肿瘤转移过程中的其它步骤来发挥作用的。实际上,通过试验发现,很 多肿瘤转移抑制基因都是针对肿瘤活动力、侵入性以及散播过程中的存活率来发挥作用的(图1)。但是对于早期就发生广泛转移的肿瘤细胞来说,相比针对克隆性 增殖步骤这一靶点,上述靶点似乎不太适合用于发展治疗方法。 肿瘤转移抑制基因能够在肿瘤转移灶的形成过程中发挥作用这一现象说明,如果能够恢复这些基因的功能可能会是一条治疗肿瘤转移的好方法。最近已经有报 道称有研究人员分别用几种方法重建了上述几个被证实有效的肿瘤转移抑制基因的功能,结果证实这种方法在临床前研究中是有效的(表1)。这些方法大致可以分 为三大类,包括诱导内源基因表达或通过基因疗法来表达肿瘤转移抑制基因、直接施用肿瘤转移抑制基因编码蛋白以及直接针对肿瘤转移抑制基因的下游信号通路 (图2及图3)。下面我们将针对上述三种方法逐个进行讨论,还将探讨一下如何利用先进的药物基因组学方法和生物信息学方法来帮助我们针对肿瘤转移过程中的 靶点找到突破口。 BMP4, bone morphogenetic protein 4:骨形态发生蛋白4;BRMS1, breast cancer metastasis suppressor 1:乳腺癌转移抑制蛋白1;DARC, Duffy chemokine receptor:达菲趋化因子 受体;EGFR, epidermal growth factor receptor:表皮生长因子受体;HDAC, histone deacetylase:组蛋白脱乙酰基酶;MKK4, MAPK kinase 4:促分裂原活化蛋白激酶4;RHOGDI2, RhoGTPase dissociation inhibitor 2:Rho GTP酶解离抑制蛋白2;RKIP, Raf kinase inhibitory protein:Raf激酶抑制蛋白。 3. 以基因表达作为治疗策略 3.1 NM23基因 NM23基因,又名NME1(非转移细胞1,non-metastatic cells 1)基因。它是第一个被发现,同时也是被研究得最充分的一个肿瘤转移抑制基因。早在1988年,Steeg等人就通过差异杂交方法比较了两种分别具有高转 移特性和低转移特性的K-1735鼠黑色素瘤细胞系细胞的基因表达谱,发现了NM23基因。后来又用体内和体外实验发现,NM23基因的表达产物可以抑制 肿瘤转移而不会影响肿瘤细胞的生长。随后,我们又在人体基因组中发现了8个NM23基因的同系物,其中NM23-H1 基因(又名NM23基因)和NM23-H2基因(又名NME2基因)也具有抑制肿瘤转移的作用。与此同时,另一些研究人员运用不同的实验方法在不同的细胞 系里验证了这些研究结果的真实性。 NM23蛋白具有几项非常有意思的功能。首先,它具有组氨酸激酶活性,能够抑制Ras蛋白活性,导致KSR1蛋白降解,抑制MAPK信号通路,而我 们知道MAPK信号通路在很多肿瘤细胞里都会表现出增强肿瘤细胞活力、移动能力以及其它一些与转移相关能力的作用。在体内试验中发现,某些内源性或外源性 的病毒蛋白可以通过与NM23蛋白相结合来调节其活性,这些病毒蛋白包括EB病毒核抗原1和EB病毒核抗原3c。该研究结果表明NM23蛋白的确具有抑制 肿瘤转移的作用,而且,NM23蛋白还可以通过抑制促肿瘤转移基因的表达来发挥抑制肿瘤转移的作用。 我们现在对NM23蛋白的治疗应用研究主要都集中在其启动子方面。该启动子受糖皮质激素反应途径(glucocorticoid response pathway)调控。虽然糖皮质激素受体激动剂地塞米松不能促进NM23蛋白的表达,但是孕酮(progesterone)和不典型糖皮质激素受体激动 剂醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate, MPA)却都能以一种依赖糖皮质激素受体反应元件(glucocorticoid receptor response element-dependent)的方式诱导NM23蛋白的表达。MPA通常都是以低剂量的方式来使用的,但是在乳腺癌的临床试验中却给予了高剂量的 MPA进行治疗。对MPA作为肿瘤转移抑制剂的临床前药物评估结果表明,它具有极大的应用前景。在给裸鼠移植了MDA-MB-231细胞系细胞(人乳腺癌 细胞)四周之后,在肺部会出现微小转移灶。然后将这些裸鼠随机分成两组,即对照组与MPA治疗组。在MPA治疗组里,裸鼠的血药浓度大致与人体内的血药浓 度相当。结果在两次单独实验里都发现,MPA治疗组发生肿瘤转移的裸鼠比例都有明显下降,降幅分别达到了27%和36%,同时也发现在MPA治疗组,平均 荷瘤率也有明显下降。用免疫组化法(immunohistochemistry)检查NM23蛋白表达水平时发现,在MPA治疗无效动物里的信号强度要比 未受MPA治疗组裸鼠高得多。在这些非常喜人的实验结果基础之上,我们开始了MPA的II期临床试验,以检验MPA在伴有或不伴有施用低剂量抗血管生成药 物环磷酰胺-氨甲喋呤(cyclophosphamide–methotrexate)这种节奏性化疗(metronomic chemotherapy,即连续低剂量口服化疗方案)方法时,对难治性激素受体阴性(hormone receptor–negative)乳腺癌转移患者的治疗效果。有报道称维甲酸(retinoic acid)和雌二醇(oestradiol)也能诱导NM23蛋白表达。 也有学者尝试在卵巢癌转移瘤小鼠动物模型(该模型由SW626细胞系变种细胞构建而成)上实验使用腺病毒载体基因疗法来恢复NM23蛋白的功能。将 这些肿瘤细胞注入小鼠体内形成异种移植瘤之后,再腹腔注射能表达NM23蛋白的腺病毒载体。使用该方法能显著降低小鼠肝转移的概率,抑制率达到60%(p =0.01)。同时,小鼠的平均生存时间相较对照组也明显增加,平均存活天数要多出35天(p < 0.05)。 3.2 KAI1基因 诱导表达另一种内源性肿瘤转移抑制基因KAI1基因的方法也有报道。KAI1蛋白的肿瘤转移抑制活性最初是通过将人体第11号染色体转 移至AT6.1大鼠前列腺癌细胞当中而被发现的。随后我们克隆得到了抑制基因位点,并在体内试验中验证了它的肿瘤转移抑制活性。KAI1蛋白是一种膜结合 蛋白,我们已经发现了有关该蛋白的两个重要的抑制功能,分别是下调表皮生长因子受体信号通路(该通路与受体灵敏度降低及被细胞内吞作用增强有关)的作用, 以及一条新的,包括KAI1蛋白和达菲抗原趋化因子受体(Duffy antigen receptor for chemokines,DARC该蛋白在内皮细胞中表达)的信号通路。处于循环系统内的表达有KAI1蛋白的细胞能通过KAI1蛋白与DARC蛋白间的相 互作用与内皮细胞相结合,这种相互作用与诱导KAI1蛋白阳性的肿瘤细胞停止增殖并老化有关,不过不表达KAI1蛋白的肿瘤细胞不会受到这种机制的影响。 与NM23蛋白一样,我们也可以用好几种方法来获得KAI1蛋白的活性。早期实验研究发现,p53蛋白能通过p53反应元件(p53- responsive element)来促进KAI1基因的转录。随后对前列腺癌组织样品用免疫组化的方法进行研究验证了上述观点。实验发现,p53蛋白与KAI1蛋白在细胞 内的表达量具有明显的相关性。在此基础之上,Mashimo等人又使用依托泊苷(etoposide)这种p53诱导剂进行了实验,结果发现依托泊苷也能 够增加KAI1蛋白的表达量,这进一步证明了上述观点,同时也表明,这有可能是一条抗癌治疗的新靶点。Wu等人在给小鼠脾脏注射了胃癌肿瘤细胞之后施用了 依托泊苷给予治疗,结果观察到在脾脏转移瘤细胞里KAI1蛋白表达量增加,同时降低了肝脏转移灶出现的几率,不过实验并不能证明这种肿瘤转移抑制作用是特 异性地由KAI1蛋白的作用而导致的。无论如何,这个实验结果对于我们来说都是一个非常好的消息。因为依托泊苷是一种口服药物,所以它非常适合长期用药, 也 可以通过前文中所述的节奏式化疗法来服用。但是由于依托泊苷和p53蛋白具有多效性,因此它们对KAI1蛋白的诱导作用可能会比较弱,这就需要我们进行 进一步的研究,弄清楚其中的细节问题。 还有一种方法能够让前列腺癌细胞长期内源性表达KAI1蛋白,有望达到治疗的目的。该方法 isoflavone)5,7,4′-三羟基异黄酮。El Touny使用大豆来源的植物雌激素——大豆异黄酮 ( 等人最近报道,使用5,7,4′-三羟基异黄酮之后,能在TRAMP前列腺癌小鼠模型体内试验中观察到KAI1蛋白表达增多的情况。在体外实验 中也观察到,5,7,4′-三羟基异黄酮能够抑制TRAMP前列腺癌小鼠肿瘤细胞的侵袭行为,而5,7,4′-三羟基异黄酮的这种作用经过特异性针对 KAI1蛋白的siRNA试验证明,这种作用正是通过特异性的诱导KAI1蛋白的表达而不是其它可能被5,7,4′-三羟基异黄酮诱导表达的蛋白而获得 的。不过我们还没有在临床前试验中对5,7,4′-三羟基异黄酮抑制TRAMP肿瘤转移的作用进行检验,也不清楚KAI1蛋白诱导表达的具体机制。 当然,也有人运用传统的基因疗法来提高KAI1蛋白的表达量。Xu等人直接给裸鼠皮下移植的MiaPaCa II胰腺癌细胞中注射了能表达KAI1蛋白的质粒,分别通过盐水和脂质体包裹质粒进行注射。结果发现注射质粒之后能明显抑制肿瘤肺转移。还有人使用正位非 小细胞肺癌淋巴转移小鼠模型(orthotopic non-small-cell lung cancer lymphatic metastasis mouse model)和复制缺陷型的腺病毒载体进行了研究。他们通过给同系基因型小鼠肺部注射lewis肺癌细胞构建了动物模型,然后三次气管内施用能表达 KAI1蛋白或对照蛋白lacZ的腺病毒,三周以后称量肺脏和转移淋巴结的重量。结果发现用表达KAI1蛋白腺病毒组的小鼠纵膈淋巴结(转移灶)重量明显 要比对照组轻,但是肺脏(原发灶)重量则没有明显区别。 3.3 RKIP基因 Raf激酶抑制蛋白(RKIP,也被称为PEBP1)是最近被发现的一种肿瘤转移抑制蛋白,它可以抑制常位移植到小鼠体内的C4-2B 人前列腺癌细胞的转移。最初我们通过酵母双杂交技术筛选到得RKIP蛋白。我们发现它可以和RAF1激酶结构域相结合,竞争性抑制RAF1与MEK之间的 相互作用,从而下调这条信号通路。在前列腺癌以及其它一些肿瘤细胞里,RKIP蛋白的表达是缺失的。最近有报道称,可以通过一些方法诱导内源性RKIP蛋 白的表达。 内源性RKIP蛋白能够被一种组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase)抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A)所诱导表达,说明曲古抑菌素A有望成为一种新型的抗癌药。实际上,目前正有人在对该药物进行抗癌疗效方面的研究。同时,这也告诉我们,可以使用染色质 修饰药物来诱导肿瘤转移抑制基因的表达。虽然这种药物的特异性相对比较低,即它可以诱导多种抑制基因表达,但这恰好是它的一大优点,比如它也可以诱导另一 种最近刚刚发现的肿瘤转移抑制基因DLC1基因的表达,这样我们就可以使用染色质修饰药物同时诱导多个肿瘤转移抑制基因的表达,使它们共同发挥作用。最近 发现,另一种染色质修饰药物,DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitor)——5-氮杂胞苷(5-azacytidine)也能诱导肿瘤转移抑制基因NDRG1基因和NM23基因的表达。 3.4 前景 作为一种普通的治疗策略,诱导内源基因表达(图2a、b)是非常自然,同时也非常吸引人的一种方法,尤其是在我们可以通过口服生物活性 药物来达到这一目的的情况下更是如此。但是到目前为止,这种方法只能对基因表达被抑制的情况起作用,如果基因因为突变或其它原因发生丢失,则无法诱导其表 达。虽然有人认为,在大部分肿瘤细胞里,肿瘤转移抑制基因都只是被抑制而已,但还是有人观察到这些基因发生突变的情况。实际上,用各种方法诱导肿瘤转移抑 制基因内源性表达这一方法凸显了该方法的一大优势,这是利用抑癌基因的方 法所无法比拟的优势。因为抑癌基因通常都是因为突变而失活的,所以无法诱导表达内 源性的抑癌蛋白。不过这些基因表达缺失的原因是因人而异、因基因而异的,只有准确弄清每个病人体内每个基因表达缺失的情况,才能对症下药。由于不是所有的 肿瘤转移抑制基因都能够被非常好地(耐受)人为诱导表达,比如使用MPA这样,所以还需要努力寻找口服的能够诱导肿瘤转移抑制基因表达的药物。因此,尽管 我们已经认识到要使用外源性基因表达法来治疗肿瘤还存在很多困难(图2c),但是面对很难诱导其表达的内源基因时,该方法还是很有效的。 4. 直接施用肿瘤转移抑制蛋白 4.1 KISS1基因 直接施用肿瘤转移抑制蛋白KISS1的方法已经在进行临床前实验了。有人给缺失了KISS1蛋白功能的患者施用KISS1蛋白,来观察 它对肿瘤转移抑制的作用。最初我们是在将人黑色素瘤细胞C8161细胞与在其中转入了人6号染色体的C8161细胞进行扣除杂交研究时发现了KISS1基 因。在黑色素瘤转移灶细胞中经常会缺失6号染色体,而研究发现,6号染色体具有抑制黑色素肿瘤转移的作用。KISS1基因位于1号染色体上,但是它受到位 于6号染色体上的反式激活物因子调控。KISS1基因的编码产物是一种名为kisspeptin(或称为metastin)的分泌蛋白,该蛋白至少能与一 种名为KISS1R或GPR54的G蛋白藕联受体相结合。虽然我们还不清楚肿瘤转移抑制作用的下游信号途径,但是有报道称KISS1蛋白表达是抑制肿瘤转 移的必要条件,同时发现分泌的KISS1蛋白能使散播的肿瘤细胞处于休眠状态,因此,阻止了转移瘤细胞的克隆性增殖过程发生。 Ohtaki等人在一项临床前研究中发现,通过渗透泵给患者注入KISS1蛋白衍生物肽段,可以明显抑制KISS1R蛋白过表达的B16-Bl6黑 色素瘤细胞发生自发肺转移,与对照组相比,有效率高达66%(p < 0.01)。因此,Ohtaki等人认为,在后续的临床试验中,这种治疗方法也会使转移瘤细胞处于休眠状态,从而达到抑制肿瘤转移的作用。不过最近有人质 疑,KISS1蛋白的肿瘤转移抑制作用究竟是通过肿瘤细胞表达的KISS1R来发挥作用,还是通过旁分泌(paracrine effect)的方式对周围的间质发挥作用,抑或是通过一些未知的受体来发挥作用的。不过无论如何,使用KISS1蛋白都是一条非常有希望的肿瘤治疗新方 法。另一篇最近发表的报道了他们对KISS1蛋白小分子类似物进行的研究工作,该项研究工作也为我们打开了另一条使用KISS1蛋白的新途径。虽然已 经有人将KISS1蛋白的部分肽段使用到了患者身上,而且短期内观察,患者对这类药物的耐受性都很好,但是有人在动物模型上进行了长期的临床前研究发现, 这类药物会对垂体性腺轴(pituitary–gonadal axis)系统造成影响,即如果长期使用该类药物,可能会对男性患者带来一定的毒性作用。同样,任何其它小分子类似物也都应该接受这样仔细的临床前和临床 试验的检验。如果要将该技术成功应用到临床,那么这些问题就一定要弄清楚,因为要阻止形成巨大转移灶,我们需要长期使用这些药物。 4.2 BMP4基因 与分泌型的KISS1蛋白一样,成骨蛋白4(bone morphogenic protein 4,BMP4)蛋白也是一种分泌蛋白,它属于转化生长因子β超家族(transforming growth factor-β superfamily)成员,也是最近报道的一种肿瘤转移抑制蛋白。Eckhardt等人最近发现BMP4蛋白表达抑制与小鼠乳腺癌转移增多有关。他们 用实验证实,在4T1.2小鼠乳腺癌细胞中过表达BMP4蛋白能够抑制自发性转移,但是不能抑制肿瘤发生;如果用RNA干扰技术抑制BMP4 蛋白的表达, 则会使原本转移能力不高的细胞转移能力增强。最后,Eckhardt等人还在乳腺癌转移小鼠模型中进行了临床前实验,他们发现腹膜内注入重组BMP4蛋白 同样也能起到抑制肿瘤转移的作用,增强小鼠的存活率。 不过似乎不太可能对每一种肿瘤转移抑制基因都使用这种重组蛋白的方法(如图2d所示), 际上,除了上述两种分泌型因为有很多肿瘤转移抑制蛋白都是跨膜蛋白或是细胞内蛋白。实 肿瘤抑制蛋白之外,到目前为止,我们只发现了另外一种分泌型肿瘤抑制蛋白——结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)。但是无论如何,我们对KISS1蛋白和BMP4蛋白开展的这些研究工作都为将来的临床应用打下了坚实的基础。 5. 肿瘤转移抑制基因的下游信号途径 我 们已经知道,有好几个肿瘤转移抑制基因都能对肿瘤细胞里的信号通路进行调控,于是有人设想,表达这些信号通路的下游因子是否会增强肿瘤细胞的侵袭能力与转 移能力,它们是不是也可以作为治疗靶点呢,最近有两项研究显示,上述这两个问题的答案可能都是肯定的,而且这些研究已经初步获得了有望在临床上发挥作用的 药物作用靶点。 5.1 RHOGDI2基因 RhoGTP酶解离抑制蛋白2(RhoGTPase dissociation inhibitor 2,RHOGDI2,也被称为ARHGDIB)属于RHOGDI家族,它能下调处于活化状态的Rho家族GTP酶的活性。RHOGDI2蛋白最初是在人膀 胱癌细胞中发现的,科研人员比对了T24膀胱癌细胞及其转移灶细胞T24T细胞的转录组,然后使用源自其它多种人体肿瘤细胞的基因芯片数据(这些数据都是 源自肿瘤各个阶段基因表达下调的基因)对转录有差异的基因进行筛选,结果发现了RHOGDI2基因。RHOGDI2蛋白能抑制T24T细胞在试验动物体内 形成肺转移灶,但不会影响原发肿瘤的生长。而且,我们还观察到RHOGDI2基因表达缺失的膀胱癌患者存活率极低,RHOGDI2基因表达缺失的乳腺癌患 者比较容易发生淋巴结转移,而且RHOGDI2基因表达缺失可以作为判断乳腺癌患者是否容易发生转移的基因信号。 假定RHOGDI2基因表达缺失会导致信号通路失调,而转录水平的改变是肿瘤发生转移的必要条件,于是有人在T24T细胞中转入了RHOGDI2蛋 白,来观察会得到什么结果(图3a)。那些在转染了RHOGDI2基因的T24T细胞中,转录体被下调,而在人膀胱癌细胞中转录体上调的基因被挑选出来进 行下一轮深入研究。经过这种筛选,我们得到了内皮素1(endothelin 1,ET1)。内皮素是一种血管收缩因子,它对内皮素A受体的作用可以被阿曲生坦(atrasentan hydrochloride)这种内皮素受体拮抗剂所抑制。需要提醒的是,阿曲生坦由于一些与它和RHOGDI2蛋白之间联系无关的原因,目前还处于对 IV期前列腺癌患者进行试验的III期临床试验过程当中。在给静脉内注射了T24T细胞的小鼠动物模型使用阿曲生坦之后会明显降低动物体内发生转移灶的几 率,实验组只有5%的小鼠出现转移,而对照组则有53%出现转移(p < 0.0001)。由于阿曲生坦是口服药物,对前列腺癌和肺动脉高压也有治疗作用,因此非常适合作为化疗后预防肿瘤转移的辅助治疗药物。有趣的是, RHOGDI2蛋白也能抑制神经介素U(neuromedin U)的表达。神经介素U与ET1有很多相似之处。在动物实验中发现,神经介素U既能促进转移肿瘤的生长,也能促进恶病质(cachexia)的发生。这再 一次证实了受到肿瘤转移抑制蛋白调控的下游因子对于肿瘤转移具有十分重要的作用。不幸的是,我们目前还没有发现能阻断神经介素U受体的药物。如果真有这种 药物,将会为我们提供一条针对RHOGDI2蛋白下游通路的新途径。 5.2 NM23基因 我们使用了与前面相同的方法在MDA-MB-435乳腺癌细胞(需要提醒大家注意的是,关于MDA-MB-435细胞究竟是起源于乳腺癌细胞还是黑色素瘤 细胞目前还存在争议)中发现了受NM23蛋白调控的转录体,即候选基因。然后如图3b中所示的那样,通过比对转染了NM23基因的细胞和对照细胞里候选基 因的表达差异对这些基因进行进一步确认。同时也通过源自两组乳腺癌患者的基因芯片分析数据,找出那些表达情况与NM23基因表达负相关的基因,与上述候选 基因进行比对,以进一步确认哪些基因是真正受到NM23基因调控的下游基因。结果,我们发现了溶血磷脂酸受体(lysophosphatidic acid receptor,LPAR1,也被称为EDG2)。在乳腺癌细胞中外源表达LPAR1蛋白可以恢复被NM23蛋白所抑制的细胞活动转移能力。这些实验结 果表明,肿瘤细胞内NM23蛋白表达水平降低之后会促使LPAR1蛋白表达水平增高,增强细胞的活动转移能力。 由于细胞的活动能力只是影响肿瘤转移的一个因素,因此有人又进行了体内试验,他们将NM23基因和LPAR1基因共转染一个细胞,来观察这种细胞在 体内形成转移灶(肺转移)的能力。结果发现, LPAR1基因表达水平增高不仅能够延长静脉注射入实验动物体内的MDA-MB-435细胞在肺内的停滞时间,还能恢复被共表达NM23蛋白所抑制的肿瘤 细胞活力。这项研究成果促使我们想到,可以使用Edg家族蛋白拮抗剂来进行治疗,比如可以使用LPAR1蛋白的拮抗剂Ki16425来防止肿瘤转移。目前 有关Ki16425药物的临床前实验正在进行之中。 6. 未来的发展方向以及新兴技术 前 文中提到的研究肿瘤转移抑制基因下游靶标的方法太过于依赖基因表达芯片数据,虽然我们碰巧发现了ET1基因和LPAR1基因,但我们不会每次都这么好运。 我们需要的方法是最起码能在每次试验中都发现一点蛛丝马迹,比如肿瘤细胞因为表达了肿瘤转移抑制基因从而无法转移,同时也发现因为表达了该转移抑制基因, 细胞内某些基因的表达发生了改变等等。不过值得期待的是,最近刚刚出现的Connectivity Map可以为我们提供一个很好的机会,帮助我们系统地发现肿瘤转移抑制基因的下游靶标。 Connectivity Map计划实际上是一个大型的基因表达数据存储数据库。我们用1000种以上的小分子药物处理几种细胞系之后,提取数据存入Connectivity Map中,通过这些数据我们就可以知道,哪些药物会对细胞的基因表达造成哪种影响。我们可以利用这些数据,将它们与细胞内表达肿瘤转移抑制基因之后发生的 后续基因表达改变情况相比较,通过这种比对就可以系统地发现这些能够影响整条信号通路的药物的潜在的作用靶点,从而避免像搜寻ET1基因和LPAR1基因 那样,一个一个地去寻找药物靶点。这种方法相比前面提到的那种方法会更有效,因为该方法能回复参与肿瘤转移过程的基因。而且,这种以实际用药效果为基础的 方法更有利于我们发现哪些药物针对哪种细胞里的哪条信号通路发挥作用,从而能够找出合适的分子标志物来帮助我们筛选出最适合使用该药物的患者,这也非常符 合未来个体化医疗的发展趋势。 信息技术最近的发展也为我们提供了很大的便利,我们能更准确地利用药物在细胞模型上的实验结果来预测药物在人体内的疗效。我们将细胞基因表达谱芯片 检测结果和体外药敏实验结果相结合,这样就能非常准确地预测药物对细胞的作用,然后再将这些结果应用到每一个单独的细胞系,或者患者。在所有这类方法中, 共表达外推法检测系统(Coexpression Extrapolation, COXEN)非常适合用于药物筛选,尤其适合用于发现与转移抑制基因失调有关的药物。实际上COXEN系统就是一套算法系统,它可以根据基因表达芯片的数 据和以往NCI-60对各种肿瘤细胞系进行药敏实验的经验数据推算出哪些基因的表达差异会与某些药物 有关。然后再使用一套特殊的算法对这些在细胞试验中对 药物敏感的基因表达情况与人体肿瘤细胞中同一基因的表达情况进行比较,以最终确定可作为治疗靶点的基因。 更为重要的是,COXEN系统也能进行计算机辅助药物研发工作,它可以基于药物的体外实验结果帮助我们发现最有可能在人体内起效的药物。因此, Connectivity Map计划可以使用表达或不表达肿瘤转移抑制基因的细胞表达谱芯片数据来初步筛选药物,然后再使用COXEN 选,这样就能发现既能在体外发挥作用,同时系统和NCI-60系统对初筛结果进行进一步 筛 也最有可能在体内起效的药物(图4)。 在药物研发工作中的另一项重要进展就是合成致死筛选(synthetic lethal screens)。该方法现在已经应用到肿瘤转移抑制基因的研究工作当中了。这种方法的原理是,如果细胞缺乏某种蛋白,比如肿瘤转移抑制蛋白,那么它对于 某些药物就要比不缺乏这种蛋白的细胞更敏感。Wang等人已经用这种方法对胰腺肿瘤抑制基因SMAD4进行了检测。他们使用药物合成致死法以一大类药物对 外源表达和不表达(使用RNA干扰技术)SMAD4蛋白的同系细胞进行了筛选。结果Wang等人得到了特异性对不表达SMAD4蛋白的细胞有毒性的药物。 这种方法当然也可以用于筛选针对肿瘤转移抑制基因的药物。 7. 总结 目 前看来,肿瘤转移抑制基因是一类为数不多的基因,它们的不表达情况或者功能缺失情况与肿瘤细胞的转移能力正相关。不过如果在动物模型中重新表达这些肿瘤转 移抑制基因,则可以抑制肿瘤转移发生,但不能影响肿瘤细胞的生长。实验数据和流行病学数据都表明,在患者被确诊身患肿瘤时,已经有肿瘤细胞从原发灶处脱 落,进入机体循环系统了。这些散播细胞中有一部分会在循环系统或者远隔器官中死亡,但还有一部分则能够存活下来,繁殖形成微小转移灶或者发生克隆性增殖, 形成临床上可见的转移灶。因此,如何抑制微小转移灶向可见转移灶转变是一个关键问题,而肿瘤转移抑制基因正是针对这一过程发挥作用,因此,它们为我们提供 了一条新的肿瘤治疗途径。 虽然从技术上来说,要针对一个起负向调控作用的基因进行操作比较困难,但最近报道的重组蛋白表达、直接施用重组蛋白,以及针对受肿瘤转移抑制基因调 控的下游靶点的药物等成功案例也给我们带来了一点希望。随着功能基因组学以及蛋白质组学技术的进步,我们一定会更加容易地发现更多肿瘤转移抑制基因,可供 我们选择的治疗靶点也会越来越多,“质量”越来越好,比如我们最近就发现了microRNA转移抑制子。 随着肿瘤转移抑制领域的研究不断深入,我们又发展出了一种新的治疗方法,但与此同时,问题也变得更加突出。比如普遍性问题,即某一肿瘤转移抑制基因 与好几种不同肿瘤细胞的关系;特异性问题,即某一肿瘤转移抑制基因专门针对处于不同转移部位的肿瘤细胞的问题;还有肿瘤转移抑制基因对正常细胞的毒性问题 等等这都需要我们予以系统的解答(背景知识2)。将来发现的肿瘤转移抑制基因有可能会更适合当做治疗的靶点,但也可能不太适合。无论如何,我们在本文中介 绍的这些方法都可以推广,用于更多的肿瘤转移抑制基因,而更先进的信息处理技术也会帮助我们在使用以肿瘤转移抑制基因为基础的治疗过程中,简化药物筛选和 患者选择的过程。 背景知识2:肿瘤转移抑制基因研究领域几大尚未解决的关键问题 普遍性问题 大部分已发现的肿瘤转移抑制基因都只在病理学研究中予以过验证,我们还需要对这些基因表达缺失或突变的比例以及使用何种方法借助这些基因进行治疗的问题进 行详细的研究。由于存在肿瘤细胞在早期就已经在体内广泛散播的事实,肿瘤转移抑制蛋白是不是能够抑制肿瘤细胞的浸润也是值得研究的课题。 特异性问题 最近的研究结果表明肿瘤转移具有明显的组织偏好性,而且这背后隐藏着极为复杂的遗传调控机制。同时该现象也表明肿瘤转移抑制作用还具有高度的组织特异性。我们才刚刚开始对肿瘤转移抑制基因的肿瘤转移抑制作用进行检测。最近有两项这方面的研究报道发表。 适应性问题 做为上述问题的延续,我们想知道,重建肿瘤转移抑制基因功能的疗法是不是只有在肿瘤细胞缺失了这种肿瘤转移抑制基因的功能时才能奏效。这种方法对于其它“无关的”肿瘤细胞会不会因为其它潜在的途径奏效呢, 毒性问题 从理论上来说,重建某一起到负向调控作用的缺失基因,比如肿瘤转移抑制基因的功能时,其毒性要远小于重建起到正向调控正常细胞生理功能作用的基因功能。但 是我们观察到有几个肿瘤转移抑制基因会直接对细胞必须的信号通路起到负向调控作用,那么这是不是一个值得研究的毒性问题呢, 整合问题 要将肿瘤转移抑制基因疗法与现有抗癌疗法相整合也是需要研究的问题,比如抑制肿瘤转移之后会不会降低肿瘤细胞对传统化疗方法的敏感性呢, 患者选择问题 我们现在已经发现了好几种药物,对于具有某些分子损伤的患者特别有效。但我们应该采用哪种分子标志物作为选择患者的依据呢,原发肿瘤是一个合适的选择吗, 实验设计问题 有些患者进入临床试验之后通常都会发生治疗失败、肿瘤转移和复发的情况。那么这些患者是不是能够进入肿瘤转移抑制临床试验,并从中获益呢, 小词典 肿瘤转移细胞克隆性繁殖过程(Metastatic colonization)指的是从原发灶脱离下来的肿瘤转移细胞在新的“定居点”处从小的转移灶逐渐生长形成临床可见的、大的转移灶的过程。 EB病毒(Epstein–Barr virus)属于疱疹病毒属,能导致人类患上传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis)。EB病毒感染也与伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)有关。EB病毒也可能与其它肿瘤相关。 糖皮质激素反应途径(Glucocorticoid response pathway)是一种核激素受体信号途径,它能直接调控参与机体代谢和免疫反应的基因。糖皮质激素受体在与其配体类固醇激素结合之后能诱导下游基因的转录表达。 节奏性化疗方案(Metronomic chemotherapy)即以相对较小的单次剂量和相对较多的给药次数的化疗方案,该方案完全不同于传统的最大耐受剂量给药方法。 TRAMP小鼠模型是一种转基因前列腺癌小鼠动物模型,我们可以在该模型上观察到前列腺癌的各个病理阶段。10~20周龄的TRAMP小鼠已经100%患上了前列腺癌。 纵隔淋巴结(Mediastinal lymph node)即在两肺中间,胸腔正中部位的淋巴组织,上口位于胸廓入口处,底部位于隔膜之上。纵隔淋巴结是肺和其它肿瘤经常发生转移的部位。 正位异种移植(Orthotopic xenograf)即将人体肿瘤细胞注射到啮齿动物体内相同器官的方法。 异位异种移植(Heterotopic xenograft)即经常由于某些技术原因的限制,我们只能将人体肿瘤细胞注射到啮齿动物体内与该肿瘤细胞来源器官不同的器官的方法。 组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases)能够通过去除核小体组蛋白上赖氨酸位点的乙酰化作用来调控染色质的结构与功能,通常的作用都是抑制基因转录。 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases)能催化DNA链上的胞嘧啶甲基化,通常的作用都是抑制基因转录。 失巢凋亡现象(Anoikis)即细胞因为脱离了其生长所需要的基质而死亡的现象。 渗透泵(Osmotic pump)是一种小型可植入式的药物泵,依靠盐浓度来吸收组织间液从而产生压力,以规定的模式将药物释放出来。 合成致死现象(Synthetic lethal)是一种遗传现象,指的是如果发生两种非致死突变或分子损害结果导致细胞无法继续生存的现象。在药物研发领域,可以利用这种机制,比如在只有 一种分子损害的情况下某种药物对细胞是无毒的,但是如果细胞同时发生了第二种分子损害,该药物对于细胞就具有毒性了。 原文检索: Steven Christopher Smith and Dan Theodorescu. (2009) Learning therapeutic lessons from metastasis suppressor proteins. Nature Reviews CanCer, 9:253-264. YORK/编译 三、miRNA——新型肿瘤转移调控器 最 近,有研究者发现,miRNA与肿瘤转移有关。我们将在本文中对miRNA在肿瘤发展后期的作用进行介绍,重点介绍miRNA在肿瘤转移过程中所发挥的促 进或抑制作用,还将就miRNA 在临床工作中作为预测性的分子标志物的价值以及miRNA在肿瘤转移患者临床治疗中的作用进行探讨。另外,我们还认为,同 一miRNA既可以对肿瘤干细胞的表型发挥影响作用,也可以在肿瘤转移过程中发挥作用,意即miRNA在肿瘤形成的初始阶段以及肿瘤发展的晚期阶段均可以 发挥作用。 肿瘤转移过程每一个步骤背后的分子机制,我们基本上还是一无所知。最近,有研究人员发现了miRNA在肿瘤转移过程中的作用,这也使我们看到了能早 日攻克癌症的希望。我们已经知道miRNA与肿瘤的发病过程有关,在绝大多数我们有所研究的人体肿瘤的起始以及发生发展过程中,miRNA以及其它非编码 RNA都发挥了重要作用。最近的研究发现,miRNA可能是肿瘤易感基因(cancerpredisposing genes)的转录产物,其它一些非编码RNA也都与肿瘤的恶性表型有关。 1. miRNA与肿瘤的关系 miRNA是第一个被发现的能控制秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)幼虫发育时间的非编码RNA。miRNA是一种短链的RNA分子,能对基因表达起到调控作用(背景知识1)。在肿瘤细胞内,miRNA的 水平会出现异常,这种现象与肿瘤发病有关。过表达的miRNA会下调抑癌基因的表达,从而导致肿瘤发生,比如淋巴瘤细胞中miR-17–miR-92会降 低致癌转录因子E2F1的水平,但是在肝细胞癌细胞中,miR-21却起到了抑制抑癌基因PTEN的作用。如果细胞内miRNA水平降低,则会令致癌基因 表达,比如let-7家族miRNA能抑制肺癌细胞中的KRAS、NRAS、HMGA2和MYC等癌基因,miR-15a–miR-16-1能下调慢性淋 巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukaemias)肿瘤细胞中的BCL-2基因和前列腺癌细胞以及套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)细胞中的cyclin D1基因。值得注意的是,miRNA对于肿瘤细胞的作用是组织特异性和癌细胞特异性的,比如,在上皮细胞起源的实体细胞瘤细胞以及白血病细胞或淋巴瘤细胞 中,miR-155都有过表达现象,它起到了促进癌症发生发展的作用,但是在内分泌系统肿瘤细胞中miR-155却又是低表达的,说明它在此处可能起到了 抑制肿瘤的作用。 背景知识1:miRNA的起源及其作用机制 miRNA是一种只有19~24个核苷酸组成的RNA链,它由更长的(数百至数千个碱基)前体转录产物剪切而来。miRNA主要来自60~110个碱基组 成的发夹环结构。miRNA是一系列酶切反应的产物,先在核内由drosha酶(也被称为核糖核酸酶3)剪切,然后在胞质中由dicer酶剪切而来。 miRNA能以一种序列特异性的方式调控基因的表达。miRNA参与组成核糖核蛋白 复合体RISC(即RNA诱导的沉默复合体,该复合体包含dicer酶 以及Ago家族蛋白等)之后,能够通过其5’端第2~第8个碱基这一段“种子序列(Seed Sequence,这段序列对于miRNA的分类以及正确识别靶标至关重要)”以部分互补的方式与mRNA结合(主要与mRNA的3’非翻译区相结合)。 miRNA可以影响mRNA的翻译过程及其稳定性,导致蛋白表达量下降。不过随着研究的深入,我们发现miRNA对基因表达的影响作用可能要比我们最开始 预计的复杂得多。比如在某些特定的细胞周期中,miRNA也能够促进mRNA的表达。在细胞退出细胞周期时,miR-369-3和let-7会招募一批特 殊的micro-RNP,比如AGO2(又名EIF2C)和FXR1等到mRNA的3’ UTR区上富含AU的区域,启动某些能够抑制细胞增殖的蛋白的表达。细胞在饥饿状态下,miR-10a能够与核糖体蛋白的5’UTR区相结合,促进其翻 译,这表明miRNA既能够与5’UTR区相结合,也能够与3’UTR区相结合。后来又发现,miRNA还能够与mRNA的编码区相结合,抑制其表达,该 作用机制在胚胎干细胞的分化过程中可以观察到。还有一些特殊的miRNA,比如miR-29b就携带有独特的六碱基终末基序 (hexanucleotide terminal motif)。这些miRNA在核内非常多见,说明不同亚细胞结构中的miRNA可能还具有一些独特的功能。这些核内的miRNA能够在启动子水平影响转 录过程,比如miR-373就能与CDH1基因的启动子结合,促进其转录。 2. 细胞内miRNA失调的机制 对比正常细胞和肿瘤细胞,我们会发现,miRNA在这两类细胞中的表达情况差异非常大,这是一个非常复杂的现象。该现象表明, miRNA可能会对癌基因、抑癌基因、表观遗传学异常以及基因异常等各个方面起到转录调控作用,而这一切作用都与miRNA表达异常有关。miR-34a 就是一个很好的例子。miR-34a能起到抑制肿瘤的作用,它受到p53蛋白的正调控,受到MYC蛋白的检测,会因为异常的CpG甲基化现象而沉默。它定 位在人体染色体的1p36区域,该区域在神经母细胞瘤肿瘤细胞中经常缺失。 我们通过大量的遗传学研究对miRNA的转录调控因子进行分析后发现,在人体肿瘤中有多种miRNA异常现象。肿瘤相关的miRNA主要位于起到转录因子 作用的癌基因和抑癌基因的下游,比如p53蛋白能够启动所有miR-34家族转录,MYC蛋白既能正向也能负向调控各种不同miRNA分子的转录(比如 MYC蛋白能正向调控miR-17–miR-92家族,也能负向调控let-7家族),促使肿瘤形成。同样,能控制肿瘤转移基因表达的转录因子也能调控参 与到肿瘤转移过程的miRNA分子的转录,比如多效转录因子TWIST1就是很好的例子,它能反式激活促转移miRNA分子miR-10b;另一转录因子 SMAD4,能激活转化生长因子β(TGFβ)信号通路下游的miR-155分子。此外,Esteller 小组的lujambio等人进行了另一项研究,他们检测了肿瘤细胞中miRNA编码基因的表观遗传性改变,结果发现miRNA基因超甲基化现象与肿瘤转移 有关。这是我们在了解miRNA失调对于肿瘤转移作用的研究工作中迈出的第一步。我们有理由相信,由于miRNA基因位于肿瘤相关染色体区域 (cancerassociated genomic region)所导致的miRNA增多或缺失机制,以及miRNA前体分子的异常成熟机制都将逐步被我们所了解。本文将对miRNA在肿瘤转移过程中可能 起到的种种作用进行讨论。 3. miRNA在肿瘤转移过程中的促进作用 在过去的一年半时间里,我们又发现了好几种miRNA。这些miRNA能对多条信号通路发挥调控作用,主要针对参与肿瘤转移过程的多个重要蛋白,促进肿瘤转移发生。下面将对这些miRNA逐个介绍。 3.1 TWIST1–miR-10b–HOXD10机制 Weinberg研究团队的Ma等人是最早研究miRNA分子在肿瘤转移过程中扮演何种角色的科研 人员。他们在体外实验和体内试验中都 发现,miR-10b上调会促进肿瘤转移和侵袭,甚至会促进非浸润性乳腺癌细胞转移,但不会影响到肿瘤细胞增殖(图1及表1)。最开始,科研人员们在一组 乳腺癌样本(该组样本不考虑转移因素)中发现,相比正常乳腺组织,肿瘤样品中miR-10b分子的表达下调,但是随即Ma等人又发现,在约50%的乳腺癌 转移灶样品中,miR-10b分子是过表达的。不过后面这个发现(即在半数的转移样品中miR-10b分子是过表达的)并没有与前面的发现(即在乳腺癌整 体样品中miR-10b分子是下调的)发生冲突。因为实际上,miRNA表达情况分析本来就是对异质性的原发灶肿瘤样品进行的,在这些样品中既包含侵袭性 的肿瘤细胞,也包含转移瘤细胞。另外,研究人员还发现,miR-10b会受到促转移转录因子TWIST1的作用表达(转录)上调,它在由TWIST1诱导 发生的上皮-间质转化过程(epithelial–mesenchymal transition,EMT)中起到了关键作用。与TWIST1蛋白过表达的情况一样,miR-10b分子也不是在肿瘤形成早期就表达的,在早期乳腺癌 细胞中miR-10b分子就有表达,不过这与肿瘤患者的远期无复发生存率(distant recurrence-free survival)无关。我们是通过抑制同源异形盒蛋白D10(homeobox protein D10,HOXD10)的翻译发现了miR-10b分子的促肿瘤转移作用的。HOXD10蛋白是一种转录因子,它在细胞活动过程中发挥了重要作用。在缺乏 HOXD10蛋白功能的细胞中,Rho GTP酶RHOC帮助miR-10b分子赋予细胞迁移与浸润的能力。简而言之,在肿瘤发生发展过程当中,TWIST1蛋白诱导miR-10b分子表达,然 后miR-10b分子直接抑制了RHOC转录抑制因子HOXD10的表达,从而间接增加RHOC的水平。 注:肿瘤转移的靶标包括在体外实验,如western blot和萤光素酶实验中经过验证的靶标和(或)计算机模拟出来的以及细胞系中与miRNA的表达水平负相关的靶标或病人样品。肿瘤特异性是指结肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈部癌症以及黑色素瘤特异性。 BRMS1, breast cancer metastasis-suppressor 1:乳腺癌转移抑制因子1;CLL, chronic lymphocytic leukaemia:慢性淋巴细胞性白血病;DLBCL, diffuse large B cell lymphoma:弥漫性大B细胞淋巴瘤;ECM, extracellular matrix:细胞外基质;EMT, epithelial–mesenchymal transition:上皮-间充质转化;HOXD10, homeobox D10:同源异形盒D10;IL-6, interleukin 6:白介素6;IRAK1, iL-1 receptor-associated kinase 1:白细胞介素-1受体相关激酶1;LOH, loss of heterozygosity:杂合子丢失;MAT, mesenchymal–amoeboid transition:间充质移动方式向阿米巴样移动方式转变; ND, not determined:不明;NF-κB, nuclear factor-κB:核因子κB;PIK3R2, phosphoinositide 3-kinase regulatory, subunit 2:磷酸肌醇3激酶调控亚单位2;PDCD4, programmed cell death 4:程序性细胞死亡因子4;ROCK1, rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1:rho因子相关的包含卷曲螺旋结构的蛋白激酶1;STAT3, signal transducer and activator of transcription:转录信号转导因子和激活因子3;TGFβ2, transforming growth factor β2:转化生长因子β2;TGIF2, TGFβ-induced factor homeobox 2:转化生长因子β诱导的效应因子同源异形盒2;TIMP3, tissue inhibitor of metallopeptidase 3:金属肽酶3组织抑制因子;TNC ,tenascin c:粘蛋白c;TPM1, tropomyosin 1:原肌球蛋白1;TRAF6, TNF receptor-associated factor 6:肿瘤坏死因 ;VCAM1, vascular cell adhesion molecule 1:血管细胞粘附分子1。 子受体相关因子6 3.2 miR-373与肿瘤进展及扩散的关系 Huang科研小组与Agami小组通力合作,使用miRNA表达文库进行正向遗传学筛选后发现,miR-373和miR-520c也都能促进肿瘤转移 (图1及表1)。最初是Agami小组发现了miR-373,他们在睾丸生殖细胞瘤(testicular germ cell tumours)中发现miR-373可能是一种癌基因,因为他们发现miR-373能够对抗HRAS诱导的p53反应,同时miR-373也参与到细胞 转化的过程当中。在对MCF-7乳腺癌细胞进行的体外实验当中,我们发现细胞内miR-373或者miR-520c呈过表达现象,这会增强肿瘤细胞的迁移 及侵袭能力。而且,实验还发现,将这些肿瘤细胞移植到裸鼠体内之后会在多个器官形成转移灶,但是对照细胞则不会形成转移灶。miR-373和miR- 520c都包含一段相同的“种子序列(背景知识1)”,而且它们也有共同的直接靶标——CD44基因,该基因能编码一个细胞表面透明质烷 (hyaluronan)受体,但是在具高度转移能力的乳腺癌细胞上却表现出CD44受体缺如的现象。同时研究还发现CD44受体在前列腺癌和结肠癌中起 到了肿瘤抑制因子的作用。因此,由于miR-373或者miR-520c过表达而抑制了CD44蛋白的表达,这样肿瘤细胞就具有了更强的转移能力。后来又 有人发现在乳腺癌原发灶细胞里miR-373同样是上调的,尤其是在有淋巴结转移的乳腺癌细胞中更是如此,同时还伴有CD44表达量的降低,这就更加进一 步证实了Agami等人的科研成果,同时也表明miR-373和miR-520c具有重要的临床意义。 3.3 miR-21是调控肿瘤转移过程的主要因子 由于miRNA导致的细胞骨架蛋白表达水平的改变能够影响细胞的形态和活动,miR-21就是一个很好的例子(图1及表1)。miR- 21是一种癌基因,同时也是各种实体瘤细胞中最常见的过表达miRNA分子,它参与了肿瘤转移的多个步骤。在乳腺癌模型中发现,miR-21能够下调抑癌 基因肌球蛋白1(tropo myosin 1,TPM1)的表达。TPM1蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白(actinbinding protein),它能够抑制细胞不依赖锚定蛋白的生长过程。鉴于TPM1蛋白在细胞骨架组织中的作用,科研人员继续对它展开了更深入的研究,希望弄清楚 miR-21究竟是通过对TPM1施加影响还是对其它靶标发挥作用,来调控肿瘤细胞运动能力的。后来又对多种不同的肿瘤细胞模型,比如乳腺癌、结肠癌、神 经胶质瘤等进行体外实验和体内试验。结果发现,miR-21能够促进细胞侵袭和转移。这可能是由于miR-21直接抑制了maspin (SErPInB5)和细胞程序死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)的而造成的。这两个蛋白都是促转移因子尿激酶纤溶酶原活化因子表面受体(urokinase plasminogen activator surface receptor,uPAR)的调控因子。后来在人乳腺癌标本中发现,miR-21的表达水平与PDCD4或maspin的表达水平负相关,表明miR- 21具有重要的临床价值。而且还发现miR-21能够赋予肿瘤细胞转移的能力,因为它能直接抑制RECK和金属蛋白酶3组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases 3, TIMP3)这两个金属蛋白酶抑制剂和磷酸酶PTEN的表达,从而提高金属蛋白酶(metalloproteinase, MMP)的活力。实际上,细胞内由于miR-21导致的PTEN表达下调会促进成簇黏附激酶(focal adhesion kinase 1, FAK1)的磷酸化,继而上调MMP2和MMP9的表达。 4. 具有肿瘤转移抑制作用的miRNA 还有一些研究证据表明miRNA具有抑制肿瘤转移的作用。 4.1 肿瘤转移过程中的多能miRNA 4.11 miR-335和miR-126 Massagué’s研究团队的Tavazoie等人是第一次发现具有肿瘤转移抑制能力的miRNA存在的人,他们在研究具有转移能力 的乳腺癌细胞时发现,这些miRNA在转移肿瘤细胞中表达下调。在这些miRNA中,miR-335、miR-126和miR-206(见图1及表1)总 是在转移灶细胞中表达下调,而在移植瘤小鼠模型中发现,如果肿瘤细胞恢复表达这些miRNA,那么出现转移灶的几率明显下降。后来研究人员又在人体原发瘤 中同样发现miR-335或miR-126的低表达现象,而且这种低表达现象与患者极低的无转移生存率密切相关,这也为Tavazoie等人的发现提供了 临床证据。miR-335抑制乳腺癌转移的能力可能部分是因为它能直接抑制SOX4蛋白的表达。SOX4蛋白是一转录因子,它参与细胞原始发育和迁移过 程,最近又发现它参与了肝细胞癌的转移过程,因为它参与了神经纤毛蛋白 1和臂板蛋白3C(semaphorin 3C)的转录调控过程。miR-335还能抑制糖蛋白韧粘素C(TNC)的表达。该蛋白能抑制细胞与细胞外基质间的相互作用。TNC蛋白在大多数实体瘤的 微环境中都大量表达,参与细胞恶性转化过程及转移过程中的多个步骤。此外,细胞缺失miR-335还可以从以下两个方面增强其转移能力,即上调能促进肿瘤 转移基因表达的转录因子的表达和肿瘤细胞移动的细胞外基质蛋白的表达。 肿瘤形成转移灶的过程还包括肿瘤细胞在转移灶处增殖的过程。Massagué研究小组后来又发现miR-126在人体转移肿瘤细胞中也有表达量下降的现 象。在体外实验中没有发现miR-126能够影响细胞的运动能力,发现其能影响细胞的增殖(体外实验),还能影响体内原发肿瘤的大小以及转移灶的增殖,这 也就意味着miR-126能够影响肿瘤细胞的增殖过程。在非小细胞肺癌体外模型中还发现miR-126能够影响细胞的粘附、迁移和侵袭行为,这部分归功于 它对CRK蛋白的抑制作用。CRK蛋白是配体信号蛋白,它参与了肌动蛋白的重构、黏着斑的形成以及细胞的迁移过程。 综上所述,这些研究成果表明miRNA也具有抑制肿瘤转移的作用,比如miR-126在肺癌模型中就起到了抑制细胞运动的作用,但是它不能影响肿瘤细胞的 增殖。不过,miR-126在乳腺癌模型中却能够抑制肿瘤细胞的增殖。值得一提的是,我们到目前为止还没有运用体内试验研究过miR-126对于肺癌细胞 的影响,因此我们无法排除miR-126能够抑制肺癌细胞增殖的可能性。 4.12 miR-29c——肿瘤微环境的调控者 在发现miR-335能够调控TNC表达之后,我们就发现miRNA能够以调控肿瘤细胞所处局部微环境的结构的方式来影响肿瘤细胞的转 移过程,因为细胞所处的微环境也是影响细胞运动及生存的重要因素。能抑制MYC表达的miR-29c(图1、表1)就是该理论的有力支持者。在能够影响改 变肿瘤细胞自身所处局部微环境的肿瘤细胞中,miR-29c的表达就会出现异常。实际上,miR-29c对于高侵袭性高转移性的鼻咽癌细胞具有明显的抑制 作用,能够抑制一系列编码细胞外基质组成蛋白基因的表达,比如胶原蛋白,包括6种不同的胶原蛋白和层粘连蛋白γ1 G1等。有趣的是,这些miR-29c的靶标基因都与肿瘤细胞转移有关。虽然我们还没有发现miR-29c能够直接抑制肿瘤转移的证据,但是它与肿瘤侵袭 性之间的密切关系以及它所针对的靶标都显示,miR-29c极有可能是一种肿瘤转移抑制miRNA。 4.13 miR-146——控制肿瘤运动能力的开关 肿瘤细胞可能会发展出不同的运动能力以帮助它们成功转移到其它地方。间充质移动方式向阿米巴样移动方式的转变过程 (mesenchymal–amoeboid transition)能帮助肿瘤细胞以“极高”的速度迁移并转移,这种迁移方式名为“阿米巴样运动(amoeboid motility)”。在阿米巴样运动过程当中,细胞的形态可以像阿米巴原虫一样具备高度的可变性,这样它们就不需要降解细胞外基质屏障(即依赖蛋白酶的 间充质移动方式)即可顺利迁移了。依赖ROCK1激酶和ROCK2激酶的RHOA信号通路能够为间充质移动方式向阿米巴样移动方式的转变过程提供所必须的 肌动球蛋白收缩力(actomyosin contractile force)。 令人感兴趣的是,在对前列腺癌转移灶形成过程的研究中还发现了另一种 miRNA——miR-146a。miR-146a能够通过Rho信号通路影响肌动蛋 白重构过程(图1、表1)。在前列腺癌转移患者体内经常会观察到miR-146a缺失的现象。前列腺癌转移瘤细胞的miRNA表达谱与细胞的分化程度有 关。研究表明,在不依赖雄性激素的前列腺癌细胞——PC3细胞中,miR-146a能够直接降低依赖Rho因子的蛋白激酶ROCK1蛋白的表达。 ROCK1蛋白除了在肿瘤细胞阿米巴样运动过程中起到重要作用之外,还能参与体内透明质酸介导的(hyaluronanmediated)不依赖激素的 (hormone refractory)前列腺癌细胞转化和转移的过程。因此,在PC3细胞中过量表达miR-146a分子能够显著抑制细胞增殖、浸润以及骨转移过程,但 是不会对已分化的依赖雄性激素的前列腺癌细胞造成任何影响,因此在这些癌细胞中miR-146a分子的表达也未受影响。实际上,在前列腺癌的发生发展过程 当中,miR-146a缺如是在疾病后期才出现的一个现象,其对于肿瘤细胞增殖的影响与原发性肿瘤的相关性可能小于与肿瘤细胞向远处转移的相关性。 后来,科研人员又通过抑制白介素1受体相关激酶1(interleukin 1 receptorassociated kinase 1, IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TnF receptorassociated factor 6, TRAF6)表达的方法进一步证实了miR-146a分子对于肿瘤转移的作用。在MDAMB231乳腺癌细胞中,miR-146家族分子能够抑制 NFκB的活性,遏制肿瘤细胞转移。在多种不同的肿瘤细胞中,NFκB持续激活是一个非常常见的现象,它能够诱导Twist、ZEB1、ZEB2、波 形蛋白(vimentin)、金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶B(cathepsin B)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z)和TNC等蛋白的表达,因此能够促进肿瘤细胞的恶性增殖、抗凋亡以及血管生成过程。此外,NFκB还参与了上皮-间质转化过程。有趣的是,miR- 146a抑制ROCK1蛋白的表达也是其影响NFκB功能的一条作用机制,因为ROCK1蛋白可以通过RHOB蛋白增强NFκB的转录活性。由于在肿 瘤细胞中会有各种各样的信号异常激活NFκB途径,因此miR-146家族分子的临床使用价值非常突出。不过我们还需要进一步研究,希望在除了乳腺癌之 外的其它肿瘤中验证miR-146家族对NFκB途径的抑制作用。 4.14 影响转移miRNA分子的表观遗传学信号 正如前文所述,miRNA的表达会受到某些表观遗传修饰信号的影响。在那些DNA去甲基化之后能够重新表达的miRNA分子中,miR -148a、miR-34b和miR-34c能够下调MYC、E2F3、CDK6和TGIF2等癌基因的表达,因此它们在体外实验中能够抑制细胞运动,在 体内试验中能够抑制肿瘤生长和转移。更为重要的是,在结肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈部癌和黑色素瘤等肿瘤细胞中由于DNA CpG岛超甲基化作用导致miR-34b、miR-34c、 miR-148和miR-9-3等分子不表达的情况与这些肿瘤发生淋巴结转移密切相关。 5. miRNA与肿瘤转移及肿瘤干细胞之间的关系 我们推测某些miRNA可能既参与维持肿瘤干细胞的表型作用,也参与肿瘤细胞的浸润与转移过程,即这些miRNA同时参与了肿瘤细胞的原发和转移这两大过程。 5.1 miRNA–CSC–EMT之间的联系 肿瘤干细胞似乎参与了肿瘤从形成、发展到扩散的所有环节,这些干细胞在肿瘤发生发展过程当中似乎是受到共同机制的调节,但机制形式功能 的方式我们暂时还不清楚。不过miRNA与肿瘤干细胞关系密切。胚胎干细胞里某些miRNA分子的丰度非常高,这些miRNA一方面对胚胎干细胞基因的表 达可以起到调控作用,另一方面它们自身的表达又受到了自我更新转录因子(selfrenewal transcription factor)和多潜能转录因子(pluripotency transcription factor)的调控。不过让我们吃惊的是,在胚胎干细胞中发挥重要功能的miRNA中,大部分也都参与到了细胞周期调控和肿瘤发生的过程,该发现也印证 了miRNA能够决定细胞干细胞状态的假说。该假说认为,肿瘤细胞就是由于miRNA表达异常所致。 越来越多的证据表明,miRNA可能会影响肿瘤细胞的干细胞状态,因此,miRNA也就可以通过 对EMT过程的调控作用将肿瘤细胞的干细胞状态与其转移过 程联系起来,因为EMT这个遗传发育过程既与干细胞状态有关也与肿瘤转移过程有关。一方面,Weinberg实验室的Mani等人发现,EMT过程与肿瘤 细胞的干细胞状态之间相互交织。他们研究发现肿瘤细胞在EMT改变过程中的表现与肿瘤干细胞的表现非常相似;另一方面,有研究者发现多种miRNA都参与 了EMT改变过程(背景知识2)。由miRNA诱导的EMT过程不仅是肿瘤细胞转移的一种机制,同时还在肿瘤形成过程中扮演了重要角色,因为EMT过程可 以帮助肿瘤细胞避免癌基因导致的细胞衰老(oncogeneinduced cellular senescence),同时还可以帮助转移到其它部位的肿瘤细胞保持自我更新的能力。只有那些具有极强复制能力和可塑性的细胞,比如具有EMT特性的干 细胞才能在转移部位存活下来,并形成巨大的转移灶。比如,在多种肿瘤细胞中过表达现象非常普遍的一种miRNA——miR-155分子就能促进肿瘤细胞的 形成。研究发现该miRNA分子也参与了EMT过程和肿瘤发展过程,这可能也说明肿瘤细胞具有某些干细胞的特 质。 背景知识2:miRNA能够促进上皮-间质转化过程 上皮-间质转化(EMT)是细胞的一种发育过程。通过EMT过程细胞与细胞间的连接或者细胞与细胞外基质间的连接会被解离,细胞的转移 模式会从集体浸润模式(collective invasion pattern)转变成分离的、散播的迁移方式(detached and disseminated cell migration method)。在肿瘤发展和去分化过程当中,发生EMT改变的肿瘤细胞的浸润能力和转移能力均大为增强,因此患者的临床预后都极为不佳。 据报道,多种miRNA分子都会专一性地影响EMT转变过程。比如在肿瘤细胞发生EMT转变时,miR-200家族成员miR-200a、miR- 200b、miR-200c、miR-141、miR-429以及miR-205表达都会下调。肿瘤细胞中缺乏miR-205和miR-200主要是因为 ZEB家族转录因子的活性受到抑制,ZEB家族转录因子能够调控EMT相关蛋白的表达,比如上皮-钙粘蛋白 (epithelial-cadherin)、 粘蛋白(mucin)、紧密连接蛋白ZO3(tight junction protein ZO3)、连接蛋白26(connexin 26)和血小板亲和蛋白2(plakophilin 2)等。同时,上述一些miRNA分子能够在不同层面起到控制EMT过程的刹车开关作用。比如miR-141就能直接抑制TGFβ的表达,而TGFβ正是 调控EMT过程的关键调控因子。再比如miR-200家族成员和miR-205能够直接抑制Zeb家族转录因子,从而维持上皮细胞的特性。因此,如果肿瘤 细胞缺乏这些miRNA分子,正如呈现间充质细胞表型(mesenchymal phenotypes)的浸润性乳腺癌细胞或者缺乏上皮-钙粘蛋白的化生性乳腺癌细胞(metaplastic breast cancer)中所表现的那样,就会启动EMT转化过程。但是在正常的内环境稳定的组织中,这些miRNA能够起到控制EMT转化过程和间充质细胞向上皮 细胞转变过程的开关的作用。 miR-155是另一与TGFβ诱导的上皮细胞可塑性功能有关的miRNA,因此,它也与细胞迁移和侵袭力表型相关。miR-155是TGFβ和 SMAD4的下游效应因子,它至少部分参与了TGFβ诱导的RHOA抑制作用,因此起到了松解细胞间紧密连接的作用。同时,还有人报道在侵袭性乳腺癌细胞 中miR-155分子表达会出现上调,说明该分子也与乳腺癌转移有关。 5.2 肿瘤细胞、干细胞以及肿瘤转移细胞间的联系 Song实验室的Yu等人进一步揭示了let-7对于肿瘤干细胞扩展和运动的作用。在乳腺癌肿瘤干细胞(也被称为肿瘤起始细胞)中, let-7分子的表达通常都是受到抑制的,该现象也与肿瘤细胞在体外实验中表现出的不依赖锚定蛋白就能生长的特性和肿瘤细胞与HRAS抑制有关的自我更新 能力以及与HMGA2抑制有关的多向分化能力相关。 将乳腺癌干细胞移植到NOD–SCID小鼠模型中之后还发现,在乳腺癌干细胞中let-7表达受抑还会增强体内细胞的癌变几率以及肿瘤细胞的转移能力。另 一与细胞保持干细胞特征有关的miRNA——miR-206在间充质干细胞起源的神经元细胞分化过程中也表现出缺失现象,该现象与乳腺癌细胞转移灶复发负 相关,说明miR-206分子也具有抑制肿瘤转移的作用。还有一 个miRNA——miR-101-1也能说明miRNA在维持细胞干细胞状态和细胞转移过 程中起到的双重作用。miR-101-1能够直接抑制EZH2蛋白表达。EZH2蛋白是在胚胎干细胞中具有重要调控作用的多梳蛋白(polycomb protein)的表观调控因子。miR-101-1能够调控肿瘤的增殖、浸润和转移过程。在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌等肿瘤中,miR- 101-1的表达都明显下调(在转移性前列腺癌中这种下调现象更加明显),同时EZH2蛋白的表达也随之增加。因此,在干细胞中发挥重要作用的miR- 101-1,也在肿瘤细胞中发挥了重要作用,它的下调是肿瘤发生发展的重要机制。 6. miRNA可以作为肿瘤转移的标志物 在肿瘤研究领域,有一个非常重要的研究方向就是寻找能够预测肿瘤转移的分子标志物。miRNA就是一个非常有希望的候选分子。最近我们已经在好几种肿瘤中发现了一些非常有潜力的“种子选手”。 6.1 在乳腺癌细胞中的miRNA分子标志物 在前文所介绍的Massagué研究团队的科研工作中,研究人员发现miR-335能够下调6种基因的表达。通过对已知的取自368名 乳腺癌患者基因表达谱数据的分析发现,这6种基因信号与患者极低的无转移灶形成存活率之间具有非常密切的联系。而且,miR-335和miR-126表达 下调也与患者极低的无转移灶形成存活率之间具有非常密切的联系,因此,miR-335和miR-126是非常好的分子标志物,可以据此(miR-335和 miR-126以及上述6基因信号)来判断乳腺癌患者出现转移灶的风险及其预后。 6.2 在肝细胞癌中的miRNA分子标志物 Wang研究团队的Budhu等人对大量肝细胞癌患者进行研究后发现了一种具有特异性的20个miRNA分子组成的分子信号。该信号可用于判断肿瘤是否发 生血道转移。不过我们有必要对该研究成果做两点说明:第一,Budhu等人所发现的这20种miRNA分子中没有一个曾经在乳腺癌研究中被发现过,说明 miRNA调控肿瘤转移的方式可能存在着组织特异性;第二,使用miRNA作为分子标志物要比使用基因更方便,因为使用miRNA可能只需要几十个就已经 足够了,但是使用基因则可能会需要数百个。 6.3 在其它癌细胞中的miRNA分子标志物 还有人对其它类型的肿瘤进行过类似的研究,其中有两项研究成果也证明,miRNA作为判断肿瘤转移的分子标志物是非常有潜力的。科研人 员们使用实时定量逆转录PCR技术发现miR-205可以作为判断头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)是否发生转移的分子标志物。另外研究还发现,mir-29b、miR-9和miR-9*(即miRNA前体RNA分子发夹结构中与形 成miR-9的RNA相对的另一段小RNA片段的成熟产物)都是在大脑原发灶肿瘤细胞中特异性表达的miRNA分子,可以凭借这些分子判断大脑原发肿瘤与 继发灶转移瘤。 6.4 借助miRNA判断出肿瘤的原发部位 有一类肿瘤属于原发灶不明的肿瘤(cancer of unknown primary site,CUP)。患有这类肿瘤的患者在所有肿瘤患者人群中的比例大约为3%~5%。我们无法判断这些CUP患者体内的肿瘤源自何处,因此很难采取相应 的治疗措施,从而导致这类患者存活率非常低。不过最近,有两项大型的研究工作表明miRNA表达谱有望给CUP患者带来福音。 Lu等人对350多例CUP肿瘤样品进行基于磁珠的流式细胞技术(beadbased flow cytometric technique)分析之后发现,对于一小部分分化极差的肿瘤细胞来说,使用组织学方法检测是根本不可能的,但是使用miRNA分类法会比使用mRNA 分类容易得多。Rosenfeld等研究人员将芯片技术和实时PCR技术相结合,对源自22个不同肿瘤组织样品(包括普通肿瘤和CUP肿瘤,包括原发灶样 品和转移灶样品)的400个新鲜冷冻石蜡包埋处理的标本进行了检测,结果发现有48种miRNA可以作为判断肿瘤起源的标志。在分析大部分样品(包括 131个转移灶样品)时使用这些标志物可以达到超过90%的准确率。该研究表明,在分析肿瘤起源问题 时,只需要几十个miRNA就能起到比几百个mRNA 更好的效果,这更加坚定了我们在临床工作中研究并使用miRNA的信心。 7. miRNA与转移肿瘤的治疗问题 绝 大部分的肿瘤患者最终都是死于肿瘤转移,因此了解肿瘤转移的机制和如何早期发现转移灶,并及时治疗转移患者一直以来就是医疗界面对的首要问题。最近的众多 研究表明,使用miRNA可能是一条非常合理、非常有希望的途径。因此,在实体瘤中使用拮抗剂(antagomir,即根据microRNA成熟体序列而 设计,经过特殊标记与修饰的单链RNA,专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂)或反义miRNA(antimiRNA)来抑制miR- 10b、miR-21、miR-146家族、miR-155、miR-373和miR-520c等分子的表达水平,或者使用模拟miRNA(mimic miRNA,见背景知识3)在胞内提高miR-126、miR-148a、miR-206、miR-335以及miR-200家族分子的表达水平都可以进 行肿瘤干预的临床前实验。如果实验成功就可以进入I期临床试验,与现有的抗癌治疗措施一起造福人类。虽然前途很光明,但是目前,miRNA疗法对于肿瘤转 移患者还没有发挥出明显的提高患者生存率或者低毒性的治疗作用。 背景知识3:miRNA靶向疗法 在miRNA相关研究领域中最激动人心的研究方向就是研究基于miRNA的治疗方法了。RNA抑制方法可以在以下几个方面用于治疗肿瘤转移患者。 首先,可以使用RNA或DNA分子作为治疗药物以抑制参与肿瘤转移基因的mRNA分子的表达; 其次,可以干预参与肿瘤细胞扩散和浸润的非编码RNA分子。 最近在临床前实验和临床研究中使用的大多数RNA抑制剂都是反义寡核苷酸(ASO)、核酶(ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme)或小干扰 RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。miRNA和反义miRNA药物目前尚处于临床前实验和体外毒性实验阶段。 ? 反义miRNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotide,AMO)是一种单链的由17~22个核苷酸组成的分子,常伴有化学修饰,通常的修饰方式是2′-O-甲基团修饰。AMO 能够直接抑制某一特殊的miRNA。AMO的作用方式与ASO类似,即通过碱基配对原则与目的miRNA相结合,然后特异性抑制其功能。 ? 铆定核酸(locked nucleic acid,LNA)是对ASO进行LNA修饰后的产物。所谓LNA技术指的是通过引入2′-O,4-C亚甲基桥形成模拟N型构象的二环高亲和力RNA技 术。LNA反义miRNA的作用机制与ASO和AMO的作用机制相同,但是它具有高稳定性和更高的与靶标特异性亲和的优势。 ? Antagomir是一种由23个碱基构成的单链RNA分子,它能与目的miRNA分子互补。 Antagomir会被部分磷硫酰骨架修饰,以及全链2’-O-甲基化修饰,以增强其稳定性,从而防止被降解。目前我们还不清楚Antagomir沉默 miRNA的作用机制,Antagomir-miRNA复合体能促使miRNA发生降解,然后Antagomir会被重新利用。 ? 模拟miRNA(mimic miRNA)是一种部分双链RNA,它能模拟内源性前体miRNA,经细胞处理后形成活性miRNA分子,针对特定mRNA发挥作用。 8. 前景展望 很有可能在不久的将来,我们就能弄清楚非编码RNA(ncRNA)与肿瘤转移之间的关系,找到更多的实验证据,发现更多的临床意义。 首先,在未来的五年里,我们会看到更多的科学研究,发现更多非编码RNA与多种人体肿瘤转移之间的关系,弄清楚与肿瘤 转移相关的基因和miRNA之间错综复杂的相互作用关系。还 有一些非编码RNA,比如非编码高度保守基因(noncoding ultraconserved gene,即在人、大鼠和小鼠基因组中100%相同的DNA保守区域的转录产物)或其它目前未知的非编码RNA也有可能参与了肿瘤转移过程并发挥重要作 用。这些ncRNA可能不仅对基因表达发挥调控作用,还能对其它ncRNA,比如miRNA发生调控作用。 其次,极有可能有一些miRNA在肿瘤干细胞和早期转移肿瘤细胞中起到了重要的生物学功能。还有一点需要注意的是,miRNA可能还会通过对血管生成作用的影响间接影响肿瘤转移(背景知识4)。 最后,也是对于肿瘤患者最为重要的一点是,miRNA和ncRNA可能可以发挥预测肿瘤转移的作用。鉴于我们对于miRNA的研究成果,尽快开发出抑制miRNA的治疗方法或者模拟表达miRNA的治疗方法已经被提上了议事日程。 背景知识4:miRNA抑制肿瘤转移机制之一——抑制血管形成 新生血管生成在肿瘤发生发展过程中也起到了重要作用。借助这些血管,肿瘤细胞可以转移到机体其它部位。在介绍miRNA在肿瘤转移过程中的作用时不得不提 到它对于血管生成的影响。首先,肿瘤缺氧适应反应部分是通过缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF1)发生的,这也增加了多种miRNA的表达,比如miR-26家族、miR-107和miR-210的表达促进了肿瘤细胞的生长和存活;促进 miR-27a的表达抑制了ZBTB10蛋白的表达,间接影响了血管内皮生长因子(Vegf)及其受体的表达水平,同时促进了miR-210的表达,抑制 内皮附着型配体蛋白ephrin A3的表达,促进了肿瘤血管生成。此外,缺氧还会抑制miR-16、miR-15b、miR-20a和miR-20b的表达,从而直接抑制血管内皮生长因 子,使得血管内皮生长因子持续表达,促进血管生成作用。 在所有与内皮细胞功能相关的miRNA分子中,miR-221和miR-222具有相同的种子序列。这是miRNA具有组织特异性的极好例证。实际上,在 内皮细胞中缺乏miR-221和miR-222会维持KIT蛋白的增殖及血管生成功能,但是通常在肿瘤细胞中观察到的都是因为细胞周期依赖激酶抑制蛋白 p27(cyclin-dependent kinase inhibitor p27,该蛋白是肿瘤转移抑制蛋白)被抑制所致的KIT蛋白表达上调的现象,因此肿瘤细胞的增殖能力和转移能力也都有所增强。miR-126在内皮细胞和 肿瘤细胞中的表达情况与对细胞的作用则恰好相反。在内皮细胞中,miR-126表达上调,通过抑制SPRED1和磷酸肌醇3激酶调控亚单位 (phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 2,PIK3R2)来维持促血管生成因子信号通路的作用;在肿瘤细胞中,miR-126表达下调,促进肿瘤细胞转移并在转移部位增殖。 MYC激活的miR-17–miR-92参与了形成高侵袭性、高血流灌注肿瘤病灶的过程,这也证明了MYC的促血管生成作用。尤其值得一提的是,miR- 18a、miR-19a以及源自miR-17–miR-92的miR-19b-1都与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和抗血管生成粘附糖蛋白(anti-angiogenic adhesive glycoprotein)血小板反应蛋白1(thrombospondin 1,TSP1)的表达抑制有关,而这两个蛋白在细胞外基质重构过程中都具有非常重要的作用。TSP1蛋白也受到其它诸如let-7f和miR-27b一类 的miRNA分子的调控。未来我们还会发现更多的参与肿瘤血管生成过程的miRNA分子。 原文检索: Milena S. Nicoloso, Riccardo Spizzo, Masayoshi Shimizu, Simona Rossi and George A. Calin.(2009) MicroRNAs — the micro steering wheel of tumour metastases. Nature , 9:293-302. Reviews Cancer YORK/编译 四、人体肿瘤平行转移模型 癌 症的全身转移大致可以用两种简单的模型加以说明。主流观点都认为,肿瘤转移是源自原发灶的高度恶性肿瘤细胞。第二种则认为是源自肿瘤发生早期,即散播出来 的转移瘤细胞,它们是平行的,相互独立的转移过程。本文对原发肿瘤与转移瘤进行了深入研究,搜集了肿瘤病程各个阶段的数据,包括肿瘤生长的速度、活检结 果、临床试验结果以及分子遗传学分析结果。经研究发现,肿瘤实际上是通过上述第二种模型发生转移的。该发现促使我们写作了本文,对目前的肿瘤诊治常规进行 了一次详细的综述。 虽然我们在抑制肿瘤细胞生长,提高患者的存活率方面取得了一定成绩,但是癌症仍然是现阶段美国85岁以下年龄段人群中最主要的致死性疾病。而这些死 亡患者中大部分都是由肿瘤转移性疾病致死的。因此,如何阻止肿瘤转移已经成为了临床研究中的热点话题。目前阻止肿瘤转移的主要方法主要包括早期手术疗法 (某些情况下采用的放疗疗法)辅以全身性系统化疗疗法(Systemic therapy)。先化疗后手术的疗法称为新辅助疗法(neoadjuvant therapy),在先手术后化疗的方法则称为辅助疗法(adjuvant therapy)。化疗方法主要针对从原发灶脱离下来的肿瘤细胞,这些转移细胞是常规的临床影像学检查方法无法检查到的或者是手术方法无法去除的。 原发灶一旦被切除之后,异时性转移(metachronous metastase)肯定是由那些在手术前就转移到身体其它部位的肿瘤细胞所造成的。这些“漏网之鱼”被称作播散的肿瘤细胞(disseminated tumour cells,DTC)。DTC可以是任何类型的离开原发灶转移至机体其它部位的肿瘤细胞。不过我们并不能未卜先知地预测出是哪一个DTC细胞能够形成后来 致命的转移灶;也不能预测出是哪一个分子参与了转移灶形成的过程,这也就是说我们根本无法知道到底是哪一个(些)DTC细胞形成了转移灶。在这种情况下, 肿瘤的转移模型就显得尤为重要了,因为用模型可以帮助我们预测出应该针对哪些肿瘤细胞进行治疗。根据肿瘤转移模 型,我们可以提出治疗方法假说,开展临床前 研究,还能帮助我们设计临床试验方案。比如我们现在正在进行的,用原发肿瘤细胞的某些分子标志来预测针对某些分子作用机制的化疗药物对DTC细胞的治疗效 果。 1. 两种肿瘤转移的基本模型 使用原发性肿瘤来预测疗效的方法实际上是基于两种转移模型中的任何一种模型,即线性转移模型(linear progression model)和平行散播模型(parallel progression model)。在线性转移模型中,肿瘤个体发生的过程就是肿瘤细胞在原发灶微环境中形成肿瘤灶以及之 灶的特性决定了在体内散布的DTC后肿瘤细胞脱离原发灶形成转移灶的过程。因此肿瘤原发 细胞的分子特性。在第二种平行散播模型中,肿瘤细胞在完全获得恶性肿瘤细胞的表型(即体细胞突变和远处转移能力)之前就 会脱离原发灶。这种原发灶肿瘤早期转移以及原发灶肿瘤细胞与DTC细胞之间具有差异的模型让我们对只针对原发灶肿瘤细胞进行治疗的方法提出了质疑。不过我 们需要在此处强调一点,不幸的是,上述两种模型中没有一种模型能够获得直接的、毫无争议的证据支持,它们都只是间接推论出来的假设模型。 1.1 线性转移模型 线性转移模型是基于leslie Fould对肿瘤细胞逐渐出现的形态异常作出的描述。在肿瘤细胞出现形态异常的同时细胞内也累积了大量的基因与表型突变。一言以概之,线性转移模型认为肿 瘤细胞连续经历了多重突变,最终,“最有竞争力的”肿瘤细胞“脱颖而出”了。经过了上述那样几轮筛选之后,最后胜出的“选手”都获得了以相对较快的生长速 率自行进行增殖的能力。这些肿瘤细胞会继续增殖形成克隆,同时有一些肿瘤细胞会离开原发部位转移到机体的其它部位进行增殖(图1)。 恶性克隆(malignant clone)的克隆性扩展程度决定了最终形成的肿瘤灶的体积。比如,在乳腺肿瘤的T1期(即肿瘤灶直径小于2厘米)实际上是很少有抑癌基因TP53发生突 变的情况出现的,但是到了T3期(即肿瘤灶直径大于5厘米),TP53基因发生突变的情况就会多出很多。因此,那些TP53基因发生突变的肿瘤细胞大部分 都是在肿瘤灶直径超过2厘米之后才出现,并开始克隆性增殖的。这种现象以及众所周知的肿瘤体积与其转移概率之间的正相关关系正是我们在临床上广泛使用的肿 瘤TNM分期的理论基础。也正是这些现象提示我们,只有那些较晚离开原发灶的肿瘤细胞才有可能会形成真正的转移灶。但是我们也不能排除肿瘤细胞在较早 期,即原发灶还比较小的时候就离开原发部位时就拥有形成转移灶的能力的可能性。我们通常都认为这些细胞具有与原发灶肿瘤细胞相似的特性。 不过对于肿瘤细胞转移问题还存在着与上述观点有一定联系的另一种有一些差异的看法,即级联式转移理论(metastatic cascade)。按照该理论,肿瘤在第一次转移之后会继续发展,直至形成一个重达1公斤的、大约由1012~1013个肿瘤细胞组成的致命的瘤体。这说 明一旦DTC细胞适应了转移部位的微环境,就会形成一个转移灶,然后以这个转移灶为“据点”再次进行新一轮的转移,如此往复,直至杀死病人。 因此,线性转移模型实际上包含有3个关键性的、可用实验进行检验的事件,即恶性细胞的散播;主要是晚期肿瘤的恶性细胞散播;以及转移灶再次发生散播。 图1 乳腺癌的晚期播散转移模型,即级联式转移模型。在肿瘤的局部转移过程中,侵袭性肿瘤细胞会从原发灶处脱离下来并向别处播散。在肿瘤的发展过程当中,肿瘤细 胞的恶性程度会变得越来越高,直至最终广泛转移致患者死亡。对于原发灶乳腺癌细胞来说,倍增时间式157天,而第一转移灶细胞的倍增时间是30天(术后发 现转移灶的平均时间是30个月),到了第二转移灶细胞倍增时间急剧缩短到1天,而最终杀死病人的肿瘤细胞的倍增时间连1天都不到。 1.2 平行散播模型 平行散播模型至少可以追溯到上世纪50年代,当时科研人员们都在努力想办法弄清楚人体肿瘤细胞的生长速度。他们研究发现,大部分情况 下,病人出现原发灶的症状或者原发肿瘤得以确诊很早之前就已经出现了肿瘤转移现象。这是因为如果肿瘤转移发生在肿瘤晚期,那么按照转移灶细胞的生长速度来 看它们是不可能长到如此之大的。 平行散播模型并没有对涉及到肿瘤生长的普遍机制,例如原发肿瘤进行竞争性克隆选择或者发生遗传突变累积等现象以适应肿瘤生长需要等机制提出挑战,不 过按照平行散播模型来看,形成转移灶的肿瘤细胞并不是在原发灶生长到晚期时才从原发灶处脱离的(图2)。另外,还在进行突变的肿瘤细胞的散播有可能会导致 异域性选择(allopatric selection),形成更多、各种各样的、能适应各自微环境的肿瘤细胞。因此,由于存在肿瘤细胞所面临的选择压力(selection pressure)以及肿瘤细胞所固有的遗传不稳定性特性,平行散播模型认为形成转移灶的肿瘤细胞与原发灶肿瘤细胞之间存在着很多差异,但线性转移模型却 不这么认为。同时,平行散播模型还非常看重转移灶处微环境对肿瘤细胞遗传以及表型突变的选择作用。而且根据平行散播模型还提出了三个假设:第一个假设是原 发灶处的肿瘤细胞相比转移灶处的肿瘤细胞在遗传与表型上积累的突变情况要复杂得多;第二个假设认为原发灶肿瘤细胞在不断增殖的过程当中是以一种平行的、相 互独立互不干扰的方式向机体其它各个部位进行转移的;第三个假设认为从原发灶处脱离出来的肿瘤细胞都在各自的新“领地”里互不干扰的各自独立发展。因为在 平行散播模型中形成转移灶的肿瘤细胞在绝大多数情况下都是在极早期(即临床上还未能检出时)就已经散播出去了,因此它们有足够多的时间进行新的下一轮传 播。 在本文中详细收集了临床上处于各个疾病发展阶段患者的数据、DTC细胞的遗传分析报告、转移灶的详细情况以及治疗效果等资料,我们会利用这些资料仔 细分析上述两种肿瘤转移模型的优劣。除了极少数个别情况之外,我们采用的数据都来自临床患者,而不是动物模型数据。这首先是因为动物模型,比如在构建肿瘤 细胞异种移植(xenotransplantation)动物模型时所采用的肿瘤细胞一般都已经是晚期肿瘤细胞或转移灶细胞,这实际上是等于已经在 某种程 度上承认了线性转移模型的正确性;其次,任何一种肿瘤动物模型都只能从某一个方面对人体疾病做出解释;第三点是因为用动物模型来研究人体疾病的可靠性还值 得推敲。 图2 乳腺癌平行转移模型。a:在平行转移模型里,肿瘤细胞早期,即原发灶大小还介于1~4毫米之间时就已经发生转移了。位于不同器官的转移灶都是同时形成并一 同发展的,这些转移灶细胞的TVDT时间是6年,而原发灶细胞的TVDT时间却是12年,这说明转移灶细胞的 生长速度要比原发灶细胞快1倍。在颅内,局部 的微环境因子可能会影响转移灶细胞的生长。在确诊肿瘤时从原发灶或转移灶播散出来的肿瘤细胞不会导致患者死亡(因为它们还需要很多时间才能形成新的病 灶),也不会长大形成新的病灶;b:在平行转移模型中,患者被确诊之前,体内就已经出现了好几拨肿瘤细胞播散事件,这些细胞会在不同的器官以不同的速度同 时生长。原发灶肿瘤细胞分泌的因子可能能够刺激肿瘤细胞克隆性增殖,这可能能够解释原发灶大小与转移灶大小之间的关系。TVDT(tumour volume doubling time),即通过放射影像技术检测肿瘤的体积变化大小来了解肿瘤的体积倍增时间。 2. 疾病病程和肿瘤生长速率 人 体肿瘤的病程主要是以解剖学疾病分期(anatomical disease stage)和肿瘤的生长速度来决定的。临床上广泛使用的TNM分期主要是以肿瘤的大小(即T)、肿瘤扩散至局部淋巴结的数量(即N)以及是否有远隔转移 (即M)来进行划分的。而患者的存活时间则是与病人体内肿瘤生长达到1kg大小时所需要的时间有关。肿瘤生长到这么大的时候人体也会出现各种器官功能衰竭 甚至严重的系统性衰竭,最终死亡。肿瘤大小和肿瘤转移之间的关系以及与患者死亡之间的这种关系已经在多种肿瘤病例中得到了验证。比如患有T1N0M0期 (即肿瘤直径小于2厘米,没有淋巴结转移,也没有远隔转移)乳腺癌的患者预后存活时间长达15年的患者比例高达90%,但是在T2N0M0期(即肿瘤直径 介于2厘米~5厘米之间,没有淋巴结转移,也没有远隔转移)患者中这个比例就降到了70%。 我们可以通过放射影像(radiographic)的方法来了解人体肿瘤的生长速度,这实际上就是通过放射影像技术检测肿瘤的体积变化大小来了解肿 瘤的体积倍增时间(tumour volume doubling time,TVDT)。因此,这种检测TVDT的方法是一种非创伤性的方法,而且该方法还涵盖到了能影响肿瘤生长动力学的多种因素,比如肿瘤增殖速率、新 生血管形成、凋亡、坏死、机体免疫系统的作用等等。总体来说,TVDT时间是因人而异的(见图3c),但是原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞的TVDT时间以及 转移灶肿瘤细胞之间TVDT时间的差异实际上并不是太大。转移肿瘤的TVDT时间与原发灶肿瘤的TVDT时间是相当的,大约在60天至200天之间(表 1),不过原发灶细胞的生长速度要比转移灶细胞快1倍。不幸的是,我们很少对成对样品(paired samples)进行过分析研究,但是就我们曾经进行过的配对研究来看,转移灶的生长速度都是与其原发灶生长速度差不多的。因此,至少在可检测的水平范围 来看,不论肿瘤生长在何处,肿瘤细胞的生长速度是一种能反映肿瘤“起源”的固有特性。这一结论已经得到了好几个独立开展的组织学研究的证实,这些研究中使 用了有丝分裂指数(mitotic index)方法或者Ki-67抗原循环细胞计数方法来检测肿瘤细胞的增殖指数(proliferation index),通过增殖指数来比较不同肿瘤细胞的生长速度(表1)。结果发现,转移灶肿瘤细胞的增殖指数与原发灶肿瘤细胞的增殖指数非常接近(图3d和表 1)。虽然上述这些方法没有将消亡速度(attrition rate)考虑在内,但也可以近似地认为它们代表了TVDT时间。 TVDT时间是以直接检测并估计肿瘤生长的持续时间(即肿瘤的“年龄”)来判断的。一般认为肿瘤会持续以指数级别的速度生长(图3a)。但是当肿瘤 生长到一定大小的时候,它们的生长曲线会进入平台期,见图3b所示的S型生长曲线。肿瘤细胞在最开始时生长速度很快,随着肿瘤体积的增大,所需的营养物质 越来越多,当营养供应不充足时肿瘤的生长速度就会逐渐减缓下来。在用于筛查乳腺癌患者TVDT时间的乳腺X光摄影检查术(mammography)中,该 方法的检测阈值可以达到10~14毫米以下,此时的肿瘤灶还非常小,但是它们的生长速度却很快。因此不能用平台期的数据来决定TVDT时间,而应该用指数 生长期的数据来表示TVDT时间。此外,关于肿瘤细胞一直会以指数级生长速度进行增殖的理论也得到了证实,有人用大量患者从转移灶被发现至死亡这一段时间 的数据验证了上述理论。在乳腺癌患者群体中, 患者从确诊发现转移灶到死亡的这一段生存时间只取决于两个因素,但是该生存时间与确诊时的原发灶大小无关,这 就说明肿瘤细胞的生长速度在原发灶被确诊之前就是没有区别的。据估计,从肿瘤开始发生转移至转移灶被确诊之间差不多有6年时间。虽然上面介绍的实验方法可 能过于简单,但是它们得出的结论却都惊人的一致。不论是线性转移机制还是平行转移机制都必须能够对肿瘤病程的发展做出解释,包括要能对转移灶肿瘤细胞的生 长速度很少能够比原发灶肿瘤细胞的生长速度快超过1倍的现象做出解释。 表1 人体肿瘤及其转移灶的生长速度和增殖指数 图3 人体肿瘤细胞的生长速度。a:图中显示了肿瘤体积大小与细胞以指数增长方式倍增之 :在肿瘤可见期,肿瘤的生长最开始是以指数增长方式进行的, 但是随着肿瘤间的关系;b 体积的增大,其生长速度会逐渐减缓,此即Gompertzian生长曲线,但是在肿瘤的不可见期,其生长速度就各异了,可快可慢。大多数研究 者都倾向于肿瘤细胞是以图中红线所示的持续指数生长模式生长的;c:图示12个乳腺癌原发灶细胞的生长速度。其中每一条曲线代表一个细胞的生长情况。实线 表示肿瘤进入可见期,虚线表示不可见期;d:图示8名患者中同一患者体内导管内区域(即原发灶区域)、浸润区域和转移灶区域的增殖指数(以Ki-67标记 法检测)。从图中可以看出四名患者的转移灶增殖指数较高,而另四名患者的转移灶增殖指数较低。 2.1 线性转移模型 肿瘤灶的体积大小与肿瘤转移情况之间的这种关系好像非常符合线性转移模型的理论。在前文所列举的例子当中,身患T2期肿瘤患者的死亡率 要比T1期患者的高出20%,这可能是因为肿瘤原发灶在从2厘米大小生长到5厘米大小的期间有更多的肿瘤细胞具有了转移的能力。如果在原发灶还不到2厘米 的时候就手术清除掉癌灶,这样就可以抑制肿瘤的进一步发展,也可以防止肿瘤细胞从原发灶处脱离并转移。 我们已经对大范围乳腺癌患者采用乳房X线照相术进行了广泛的研究,已经基本弄清楚了乳腺癌细胞的生长速率。在年轻女性患者体内的原发灶肿瘤细胞的生 长速度要比老年女性患者体内的原发灶肿瘤细胞快得多。在60岁老年妇女体内,肿瘤细胞的TVDT时间是157天(表1)。这也就是说肿瘤细胞需要花费12 年的时间才能生长成直径约1厘米的原发灶,然后只需要3年时间就可以从直径约1.4厘米大小的T1期肿瘤生长到直径达到7厘米的大肿瘤。在线性转移模型 中,可能会有肿瘤细胞在手术治疗之前就已经从原发灶处脱落,这些细胞就是导致患者在6至12年之后癌症复发的罪魁祸首。不过这一观点与临床上观察到的实际 情况有所出入。在临床上我们发现,从手术切除至发现转移灶可能只有35个月(T1期患者)至20个月(T3期患者)不等。因此造成这些转移灶的肿瘤细胞, 它们的生长速度(30个月里倍增30次)至少要比原发灶处肿瘤细胞(12年里倍增30次)快5倍。 不过有两种非常常见的现象用线性转移模型还无法获得完满的解释,这两种现象之一是我们在临床实践工作中,通常在癌症早期,即T1M1期或T2M1期 就可以发现肿瘤转移现象;其二,有时我们根本就无法找到肿瘤的原发灶。在美国以及欧洲患有T1期和T2期乳腺癌的患者人群中,有5%的患者在确诊患有乳腺 癌时就已经发现同时存在转移情况了,还有5%~10%的患者根本无法找到原发灶。在这些情况下,如果按照线性转移模型理论,转移灶的生长速率应该是比原发 灶快得多才对,但是我们没有发现任何证据能够支持这一观点。 2.2 平行转移模型 事实上,肿瘤原发灶细胞和转移灶处细胞的生长动力学情况非常符合平行转移模型理论。如果原发灶肿瘤在12年里生长成了直径达1厘米的肿瘤灶,那么转移灶肿瘤病灶要达到这样的大小也得需要6至12年的时间。平行转移模型就非常符合我们在临床上观察到的这种实际现象(图2)。 不过,平行转移模型还必须能够解释肿瘤原发灶的大小与肿瘤发生早期转移现象以及发生早期转移事件可能性(频率)大小之间的关系。在发现“大型(相对 “小型”而言)”原发肿瘤病灶之后能够较早发现转移灶的这种现象,我们可以用前置时间效应(lead time effect)来进行解释,所谓前置时间指的就是相比小体积病灶所需的生长时间,要生长成较大体积肿瘤病灶所需要的那一部分额外时间。比如我们在前文中提 到的,肿瘤病灶生长到直径7厘米大小所需要的时间相比生长到直径仅有1.4厘米大小所需要的时间要多出3年。因此,在较大原发灶患者体内发现转移灶的几率 相比来说就要大得多,因为按照平行转移理论,T3期原发灶的转移灶要比较小原发灶的转移灶的生长时间多出3年,因此它们长得更大,也就更容易被发现。 但是,如果肿瘤细胞最初开始从原发灶处脱落并播散就是开始于我们还无法检测到的阶段,那么为什么用手术切除T1期患者的肿瘤相比切除T2期肿瘤能够 提高20%的存活率呢,有一种还未经过验证的理论认为,原发灶肿瘤的某种信号能够促进转移灶肿瘤的生长。如果这些信号能够解释原发灶大小与肿瘤转移之间的 关系,那么这些刺激信号的强度也应该与原发灶的大小有关。这些刺激信号能够诱导生长因子以及那些具有能够促进肿瘤间质重构、调整间质细胞功能和活性、间接 促进转移肿瘤细胞在转移灶处生长等功能的细胞因子的分泌。 3. 肿瘤转移模型的遗传学证据 晚期肿瘤细胞的选择作用和晚期克隆性扩增作用(latestage clonal expansion)会先于转移现象而发生,这是线性转移模型的中心理念。但是在平行转移模型中则认为,在肿瘤发展过程的早期,那些还没有积累到足够突变 的肿瘤细胞就已经脱离并散播出去了。在患者体内,形成转移灶的“原始”细胞都来自DTC细胞群,这也就意味着会有一个或几个DTC细胞最终“胜出”。因 此,我们可以通过对DTC细胞和转移灶细胞进行的遗传分析来对上述两种转移模型进行评判。 根据Schlimok和Riethmüller进行的一项开拓性研究发现,可以在M1期或M0期患者体内的包括骨髓(bone marrow)、淋巴结(lymph node)等间充质器官(mesenchymal organs)中发现DTC细胞。我们可以用诸如上皮细胞角蛋白(epithelial cytokeratins)或上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EPCAM,又名TACSTD1)等上皮细胞分子标志物来发现DTC细胞,这说明DTC细胞是一种非常少见的细胞。使用相同的发现 DTC细胞的方法,不论针对哪种肿瘤患者,在大约30%的M0期患者中,平均在每200万个骨髓细胞中才 能发现1~10个DTC细胞。而且,如果在患有上 皮细胞来源肿瘤的患者体内发现了上皮细胞角蛋白呈阳性的DTC细胞,则预示着该患者的预后较差,这说明DTC细胞与疾病的发展有关。 直到单细胞全基因组分析技术的出现,我们才有可能对尚未形成转移灶的DTC细胞进行分子层面的分析。我们对所选取的肿瘤患者骨髓细胞样品中的DTC 细胞以及各自的原发灶细胞进行了对比。我们统一在手术前提取这些细胞样品,这样就保证了所有的样品都是取自疾病发展的同一阶段。让我们吃惊的是,在对乳腺 癌、前列腺癌和食管癌患者的样品进行比对后发现,它们的骨髓DTC细胞之间的遗传差异性(genetic aberrations)要比原发灶细胞之间的差异小得多。使用细胞分裂中期细胞比较基因组杂交方法(comparative genomic hybridization,CGH)我们发现,在乳腺癌样品中,有50%的上皮细胞角蛋白呈阳性的DTC细胞显示核型正常,但是所有的原发灶肿瘤细胞都 显示核型异常。虽然有些DTC细胞显示的核型正常,但是它们仍然含有一些小的,亚染色体层面的缺失现象,这种现象在乳腺癌DTC细胞中尤其明显。这一现象 证实了转移灶细胞的确是在它们尚未完全恶性变之前就已经脱离了原发灶这一观点。在乳腺癌原发灶肿瘤细胞中最常见的染色体异常情况,比如8q染色体增多和 13q、16q和17p缺失等以及在前列腺癌原发灶肿瘤细胞中最常见的染色体异常情况,比如8p染色体缺失、8q染色体增多与13q、16q缺失等都很少 见于DTC细胞,哪怕是在核型异常的DTC细胞中也不常见,但是可见其它类型的异常。多个对照试验都证实了上述结论的可靠性。 在食管癌细胞中,多种异质性染色体重排现象既可见于原发灶细胞也可见于DTC细胞,这说明适应性选择(adaptive selection)机制在转移灶细胞获得对转移灶局部微环境的适应能力以及生长能力过程中起到了重要作用。不过这也并不排除其它机制发挥作用的可能性。 虽然ERBB2基因扩增现象并不是来源于淋巴结和骨髓组织中的DTC细胞中最常见的染色体异常现象,在原发灶细胞中ERBB2基因的扩增或缺失都与DTC 细胞中的ERBB2基因状态无关。原发灶肿瘤细胞的ERBB2基因扩增现象与患者的存活率无关,但是如果DTC细胞中出现ERBB2基因扩增现象,患者的 生存期都不会超过23个月。 不过在这类肿瘤患者体内,只有DTC细胞或T3、T4期原发灶细胞中ERBB2基因的扩增状态能预示患者的预后情况。这一发现具有重要的价值。首 先,DTC细胞从原发灶处脱离下来之后才会表现出ERBB2基因扩增现象。其次,DTC细胞从原发灶处脱离之后,原发灶细胞中的ERBB2基因会出现扩 增,不过这些后来出现的ERBB2基因阳性原发灶肿瘤细胞并不一定会散播出去。最后,在对一些原发灶细胞与相应DTC细胞进行的配对研究中发现, ERBB2基因在这两种细胞中相对对立的扩增情况以及这两种ERBB2基因阳性细胞对判断患者预后情况的价值差别都表明ERBB2基因对于DTC细胞来说 更为重要。 除了上述这些DTC细胞与其原发灶细胞之间的比对数据之外,还有一些比对数据能够支持或反对线性或平行转移模型。线性转移模型认为原发灶细胞与转移细胞之间存在一种重叠关系,而平行转移模型则认为,原发灶细胞与转移细胞之间是相互独立的,是各不相同的。 只有来自同一患者的比对数据才有意义,但是这样的数据太少了。不过我们还是在各个分子层面上发现了高度的多样性情况。比如在结肠癌患者体内, KRAS基因突变在原发灶细胞中的情况与在转移灶细胞中的情况就要相差高达50%,而在肺癌人群中这种差异更是高达75%至80%。同时,在肺癌患者人群 中,有75%的人也表现出EGFR基因的突变多样性情况(外显子18~21突变)。在对来自26名患者的146份样品的52个微卫星位点 (microsatellite marker)等位基因不平衡(allelic imbalance, AI)现象的详细检测中我们发现,在原发灶细胞中出现等位基因不平衡现象的比例要比转移灶细胞中高出很多。这种在等位基因不平衡现象中表现出来的高度不一 致情况不仅存在于原发灶与转移灶之间,同时还存在于同一患者 体内不同的转移灶之间。有很多科研小组都用诸如CGH这种全基因组分析方法进行过研究,结果发 现有更多的遗传变异情况在原发灶与转移灶等不同肿瘤细胞中都表现出差异性。最后,我们还发现,在人体内往往共同存在着好几种来源于遗传学上互无关联的原发 肿瘤细胞克隆的转移灶细胞,这说明有很多原发灶肿瘤细胞其实也不是来源于同一“原始”细胞的。不过虽然大多数的研究都证实了源自同一患者体内的原发灶细胞 与转移灶细胞之间的这种基因突变上的差异性,但是还是有少数研究发现了能印证线性转移理论的基因突变方面的重叠现象。 全基因表达谱研究方法(Global gene expression profile)在比对来自同一患者的原发灶细胞与转移灶细胞时要比比对来自不同患者的原发灶样本或转移灶样本更为适合。不过,这种比对方法忽略了不同遗 传背景对基因表达的影响作用,很明显,来自同一患者的样品要比来自不同患者的样品在遗传背景上更为相似。另外,如果原发灶肿瘤细胞和转移灶细胞都能够影响 或改变各自的生存微环境以适应肿瘤的生长需要,那么它们的表达谱就有可能会比较一致。因此,用研究基因表达谱的方法来判断不同肿瘤细胞(原发灶与转移灶或 转移灶之间)之间的关系可能并不是一个最好的办法。 3.1 线性转移模型 根据前文所述,在对原发灶肿瘤细胞与转移灶肿瘤细胞的遗传学分析中我们发现,线性转移模型并不正确。不过出乎意料的是,我们所认为的完 全恶性肿瘤细胞(fully malignant tumour cells)或晚期肿瘤细胞却表现出了与那些极少会脱离原发灶进入骨髓或淋巴结中的原发灶细胞非常不同的遗传特性。不过这也可能是由于实验误差或某些人为 因素所造成的假象。我们是根据细胞是否表达细胞角蛋白8(cytokeratin 8)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19)或EPCAM分子这些在原发灶细胞中大量表达的分子标志物来判断肿瘤细胞是否是原发灶细胞的。实验结果并没有排除存在不表达细胞角蛋白8 (cytokeratin 8)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19)或EPCAM分子等细胞标志物DTC细胞的可能性。这些细胞标志物阴性的肿瘤细胞可能具有与细胞标志物阳性的DTC肿瘤细胞所不同的基因变异现象, 但是这些基因变异现象可能是原发灶细胞所具有的。但是在线性转移模型里不能没有这些细胞标志物阴性的DTC细胞。 在原发灶细胞与转移灶细胞间出现的这种在基因突变方面表现出来的高度的不一致性很难用线性转移模型进行解释。即使是最好的情况也只能说明原发灶细胞 与转移灶细胞之间所表现出来的遗传差异性可能也就说明了在原发灶中有一些未被我们发现的肿瘤克隆形成了转移灶,但即便如此,线性转移模型也还需要进行很大 的修改才行。 3.2 平行转移模型 上面列举的种种数据都说明肿瘤细胞的散播并不是在肿瘤发展到晚期才发生的事件。于是问题出现了,肿瘤细胞是在什么时候就开始散播的呢, 在用小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumour virus,MMTV)MMTV–Erbb2和MMTv–PyMT构建的能自发形成乳腺癌的转基因小鼠动物模型中,早在原发灶发展成形态学上呈现侵袭性之 前就已经可以在小鼠的骨髓与肺组织中发现DTC细胞了。使用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy)发现,早在不具侵袭性的非典型性增生(atypical hyperplasia)阶段,就已经有细胞开始侵入、突破基底膜了。随后又在患有非侵袭性的原位管癌(ductal carcinoma in situ)患者骨髓组织样品中发现了细胞角蛋白呈阳性的细胞,这进一步证实了我们在人乳腺癌小鼠动物模型中观察到的现象,也证实了肿瘤细胞是在早期就开始 从原发灶处脱离并播散出去的理论。 因为肿瘤细胞会一直进行“进化”,也会因为各自所处的微环境的不同而承受不同的选择压力,这就是早期转移理论能够支持原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞之 间存在差异性的原因,但 是早期转移理论该如何解释原发灶肿瘤细胞与转移灶细胞之间的相似性呢,这种差异性不仅源自前文所述的种种原因,还取决于DTC细胞 从原发灶处“继承”了何种突变,以及这些突变在何种程度上限制了转移灶祖细胞的突变范围。不过人体肿瘤细胞的突变范围很有限,因此选择压力对肿瘤细胞造成 的影响可能会是一样的。比如BRAF基因都在第600位密码子处发生突变,KRAS基因都在第12、13或61位密码子处发生突变,而80%的PI3K基 因主要都在3个突变热点地区发生突变。同样,染色体异常情况也不是随机的。对22种癌症细胞的约6000个CGH数据进行分析后只发现了下列几种突变情 况,即+1q、+3q、+7、+8q、–13q、–17p、–18q以及+20q。值得注意的是这些突变类型几乎见于各种类型的肿瘤以及各类患者人群中。 这种非随机性突变现象提示我们,可能有一种基因损伤机制可以在同一肿瘤患者体内各个不同的病灶部位各自独立的发挥作用。 但是,遗传突变范围的限制理论却不足以解释原发灶细胞与转移灶细胞之间的差异,这种差异性说明环境压力对肿瘤细胞具有选择作用。有很多能影响肿瘤增 殖、细胞起源以及细胞所处微环境的因素都是原发灶位点与转移灶位点所共有的,因此原发灶细胞与转移灶细胞之间的相似性可能也反映了一种趋同进化 (convergent evolution)的现象。 4. 以转移灶为起点再次形成转移灶 线 性转移模型以及平行转移模型都能解释多个转移灶出现的现象。在平行转移模型中,位于多个位点的转移灶祖细胞都是同时接受选择并各自独立发展的。而线性转移 模型则认为是以转移灶为起点再次形成新的转移灶,即某些(至少一个)转移灶能被机体挑选出来承担原发灶的角色。这种理论已经通过活检以及从人体中分离出具 高度转移能力的肿瘤细胞系所证明。 在上世纪七八十年代,我们进行了数以千计的尸检研究,基本弄清了好多种人体肿瘤的转移速度,也弄清楚了转移灶是源于原发灶还是源于另一个转移灶。这 些研究表明,首先,肿瘤转移患者一般平均都会累及2~3个器官;其次,平均每个患者体内会有5.6个转移灶,一般转移灶的数目在1~13个;第三,每一种 肿瘤细胞都会比较倾向于某一种生存环境,但是只有少数几个器官,比如肺、肝和骨是比较常见的转移部位。还有一些部位比如中枢神经系统和内分泌系统在肝癌和 肺癌患者中是比较常见的转移部位。直接源自原发灶的转移理论似乎还不能解释这种现象,因此,级联式转移模式(线性转移模式)似乎更合理。因此有研究者认为 如果能直接针对第一个转移灶进行治疗就能阻断后续的转移发生(图4a)。 图4 两种肿瘤转移模型对我们选用何种临床疗法具有的参考指导意义。a: 线性转移模型认为确诊肿瘤时的DTC细胞是最具侵袭性的克隆,因此原发灶是选择合适疗法的最佳靶标。由于线性转移模型认为肿瘤细胞会以后生模式 (epigenetic mode)来适应环境,因此它不会再发生什么改变,意即是与原发灶细胞相同的细胞。因此可以根据原发灶细胞来选择治疗方案;b:按照平行转移模型理论,治 疗方案的选择会变得非常复杂。虽然原发灶细胞与转移灶细胞可能具有相似的染色体变异或基因突变等基因组变异情况,但我们并不能不对患者做任何分析就直接得 出这个结论。而且这两种细胞的基因组可能会在不同的位点出现不同或者各自完全独立的进行发展、变化。还有几个问题需要解答,比如是否有一些特定的遗传改变 会出现在一些特定的位点;是否针对不同的DTC细胞、细胞簇或小克隆需要采取不同的治疗策略;是否可见于体内大部分肿瘤细胞里的早期遗传突变是我们治愈患 者的突破口等等。 4.1 线性转移模型 尸检研究的结果很支持线性转移模型。不过肿瘤的生长速度与临床治疗实验结果都不支持线性转移模型。比如50%的M0期乳腺癌患者在手术 后出现一个转移灶(即转移到肝脏)的中位数时间是最短的,只需要29个月。但是如果要转移到包括肝脏在内的多个器官,比如肝脏、肺脏、颅内等器官却只需要 28个月。级联式转移模型,即从转移灶再播散形成新的转移灶会需要更长的时间,但实际情况可能并不是这样的。尸检发现,在结肠癌患者体内,从肝脏转移灶转 移到肺脏形成新的转移灶只需要31天,这说明形成该转移灶的肿瘤细胞的生长速度要比原发灶肿瘤细胞的快130倍(图1表1),但到目前为止我们还没有发现 这样一种细胞。 另外,我们在后面至少会列举出2个临床例子不支持前述的第一个转移灶就能决定患者预后的理论。这两个例子分别是使用针对ERBB2基因的人单克隆抗体曲妥单抗(trastuzumab)治疗乳腺癌内脏转移后出现的淋巴结转移以及脑转移现象。 局部淋巴结清扫是乳腺癌根治术中防止癌症淋巴结转移的重要方法。因为淋巴结是否受累是 可能会以它为源头再次引判断患者预后的重要指标,如果淋巴结已经出现转移灶,那么极有 发新的转移灶。在临床手术中,外科医生们通常都会摘除10~12个未受侵犯的淋巴结和一个阳性前哨淋巴结(positive sentinel node)。至少有3个随机比对临床实验(randomized trial)对淋巴结是转移灶源头的理论提出了质疑。在这些随机实验中,无一例清除阴性淋巴结会对患者预后即远位转移或生存期造成影响,虽然乳房全切加上 局部放疗术的疗效要比单纯乳房全切术的疗效好得多,意即这些淋巴结内已出现转移灶。最近还进行了一起共调查了1408名子宫内膜癌 (endometrial cancer)患者的随机比对临床实验,该实验也没有发现任何证据可以表明系统性淋巴结切除术(systematic lymphadenectomy)能对患者有所帮助。 虽然经淋巴转移途径很少能够引起致命性的远隔转移事件发生。但是远隔转移是否能够引起另一起远隔转移事件发生呢,最近针对曲妥单抗进行的临床试验结 果表明远隔转移似乎不能引起另一起远隔转移事件发生。曲妥单抗很难通过血脑屏障,因此血液中的曲妥单抗浓度要比脑脊液中的高出400倍,这也就说明曲妥单 抗很难直接对颅内转移灶发挥治疗作用,因此它非常适合用于检验颅内转移灶的来源,究竟是源自原发灶还是源自另一处转移灶。如果曲妥单抗抑制了肺部和肝脏的 转移灶生长,那么如果此时颅内转移灶出现体积缩小征象,我们就可以推测颅内转移灶可能是源自肺部或肝脏的转移灶,即级联式转移模式是正确的。不过在临床试 验中我们发现,虽然曲妥单抗能够延缓M1期肿瘤的进展,甚至能够治愈部分ERBB2基因呈阳性的M0期乳腺癌患者,但是它只能针对内脏器官转移灶发挥作 用,并不能抑制颅内转移灶的生长,实际上反而能够促进颅内转移灶的生长。不过因为这些转移灶会在晚些时候出现,因此有人认为这些转移灶是因为生长的时间更 长,所以寿命也更长。 4.2 平行转移模型 平行转移模型认为肿瘤转移不是按照级联的方式进行的,而是在肿瘤发生的早期,直接以原发灶为源头开始转移的。因此最多发转移灶的部位特 征就能够反映出肿瘤在此处发生转移的可能性及其在此的生长速度。但是在肿瘤转移患者血液中发现的循环肿瘤细胞(circulating tumour cells,CTC)却比较支持级联式转移理论。对黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等癌症的研究发现,大量的CTC细胞与病情的进展加快以及患者的存活率降低有 关。但是我们还不清楚这是不是因为这些CTC细胞能够直接形成转移灶。CTC细胞阳性的患者病情不发生进展的生存期时间 (progressionfree survival)只有2.7个月,因此根据前文中所列举的肿瘤细胞生长速度来看,仅靠CTC细胞是无法形成转移病灶的。另一种假说则认为,CTC细胞与 活跃增殖的转移灶有关,这些病灶最终会形成致死性的病灶。 表2 根据线性转移模型和平行转移模型观察到的临床现象以及问题 CGH(comparative genomic hybridization):比较基因组杂交 CTC(circulating tumour cell in blood):血液中循环肿瘤细胞 DCIS(ductal carcinoma in situ):原位管癌 DTC(disseminated tumour cell in bone marrow or lymph node):骨髓或淋巴结中的散播肿瘤细胞 EMT(epithelial–mesenchymal transition):上皮细胞-间充质细胞转化 PT(primary tumour):原发灶 TERT(telomerase reverse transcriptase):端粒末端转移酶 5. 前景与展望 根据表2作者收集的数据(其中大部分数据都源自病程相关数据以及DTC遗传学分析数据), 他认为平行转移模型是正确的。如果实际情况真是这样,那么我们现有的所有基于线性转移模型的研究模型以及临床诊疗方案都需要重新予以修订了。 其中有一点需要重新考虑的是肿瘤转移细胞采用何种机制来适应新的生长环境。线性转移模型认为肿瘤细胞所处的微环境可以“引导” 肿瘤细胞发生恶变,使其发生改变以适应新的生 元凶”,而且它们还会不断形成长,源自原发灶的充分恶性变的肿瘤细胞是形成转移灶的“ 新的转移灶导致癌症全身 广泛转移。这种观点已经被体内试验所证实,有人已经筛选出可以形成骨转移灶的人体乳腺癌细胞转移细胞系,不过通过CGH分析发现,这些骨转移灶细胞的基因 型与原发细胞基因型并不相同,而且它们在基因表达谱方面更是具有稳定的差异。与此相反,还有一种理论(即平行转移模型理论)认为,在肿瘤细胞基因水平的选 择作用更重要,按照该理论,早期即发生转移的肿瘤细胞获得了充足的时间供它们继续完成后续的突变、选择和遗传继承工作。在转移灶形成好多年以前,同一患者 体内的DTC细胞往往就已经表现出了非常复杂的遗传多样性。随后发生的肿瘤细胞克隆性扩增过程实际上就是肿瘤细胞获得生长优势,变得更富有侵袭性的过程。 接下来,很明显就应该寻找能够代表该肿瘤的基因拷贝数变异细胞,因为这些细胞对于我们在临床上发现、诊断转移灶,以及充分了解完全恶性变细胞的表型 信息非常重要。在前列腺癌中,我们就能在原发灶细胞和M1期DTC细胞中发现这种特征性的基因异常情况,但是不能在M0期DTC细胞中发现这种异常现象。 不过需要提醒的是,同一患者体内的原发灶细胞与M1期DTC细胞之间只有25%的变异是相同的,这说明基因突变并不是按照线性模型进行传递的。同时这也说 明转移灶细胞和原发灶细胞的遗传会聚(genetic convergence)作用是各自独立发生的。因此,虽然在线性转移模型和平行转移模型这两种转移模型里适应性作用似乎都起到了一定的作用,即分别起到 了“教育作用”和遗传作用,但是使用源自晚期肿瘤患者的肿瘤细胞系这种方法本身可能就会影响细胞基因型的适应性选择作用,从而遮蔽了肿瘤早期转移的真实机 制。 平行转移模型也对形成肿瘤转移灶的“起始”细胞来源问题提出了自己的解释。我们已经从原发灶肿瘤细胞中分离出了肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)或者称作肿瘤增殖细胞(tumour?propagating cell),我们认为这种肿瘤干细胞可能就是形成转移灶的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞要比非肿瘤干细胞具有更强的致瘤能力,因为我们在免疫缺陷的 NOD–SCID小鼠试验中发现,只需要很少量的肿瘤干细胞就能在数周的时间里形成肿瘤病灶。不过最近有人研究发现,在不同的试验条件下,在某些免疫妥协 的小鼠(比如NOD–SCID Il2rg– /–小鼠)中,只需要一个黑色素瘤细胞就能形成一个肿瘤转移灶,于是他们对上述肿瘤干细胞的理论提出了疑问。同时,上述黑色素瘤细胞试验也揭示出了异种移 植试验方法(xenotransplant)的一个弊端,因为没有一个肿瘤细胞和表达有某些特定干细胞分子标志物的细胞能够以在小鼠体内的生长速度在人体 内生长。 上述这些在免疫缺陷小鼠体内进行的试验结果都认为人体免疫系统和其它关键的能够维持内环境稳态的机制的作用。由于目前还没有一个大家公认可靠的体内 功能试验方法,因此也就没有一个动物模型能够直接证明究竟是什么细胞导致转移病灶的形成,我们也无法预测那一个DTC细胞会形成转移灶。除了ERBB2基 因在鉴别某些食管癌细胞时有用之外,也没有明显的遗传学特征能够鉴别出转移灶祖细胞。不过随着高分辨率分析技术的出现,我们可以对DTC细胞进行更为详细 的研究,可能会找到一些有用的肿瘤细胞分子标志物。同样,DTC细胞也可能会表达CSC标志物,不过这些CSC标志物目前还没有用于转移灶发生发展的研 究。实际上我们对DTC细胞的表型还知之甚少,也几乎没有什么功能试验方法可以对DTC细胞进行分析。目前,最为流行的研究方法是将患者的预后与其DTC 肿瘤细胞的基因型、外遗传基因型或表型相联系的研究方法,这可能是最有希望找到转移灶祖细胞的方法。 线性转移模型是一种相对直接的模型,我们比较容易根据该模型来设计临床诊疗方案,比如在肿瘤长大之前就想办法阻止它扩散或者想办法杀灭侵袭性肿瘤细 胞等等。但是根据近几十年的临床治疗成果来看,似乎实际情况并不象线性转移模型所认为的那样。相反,平行转移模型认为DTC细胞具有多样性,因此它们不可 能被一种一揽子疗法(catch?all therapies) 给“一网打尽”(图4)。如果深入了解了平行转移模型,我们就会在下面几个方面对现行的肿瘤临床诊疗方案做出调整。这几个方面是:第 一,发现全身性的内环境稳态因子(systemic homeostatic factor)将非常有可能为我们提供一个新的治疗靶标;第二,需要一个能针对早期全身(转移)肿瘤的直接的病理检查方法。虽然患者的预后可能是受原发灶 的影响,但是预测疗效还得由明显不同于原发灶细胞的DTC细胞的分子特性来决定;第三,虽然线性转移模型强调能够形成完全恶性肿瘤细胞(fully malignant cell)的改变因素,但是平行转移模型却更看重起始阶段和早期的改变因素,因为这些改变更有可能是更大范围的肿瘤细胞所共有的特质,这些改变也更有可能 会影响到后续的基因以及表型改变。如果该理论是正确的,那么分布在体内多个部位的肿瘤细胞就都有可能会受到这些早期改变的影响。第四,平行转移模型让我们 有了一种全然不同于线性转移模型的新思路,即我们有可能通过检测骨髓或其他器官中的DTC细胞来发现癌症。通常来说,由106–108个细胞组成的肿瘤病 灶大小都介于1~4 mm之间,这是影像学检查很难发现的,但是如果使用分子遗传学方法,我们就可以在肿瘤的早期发现DTC细胞,以此达到早期发现肿瘤的目的。 小词典 1. 异时性转移(metachronous metastase):一次检查发现两个以上肿瘤的称为同时多发癌;而在术后一段时间又在另外部位发现肿瘤的称为异时性肿瘤。其间隔时间可以是数月或数 年。异时性多原发癌是指间隔六个月以上的多原发癌,异时性转移是指在发现原发癌时已经排除转移的病例,后来又发现了转移的情况。 2. 有丝分裂指数:一个细胞群体中正在进行有丝分裂的细胞的百分数。有丝分裂指数指在某一分裂组织或细胞群中,处于有丝分裂M期的细胞数占其总细胞数的百分 数。是作为表示细胞繁殖活动程度的指数。可用于测定正在进行不同步细胞分裂的细胞群的细胞分裂时间。在反复进行不同步分裂的细胞群中,其观察值相当于 (tm/tG)×100(tm是分裂所需的时间,tG是细胞的一个世代时间)。 3. 比较基因组杂交方法(comparative genomic hybridization, CGH):比较基因组杂交是自1992年后发展起来的一种分子细胞遗传学技术,是FISH技术的一大延伸与重大飞跃。它突破了原先对FISH“探针”对一 个点或一个区的理解,将其技术覆盖面扩大到整个基因组。它通过单一的一次杂交可对某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。其基本原理是用不同 的荧光染料通过缺口平移法分别标记肿瘤组织和正常细胞或组织的DNA制成探针,并与正常人的间期染色体进行共杂交,以在染色体上显示的肿瘤与正常对照的荧 光强度的不同来反映整个肿瘤基因组DNA表达状况的变化,再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。在以往,检查来源不清的异常染色体 或染色体片段,面临的首要问题是探针的选择,常规的染色体描绘技术只能显示一至几条染色体,逐一进行杂交,不仅工作量大,费用高,而且对整个基因组来说, 确定未知特定区域的扩增或重复,常规FISH方法几乎是不可能的。但逆向染色体描绘需分离异常染色体或染色体微小片段,在技术上难度很大。CGH技术,通 过直接进行基因组DNA的比较来检测遗传物质的缺失与重复,为进行基因组内不平衡遗传物质的研究提供了一个新的手段。它是先以一种非同位素分别标记病人基 因组DNA,另一种非同位素分别标记正常人基因组DNA,两者适当比例混合后制备成探针,与正常人染色体分裂相进行原位抑制杂交,再分别用不同物质进行检 测。正常序列被涂成混合色,缺失处为正常基因组颜色,扩增序列为异常基因的颜色。每一染色体或染色体片段的两重荧光强度比值即反映两基因组DNA中不同源 顺序的相对拷贝数。例如:两种探针1:1比例混合,与正常人中期分裂相进行CISS杂交后。再与配有特殊的计算机软件的荧光显微镜下进行全基因组扫描,检 测荧光强度比,当比值等于0.5时为单倍体,1时为双倍体, 1.5时为三倍体,2时为四倍体等。这一技术简便易行很快得到推广。 CGH技术的优点:1.实验所需DNA样本量较少,做单一的一次杂交即可检查肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化。2.此法不仅适用于外周血、培养细胞 和新鲜组织样本的研究,还可用于对存档组织的研究,也可用于因DNA量过少而经PCR扩增的样本的研究。CGH技术的局限性:CGH技术所能检测到的最小 的DNA扩增或丢失是在3-5Mb,故对于低水平的DNA扩增和小片段的丢失会漏检。此外在相差染色体的拷贝数量无变化时,CGH技术不能检测出平等染色 体的易位。 4. 前哨淋巴结:所谓前哨淋巴结是指最有可能最先发生肿瘤转移的淋巴结.通过该淋巴结的检出和病理检查以推测整个腋窝淋巴结的病理状况,从而制定术后治疗计划。 原文检索: Christoph A. Klein. (2009) Parallel progression of primary tumours and metastases, Nature Review Cancer, 9:302-312. 筱玥/编译 五、转移生态位——适宜肿瘤细胞生长的沃土 关 于肿瘤转移的种子和土壤理论(seed and soil)认为,适宜肿瘤细胞生长的微环境(niche)是散播肿瘤细胞能成功转移到远隔器官的前提条件。有越来越多的证据证明种子和土地理论是正确的。 按照该理论也逐渐了解了肿瘤转移的机制以及在远隔部位逐渐发生的一些改变。 细胞)”为了能够改善晚期肿瘤患者的预后,我们应该尽早对在体内散播的“种子(转移肿瘤 和它生存的“土壤(适宜肿瘤细胞生存的局部微环境)”进行干预。 Steven Paget关于肿瘤转移的种子和土壤理论在肿瘤研究史上是一个具有里程碑意义的理论。Steven Paget认为适宜肿瘤细胞生长的微环境是恶性细胞在其它非原发灶部位得以生存并继续生长形成转移灶的首要条件。在Steven Paget提出肿瘤转移的种子和土壤理论之前,在学界占据主导地位的声音认为,可能只是由于某些外界的机械力(mechanical factor)作用才迫使肿瘤细胞“塞进”机体脉管系统,得以转移到它处。不过Steven Paget在对735例晚期乳腺癌患者进行研究之后发现,有一些器官,比如肝脏相比其它的器官,比如脾脏会更容易出现转移灶,但这是无法用血流转移理论来 解释的。因此,Steven Paget认为可能肝脏这些器官的“土壤(微环境)”会更适于“种子(转移肿瘤细胞)”的生长。四十年后,Steven Paget的理论遭到了James Ewing的质疑,James Ewing又重新提出了血道和淋巴道肿瘤转移理论。随即,James Ewing的理论又重新占据了上风,只到Isaiah Josh Fidler进行了著名的“种子研究(seminal studies)”。Fidler发现,虽然肿瘤细胞是随着脉管系统在体内运输,能够到达身体各处,但是它们只能有选择地在某些器官停滞下来,“生根发 芽”,继续生长,不可能在其它器官形成转移灶。于是大家又都把目光投向了Steven Paget的种子和土壤理论,有大量的针对肿瘤局部微环境以及肿瘤细胞的研究工作陆续开展起来了。 1. 转移生态位模型 在生态系统(ecological system)中,生态位(niche)指的是处于某一特定生态系统中的某些物种或群体之间发生相互作用的位置。在这种生态位环境中,各个物种或群体会对 环境中的各种资源以及竞争者的各种竞争压力作出反应,然后通过限制其它物种进入的方法,调控它自身所处局部微环境的生物及物理组成情况。我们整个人体也可 以被看做是一个生态位。同样,在干细胞生物学里,生态位指的是能够维持干细胞生长,调控其功能,促进其增殖的特定的微环境。因此,可以用类似的模型来阐述 肿瘤细胞与其所处微环境之间的相互作用。 原发肿瘤所处的“土壤”要比转移灶所处的环境更容易研究。在该微环境里包含了非恶性的支持基质细胞(supportive (nonmalignant) stromal cell)、可溶性细胞因子、脉管系统、营养素和代谢产物,以及细胞外基质结构(extracellular matrix (ECM) architecture)。同时还需要一个允许肿瘤生长的免疫微环境或者炎症微环境。转移生态位模型(metastatic niche model)认为,一个合适的微环境,也被称为转移前生态位(premetastatic niche)需要“进化”成适合肿瘤细胞生存的环境,即转移生态位(metastatic niche)才能形成新的转移灶。这些生态位的改变都是肿瘤细胞分泌的细胞因子作用的结果,既有可能是刚刚受到肿瘤细胞诱导所致,也有可能本来就是一些非 常适合的生态位,比如造血器官里的干细胞生态位等。转移生态位模型理论实际上就是建立在Paget的种子与土壤理论基础之上的,只不过转移生态位模型理论 提出了微环境的时间进化概念,同时也加入了有关肿瘤细胞以及转移微环境的分子组成情况数据。 还有一种理论认为,在是否能够形成转移灶的问题上,转移肿瘤细胞本身的本质相比转移部位的微环境来说更为重要。该理论和转移生态位理论都与被大家普 遍接受的理论相吻合,大家普遍都认为肿瘤转移是一个分步进行的渐进过程。从原发灶脱落的肿瘤细胞进入脉管系统,然后在远隔部位进入毛细血管,然后从中移 出,浸润远隔器官并在其中生存,增殖。不过与其它理论不同的是,转移生态位模型假定单靠肿瘤细胞自身不能决定自己的结局,必须依赖一个合适的微环境才行。 转移生态位模型的实验依据主要来自于小鼠模型的肺转移样本,当然也包括其它一些器官,比如肝脏、大脑和骨等部位,也有一些证据直接来自肿瘤患者。我 们目前还不清楚,该模型是能广泛适用于各种实体瘤呢,还是只能适用于某些特定的肿瘤。而且,虽然有一些数据能支持转移生态位模型,但是转移前生态位的概念 还值得商榷。按照该理论,肿瘤转移部位的组织应该在肿瘤细胞到达之前就已经准备妥当,能够适应肿瘤细胞的生长才对,而这种适应性改变是由于原发灶肿瘤分泌 的细胞因子系统效应造成的。不过要想弄清楚这些事件其中的先后顺序还得仰仗强有力的实验检测手段,这些检测方法必须能够第一时间发现转移到身体其他部位的 少数几个甚至单个转移肿瘤细胞。还有一种可能就是转移肿瘤细胞会为它们自己创造合适的微环境,即通过旁分泌的方式营造转移生态位。 我们在局部(原发)肿瘤治疗方面已经取得了不错的进展,但是转移瘤问题还是一大难题,目前肿瘤患者主要就是因为肿瘤转移复发而致命,这已经成为了第 一大致命原因。肿瘤转移生态位模型的意义就在于我们能够借此改善晚期肿瘤患者的预后,对转移肿瘤(种子和土壤)及早的采取干预措施。而且,还可以根据肿瘤 转移的时间顺序,分时间、分步骤的采取更合适的治疗措施,取得更好的疗效。 2. 转移前生态位 脉 管系统的机械力(Mechanical force)作用决定了肿瘤细胞转移的第一步运动方向。脉管系统的解剖学走向、管腔的粗细、血流动力学以及血管内压力,加之肿瘤细胞的物理学特性等等这些 因素都会影响到肿瘤细胞的转移过程,最终的转移部位等等。肿瘤细胞要想能成功的形成一个转移灶,必须成功的完成下面这几个步骤:粘附 (adhesion)、从血管中外渗(extravasation)、在新的部位存活(survival)并增殖(proliferation)等。这些 步骤都需要在一个合适的微环境中完成。最近几年,不断有证据显示,原发肿瘤分泌的生长因子会促使某些器官朝向更适合肿瘤细胞生长的方向改变,肿瘤相关细 胞,比如转移前生态位中 的造血祖细胞(haematopoietic progenitor cell)和巨噬细胞(macrophages)在这些可溶性肿瘤细胞因子的作用之下就会营造出一个适合肿瘤细胞粘附和侵润的环境(图1)。实际上,在转 移前器官(premetastatic organ)中,类似的作用机制可能对肿瘤细胞和造血祖细胞等肿瘤相关细胞的归巢起到了引导作用。在这些转移靶器官中的某些这种位点就是转移前生态位。在 肿瘤细胞到达转移部位之后,局部微环境就会转变成转移生态位。研究发现,转移器官中的这些生态位似乎更倾向于在某些特定部位出现,比如肺的终末细支气管 (terminal bronchiole)周围和细支气管静脉(bronchiole vein)周围,不过这一观点还没有得到最终确认。此外,肿瘤细胞采取何种转移方式似乎也是由原发灶细胞分泌的细胞因子所决定的。有人进行了这样一项试 验,给移植了lewis肺癌细胞(lewis lung carcinomas,LLC)的小鼠腹腔内注射B16黑色素瘤细胞培养基,结果发现,LLC细胞不再在它们以往“常去”的部位形成转移灶,反而在脾脏、 肠、肾脏和输卵管这些黑色素瘤细胞经常发生转移的部位形成转移灶。 图1 转移生态位模型图解。图中展现了从形成转移前生态位(pre-metastatic)到形成微小转移灶和巨大转移灶的全过程。a:在原发肿瘤分泌的生长因 子,比如血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、胎盘生长因子(placental growth factor,PIGF)、转化生长因子β(TGFβ)等因子的作用下,骨髓来源的造血祖细胞(haematopoietic progenitor cells,HPC)会聚集成团,大量表达炎性趋化因子S100(inflammatory s100 chemokines)和血清淀粉状蛋白A3(serum amyloid A3,SAA3)。血小板分泌的间质来源的生长因子1(Platelet-deployed stromal-derived growth factor 1,sDF1)也是一种趋化因子,能与C-X-C趋化因子受体4(c-X-c chemokine receptor 4,CXCR4)阳性的HPC细胞和转移肿瘤细胞(metastatic tumour cells,MTC)相作用。HPC分泌出了一系列的转移前因子(pre-metastatic factors),比如肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNFα)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)和转化生长因子β(TGFβ)等。可能源自间充质干细胞(mesenchymal stem cell)的活化的成纤维细胞会分泌纤维连接蛋白(fibronectin)这种重要的黏着蛋白,以及赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase,LOX)这种能够修饰细胞局部基质的蛋白;b:转移肿瘤细胞在生态位中定居,繁 殖形成微小转移灶。活化的内皮细胞位点特异性的表达粘附整 合素(adhesion integrin)蛋白,比如P选择蛋白(P-selectin)和E选择蛋白(E-selectin),这些蛋白会增强MTC细胞的粘附能力和外渗能 力。而转移生态位中细胞与细胞间的相互作用,比如CD44连接作用也会促进MTC细胞的存活和生长;c:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)在转移生态位形成的早期就被招募过去可以调节肿瘤血管形成的过程,促进巨大转移灶的形成。 2.1 转移前生态位的形成 肿瘤与在血液系统(血管和造血器官)中的炎症细胞关系密切,最近,我们在尚无肿瘤细胞到来的转移前生态位中观察到了能表达血管内皮生长因子受体1 (vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)的骨髓来源的造血细胞。这些细胞上还保持了它们不成熟的表面标志物,比如KIT和SCA1等,我们认为这些细胞是构成转移前生态位的关 键组分(背景知识1)。这些VEGFR1+的细胞也会表达纤维连接因子受体(fibronectin receptor)VLA4蛋白,该蛋白也被称为整联蛋白α4β1(integrin α4β1),同时我们也观察到,在这些转移前生态位中,纤维连接因子的表达量也会增加。转移生态位模型认为,这些骨髓来源的细胞和间质纤维连接因子在局部 积聚,形成了一个对于散播肿瘤细胞非常有吸引力的“停泊位点”,因此,在特定器官内诱导转移前生态位的形成对于肿瘤转移来说是至关重要的一个步骤。 我们最开始认为,VEGFR1+骨髓细胞从骨髓中动员并募集到转移前位点的过程主要是原发灶肿瘤细胞分泌的血管生成因子(angiogenic cytokine)——VEGFA和胎盘生长因子(placental growth factor,PIGF,该因子属于Vegf家族蛋白,能特异性的与VEGFR1受体结合)的作用结果。不过最近的研究发现,炎性趋化因子 (inflammatory chemokine)也能招募造血细胞和肿瘤细胞到转移前位点(premetastatic site)。Hiratsuka等人将同系基因型的lewis肺癌细胞或B16黑色素瘤细胞皮内注入同系基因型小鼠之后,观察了小鼠转移前肺部情况,实验 发现,原发肿瘤细胞分泌的VEGFA、TGFβ、TNFα能够特异性的诱导肺实质(而不是肝脏或肾脏)内炎性蛋白S100A8和S100A9的表达,而肺 部正是肿瘤转移的靶器官。于是诱发了能表达细胞表面抗原——整联蛋白αM(integrin αM,又名MAC1)或CD11b的骨髓细胞浸润现象。表达了S100A8的肺部对于肿瘤细胞和MAC1+的骨髓细胞都具有非常强烈的吸引力,而p38 MAPK信号通路的活化则是招募这两种细胞过程所必须的。使用S100A8和S100A9抗体能够抑制MAC1+的骨髓细胞浸润,同时能极大的减少肿瘤细 胞在小鼠肺内形成病灶的比例,幅度高达80%~90%。这说明肿瘤细胞和肿瘤相关的骨髓细胞可能都是通过相似的分子机制来应对转移前微环境的引导信号的。 在某些器官中会选择性的上调促进细胞迁移的因子,这可能就是导致肿瘤转移具有器官特异性的机制。血清淀粉状蛋白A3(serum amyloid A3, SAA3)能够通过巨噬细胞和肿瘤细胞表面的Toll样受体4(Tolllike receptor 4,TLR4)来调控S100A8和S100A9诱导的细胞趋化作用。而且S100趋化因子和SAA3的诱导作用主要都发生在肺部,而极少发生在肝脏或肾 脏。 与此同时,在肿瘤分泌的细胞因子作用之下,骨髓内发生的细胞与生态位之间的相互作用能够促使骨髓来源的细胞动员进入机体循环系统(背景知识1)。骨 髓细胞的细胞动力学受到了多种细胞的调控,这些细胞包括成骨细胞(osteoblast)、破骨细胞(osteoclast)、血管内皮细胞 (vascular endothelial)以及血管周围细胞(perivascular cell)。然而成骨细胞来源的信号通常都会抑制干细胞的增殖,而破骨细胞和血管细胞则会促进细胞的生长 和运动。很有可能在肿瘤细胞的转移过程之中,上述 信号平衡朝向能够促进干细胞从骨髓中动员的方向倾斜了,不过这一假设还需要得到试验的验证。在骨髓中发生的细胞与微环境间的相互作用与肿瘤细胞之间发生的 相互作用或者肿瘤细胞(位于原发灶、转移前生态位以及转移生态位之中的肿瘤细胞)与其周围的间质微环境之间发生的相互作用是非常类似的。实际上,骨髓生态 位很有可能就是一个非常适合的转移生态位,这样也就能解释为什么在肿瘤患者体内,与其它器官相比,骨髓更适宜肿瘤细胞的生长。而且骨髓微环境似乎能够适应 多种类型肿瘤细胞的生长。这正是由于在骨髓中各种趋化因子的表达量非常高,比如其中的间质细胞来源因子1(stromal cellderived factor 1,SDF1)就能够促进肿瘤细胞归巢(homing)和植入(engraftment)。同时,伴随着不断发生的骨重建过程,骨髓中大量的营养素供应也 是适宜肿瘤细胞生长的一大原因。 背景知识1. BMDC在肿瘤生成和转移过程中可能扮演的角色 在肿瘤生成和转移过程中,来源不同的若干类型的骨髓来源细胞(bone marrow-derived cell,BMDC)均会参与其中。 造血细胞 造血祖细胞在肿瘤转移前生态位(pre-metastatic niche)扮演了启动因子的角色,同时,也参与新生血管的形成过程。成熟的单核细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞在原发性肿瘤及转移肿瘤微环境中也同样重 要。这些细胞会分泌活性因子、趋化因子及基质降解酶,从而对肿瘤局部微环境进行调控,并参与介导其它炎性细胞与肿瘤转移前生态位之间的化学吸引作用 (chemoattraction)。 内皮细胞 内皮祖细胞在新生血管形成过程中从骨髓中迁移出来。有研究表明,内皮祖细胞的富集促使了肿瘤由微转移过渡到肉眼可见的转移。 间充质细胞 间充质干细胞可形成成纤维细胞,后者是肿瘤基质中的重要组分。上述两种细胞也可以通过直接与肿瘤细胞相互作用,从而使该肿瘤转移表型得到强化。 2.2 转移前生态位引导肿瘤细胞植入的机制 在转移前生态位,新近招募的骨髓细胞与其他细胞,比如间质细胞和内皮细胞一起共同发挥作用,它们形成了一个包含趋化因子、生长因子、基质降解酶(matrixdegrading enzyme)和粘附分子的综合平台,为转移肿瘤细胞在此生长准备好了充足的物质基础条件。 白细胞介素1(interleukin 1,Il1)、白细胞介素6(interleukin 6,Il6)、NFκB配体受体活化因子(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL,又名TNFSF11)以及肿瘤坏死因子α(TNFα)这些炎症因子都是能够促进肿瘤转移的细胞因子。TNFα是由机体骨髓细胞 分泌的,它能够影响肿瘤转移过程中的好几个步骤,比如增强肿瘤细胞的生长能力,增强肿瘤细胞进入血管的能力,增强肿瘤细胞招募其它宿主细胞的能力等等。肿 瘤细胞分泌的因子能够直接诱导骨髓细胞分泌诸如TNFα一类的能够促进肿瘤细胞生长的细胞因子。最近有一项研究阐明了肿瘤细胞与巨噬细胞之间的相互作用分 子机制。研究发现,肿瘤细胞分泌的机制蛋白多功能蛋白聚糖(versican)能够激活人体巨噬细胞上的TLR2受体,促使巨噬细胞分泌能够促进肿瘤细胞 生长的炎症因子,比如TNFα。在该项研究中还发现,如果缺乏TLR2或者TNFα,转移肿瘤细胞的生长就会受到极大的影响。在不表达TLR2蛋白的小鼠 尾静脉接种同系基因型LLC肿瘤细胞之后,很难在其肺部发现肿瘤转移灶形成。 局部组织重构(local tissue remodelling)也是促进肿瘤浸润和转移、生长的一大条件。在转移前生态位中基质金属蛋白酶的表达也增加了。基质金属蛋白酶在应对炎症反应和组织 修复过程,以及原发灶肿瘤细胞生长过程中起到了降解细胞外基质的作用。在转移前的肺部内皮细胞和MAC1+-VEGFR1+的骨髓细胞中,基质金属蛋白酶 9的表达量增加尤其明显,这种表达上调具有VEGFA依赖的方式。这些基质金属蛋白酶9既能促进肿瘤细胞的浸润,也能促进生长因子和趋化因子的释放,比如 可溶性的KIT配体就能够进一步招募骨髓来源的祖细胞和表达有KIT受体的肿瘤细胞。 在原发灶部位的肿瘤相关骨髓细胞的主要功能就是调控其它免疫反应细胞,导致免疫抑制,抑制免疫反应,促进肿瘤细胞逃避机体的免疫监视作用等等。比如 GR1+CD11b+骨髓细胞分泌的TGFβ就能直接干扰CD8+细胞毒性T淋巴细胞的功能,同时也能抑制自然杀伤细胞、B细胞以及其它树突状细胞等等。 有可能被招募到转移前位点的骨髓细胞也具有同样的功能,即在体内形成一个免疫豁免部位,使得肿瘤细胞能够在其中生存并增殖,而不被机体所发现和清除。骨髓 细胞表达的骨桥蛋白(osteopontin)是一个参与了肿瘤细胞粘附和存活的蛋白,它同时也具有调控基质金属蛋白酶的活性,抑制机体免疫反应的作用。 被招募到转移前位点的骨髓细胞的分子及功能表型还没有被完全弄清楚。各个实验室所发现的分子标志物都各不相同。在对原发肿瘤进行的研究中,另一些研究团队区分出了Gr1+MAC1+的未成熟骨髓细胞,这些细胞也被称为骨髓来源的抑制细胞(myeloidderived suppressor cells,MDSC)和分化完全的MAC1+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞。MAC1和VEGFR1都广泛表达在各种骨髓细胞中,包括各种祖细胞。有可 能完全分化的细胞和未成熟的细胞都被招募到转移前生态位和转移生态位当中。VEGFR1+ 细胞亚群和CD11b+细胞亚群之间会有部分重叠的现象,不过它们之间的关系目前还不清楚。VEGFR1+ 细胞可能是第一个被招募的细胞,然后它们会释放细胞因子,招募其他的骨髓细胞或刺激其他的骨髓细胞增殖。 除了骨髓细胞之外,还有一些其它的细胞也参与了转移前生态位的“建设”过程。比如VEGFR1+的造血祖细胞,这些细胞也能表达CXC趋化因子 受体4蛋白(CXC chemokine receptor 4,CXCR4),它们会通过血小板分泌的SDF1的作用被招募到缺血组织中的新生血管处和肿瘤生长处。虽然血小板对于转移前生态位的作用还需要进一步考 证,但它们极有可能会在转移前生态位中释放一些趋化因子和血管生成调控因子。还有几种肿瘤细胞也能表达CXCR4,因此它们可能也会受到血小板分泌的 SDF1因子的作用。在转移黑色素细胞瘤构建的小鼠模型中,血小板表面糖蛋白IbIX在调控肺部转移灶生长的过程中也起到了非常重要的作用。位于转移前 生态位中的其它一些宿主细胞,比如成纤维细胞和内皮细胞也会表达趋化因子和粘附因子,也能够吸引循环肿瘤细胞与该位点相结合。 局部成纤维细胞的转化过程在肿瘤病理发展进程中是一个非常重要的事件。肿瘤相关成纤维细胞(Cancerassociated fibroblasts,CAF)会被组成型激活,它们的增殖速度要比良性组织中的成纤维细胞快得多,分泌到细胞外基质中的蛋白数量也要多一些。这些 CAF细胞在肿瘤发生和发展过程中都起到了重要的作用,它们能够促进肿瘤细胞增殖、浸润和运动,还能分泌金属蛋白酶降解细胞外基质。有证据表明成纤维细胞 对于转移前生态位的形成也具有至关重要的意义。活化的成纤维细胞能够诱导间质重构,而这个间质重构过程在鼠黑色素瘤肝转移的过程中非常重要。在黑色素瘤细 胞早期转移时就能观察到围绕着肝血窦的成纤维细胞增殖,即星状细胞(stellate cell)增殖的现象。这些细胞是高度活化的,能分泌多种金属蛋白酶和趋化因子,促使微小转移灶形成。随后,缺氧又诱导星状细胞分泌血管原性生长因子 (angiogenic growth factors),招募内皮祖细胞到转移灶生态位中,促进微小转移灶形成有新生血管生成的巨大转移灶。 在转移前的肺组织中,CD45+CD13+亚群间质细胞即纤维细胞(fibrocyte)也参与了间质改变过程。这些纤维细胞大量表达金属蛋白酶9 蛋白,这些金属蛋白酶9蛋白都与肿瘤细胞的植入有关。不过这些纤维细胞是原本就在此处的,还是从骨髓中动员过来的目前还不清楚。有趣的是,在肾非恶性纤维 化(nonmalignant kidney fibrosis)病变过程中,有人发现活化的成纤维细胞不仅源自骨髓,也源自上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)过程和内皮-间质转化(endothelial–mesenchymal transition)过程。 2.3 转移前生态位中的细胞外基质 组织结构的改变是肿瘤性疾病的一大标志性特征。正如前文所述,骨髓细胞和活化的成纤维细胞都能分泌金属蛋白酶一类的因子,来改变细胞外 基质环境。此外,还有一些不是由细胞分泌的因子,比如局部环境中的O2含量也参与了这个组织结构调整的过程。组织缺氧与肿瘤发生、发展,乃至转移过程中的 好几个步骤都有关系。处于缺氧状态的人体肿瘤细胞会大量表达并分泌赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase,LOX),该酶能够将细胞外基质中的胶原蛋白(collagens)和弹性蛋白(elastins)交联起来。在用人乳腺癌细胞在小鼠模 型上进行的体内和体外实验中都发现,在肿瘤细胞的浸润过程中LOX酶的表达和分泌都有明显增多。最近有人认为,LOX酶对于转移前生态位的形成可能也具有 重要意义。在转移前生态位中处于缺氧状态的乳腺癌细胞所分泌的LOX酶会改变局部微环境的细胞外基质,使得该处更适于骨髓细胞浸润。而且在小鼠试验中还发 现,抑制乳腺癌细胞合成LOX酶会减少局部微环境中CD11b+骨髓细胞的积聚,抑制肿瘤转移。 纤维连接蛋白(Fibronectin)是一种细胞外基质糖蛋白,它参与了大量的细胞生理过程,包括胚胎细胞的迁移和血管的发育等,最近研究发现该 蛋白也是转移前生态位的一个重要组成蛋白。我们在肺部终末细支气管(terminal bronchioles)和细支气管静脉(bronchiolar veins)周围这些比较常见的肿瘤转移部位都能观察到纤维连接蛋白表达的现象。但是对于这些纤维连接蛋白的出处(是来自间质细胞还是来自肿瘤细胞)我们 还不清楚。虽然我们在动物肺部观察到的纤维连接蛋白似乎是在转移肿瘤细胞尚未到达该转移前生态位之前就已经出现了,但是我们使用特异性针对人纤维连接蛋白 的抗体检测人肿瘤细胞免疫缺陷小鼠移植动物模型时还是发现,至少有一部分的纤维连接蛋白是由肿瘤细胞产生的。LOX酶的表达和骨髓细胞浸润都是伴随着纤维 连接蛋白在同一地点出现的,这说明纤维连接蛋白可能在最初“召集”转移前生态位组成元件一起形成转移前生态位的过程中扮演了重要的角色。不过暂时还不清楚 肿瘤细胞来源的LOX和纤维连接蛋白究竟是短暂经过转移前生态位的散播肿瘤细胞留下的,还是转移到该处的早期转移瘤细胞分泌的,抑或是原发灶细胞分泌之后 随机体循环到达该处的。 细胞外基质的机械特性,比如组织弹性和基质硬度等性能也都会对肿瘤形成产生直接的影响,这一点在乳腺组织中表现得尤为明显。不过这一机制是否也能同 样应用于转移灶组织还不清楚,也不清楚该机制是在哪个阶段(转移前阶段、微小转移灶形成阶段、巨大转移灶形成阶段)发挥作用的。 2.4 转移前生态位中的血管完整性 在肿瘤原发灶部位的血管完整性受到破坏有助于细胞外蛋白和炎性细胞运输,但同时也有利于肿瘤细胞进入血管进行转移。因此,很有可能在肿 瘤细胞到达转移灶部位之前,该处现有的局部微血管状态(完整性)就已经发生了改变,能够促使肿瘤细胞移出血管和其他肿瘤相关骨髓细胞、活化的血小板聚集成 团。很多肿瘤细胞来源的可溶性因子都具有调节血管(angiomodulatory)的作用,其中最著名的因子就是VEGFA。血管的内皮组织是一种异构 体(heterogeneou),有可能血管的渗漏现象不是一个普遍的现象,只是在某些特定的器官或者器官内的某些特定位点才会出现渗漏,这可能也是影响 转移生态位形成的一种机制。我们 已经发现了一些组织特异性的血管生成因子,比如内分泌腺来源的Vegf,该因子只在某些特定的细胞和组织才会表现出生理活 性,它是一种促细胞分裂剂(mitogen),能够特异性的促进肾上腺皮质和性腺中内皮组织的生长和迁移,但是对大动脉、脐血管和皮肤血管内皮组织都没有 作用。对于位点特异性的转移前生态位的形成机制,有人提出了肿瘤可能会分泌组织特异性的血管生成因子这一理论,不过该观点还没有得到证实。不过我们已经明 确的知道,肿瘤细胞能够分泌组织特异性的血管生成抑制因子和转移抑制因子,这些因子可能能够抑制在体内的某些部位形成转移生态位。 血管出现高通透性的一个可能机制是在特定器官中受到了选择性的调控作用,即循环血小板在某些促进剂的作用下,以位点特异性方式分泌的生长因子作用的 结果。最近的研究发现,在血小板表面某些蛋白水解酶活化受体(proteinaseactivated receptor)的激活可能会对促血管生成因子和抗血管生长因子之间的动态平衡施加调控作用。血小板不仅是能释放这些调控血管生成的因子,活化的血小板 表面还能为P选择蛋白等粘附配体(adhesive ligand)提供一个平台,循环系统中的内皮祖细胞能够凭借这个平台被粘附、运送到新生血管生成部位。 血管内皮细胞也能通过在特定部位表达不同的粘附分子来影响转移前生态位和转移生态位的形成。内皮细胞会受到IL-1和TNFα等细胞因子的作用表达 P选择蛋白和E选择蛋白,促进粒细胞(leukocyte)与内皮细胞的某些部位粘附。P选择蛋白和E选择蛋白还能调控肿瘤细胞与活化的内皮细胞之间的粘 附作用。在一项转基因小鼠模型试验中发现,在多个器官中过表达E选择蛋白会改变转移灶的形成部位。不过肿瘤转移的模式不会随每个器官中E选择蛋白的表达水 平而发生变化,这说明还有一些其它因素,比如血流动力学、血流剪切力等因素也会影响肿瘤细胞的粘附。 2.5 转移前部位的淋巴管形成 在大多数类型的肿瘤中,肿瘤细胞在转移到实体器官之前会先转移到淋巴结。在近几十年里,有多个重点关注肿瘤血管生成过程的研究都发现, 在转移器官中淋巴管的形成同样非常重要。在用化学试剂构建的小鼠皮肤鳞癌动物模型中发现,Vegf家族成员VEGFC(该因子是最强的淋巴管生成生长因 子)的过表达不仅与加快肿瘤淋巴结转移有关,也与肿瘤肺转移有关,不过对原发灶肿瘤的生长没有什么作用。而且还发现,在哨兵淋巴结(sentinel lymph node)里淋巴管生成(lymphangiogenesis)的现象是在肿瘤细胞浸润该淋巴结之前就已经出现的。这些数据都表明,诱导淋巴管生成也是肿 瘤转移过程中非常重要的一项准备工作。不过淋巴管生成对于实体器官中早期转移前生态位的形成是否也同样重要我们还不得而知。 3. 转移生态位 在本文中所介绍的转移生态位模型中,重要的改变都发生在远隔器官的局限部位,然后促进循环肿瘤细胞的归巢和植入过程(图1)。肿瘤细胞随后进入局部组织,在转移前生态位中生长,并形成微小转移灶,直至最后形成巨大转移灶。 3.1 肿瘤转移是在一个肿瘤发展早期就已经出现的事件 我们过去认为,肿瘤细胞从原发灶部位脱落,播散到转移灶部位是在肿瘤发展晚期才会出现的一个事件。不过后来有好些证据表明,肿瘤转移灶 的最初形成可能在肿瘤形成(tumorigenesis)时也就开始同步进行了。更先进的免疫细胞化学技术 (immunocytochemical)和分 子生物学技术能够帮助我们在发现临床转移灶之前就发现处于循环系统或骨髓中的肿瘤细胞,甚至可能只是一个肿瘤细胞也都能被检测到。实际上,使用转基因小 鼠,在小鼠乳腺上皮细胞中有条件的表达癌基因,能进行更加精细的研究,我们可以借此发现,哪怕是尚未发生转化的乳腺细胞也能“转移”到其它部位,这些细胞 到达转移灶之后再激活癌基因,也能形成恶性细胞,哪怕此时在原发灶部位尚未出现肿瘤转移的征象。这又让科研人员们提出了一个新的假说,即癌变前细胞 (premalignant cell)在肿瘤形成的早期也可以从原发灶脱落并转移到身体别处,比如转移前的肺部(premetastatic lung),然后在转移灶处发生恶性变,形成肿瘤细胞。有可能这些癌变前细胞也会改变它们自身所处的微环境,和该处的间质细胞一起招募骨髓细胞,最终在此 处形成一个转移生态位。或者,尚不具备转移能力的循环肿瘤细胞也能为更富侵袭性的肿瘤细胞提前准备好一个“温床”。不过无论如何,原发灶肿瘤细胞的某些信 号都能够直接引导肿瘤细胞进入某些特定器官,而不是其它器官。 3.2 肿瘤细胞的植入 肿瘤细胞似乎比较倾向于在由骨髓细胞、纤维连接蛋白、生长因子和基质重构蛋白所组成的转移前生态位中定居生长。不过,有哪些分子参与到 了肿瘤细胞植入转移前生态位的过程目前还不清楚。在进入循环系统的数以百万计的肿瘤细胞中,只有很少一部分能够成功的植入转移部位,存活下来并开始新的繁 殖。在肿瘤细胞的血源播散过程当中,细胞植入转移灶是非常高效率的一个过程,但是细胞生长过程的效率却不高。这可能是局部微环境和肿瘤细胞本身这两方面因 素共同作用的结果。Massagué等人发现了与肿瘤转移倾向性有关的肿瘤细胞遗传标记,这对于我们了解肿瘤转移动力学和肿瘤细胞的散播机制具有十分重大 的意义。这些研究成果极有可能会在将来的临床诊断工作中和个体化医疗工作中起到重要作用。这些标记分子中的大部分都能影响肿瘤细胞与周围微环境间的相互作 用,这也从一个侧面说明了“种子”和“土壤”之间相互作用的重要性。此外,以前发现的,在骨髓祖细胞中分化基因转录抑制子 (transcriptional inhibitor of differentiation genes,Id)基因Id1和Id3的表达,对于人乳腺癌肺转移灶的形成也具有重要作用,因为这些蛋白能在早期就促进转移瘤细胞持续性的生长。 其它一些研究团队还发现了一些肿瘤转移抑制基因(metastasis suppressor gene),如果在肿瘤细胞中重新表达这些基因会抑制肿瘤细胞转移,不过不会影响原发灶肿瘤细胞的生长。这些肿瘤转移抑制基因可能会改变肿瘤细胞对局部微 环境中存活信号(survival signal)的反应能力,因此能够决定哪些环境适宜肿瘤细胞生长。比如在小鼠动物模型中,人乳腺癌细胞中乳腺癌转移抑制蛋白1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)基因的表达就能选择性的削弱肿瘤细胞对促有丝分裂因子表皮生长因子(mitogenic factors epidermal growth factor)和血小板源性生长因子(plateletderived growth factor)的反应能力,阻止肿瘤细胞在远隔部位的增殖,不过却不会对原发灶肿瘤细胞和循环系统中的肿瘤细胞的增殖造成影响。 肿瘤细胞为了在转移灶部位开始二次生长,它们首先必须获得迁移和自我更新的能力,即与正常生理干细胞或肿瘤干细胞相类似的能力。这表明肿瘤干细胞可 能更容易植入转移前生态位。实际上,最近的研究成果显示,在肿瘤浸润早期发生的EMT过程就能诱导乳腺癌细胞出现干细胞样的表型。在未恶性变的乳腺上皮细 胞发生的EMT转变也能诱导细胞表达CD24和CD44这些肿瘤干细胞抗原标志物,并且经过EMT转变之后,细胞也获得了自我更新能力和分化能力。还有学 者认为,肿瘤细胞与巨噬细胞的融合也可能会赋予细胞迁移的能力。该假说认为,细胞融合之后会像骨髓来源的前体细胞一样释放归巢信号,引导肿瘤细胞植入转移 前生态位。 3.3 转移肿瘤细胞的生长 肿瘤细胞从血管中移出,浸润转移灶器官之后,需要在该处存活下来,并开始新的增殖。这一过程也会受到细胞与细胞之间以及细胞与胞外基质 之间相互作用的影响。对于一个在体内散播的肿瘤细胞来说,要想成功的形成一个肿瘤转移灶,它必须首先要能够逃避各种因为失去了与周围细胞或细胞外基质之间 的粘附而释放的细胞凋亡信号的杀伤作用,在循环系统中存活下来,然后在合适的转移灶部位定居下来并开始繁殖。透明质酸受体CD44对于肿瘤细胞逃避凋亡途 径具有十分重要的作用。给小鼠尾静脉注射同系基因型乳腺癌细胞构建动物模型,虽然抑制了CD44+的肿瘤细胞与小鼠肺基质之间的相互作用,并不会影响肿瘤 细胞与肺内皮细胞之间的粘附或对肺间质的浸润作用,但是绝大多数的肿瘤细胞都会发生凋亡,无法形成转移灶。除了透明质酸之外,还有其他CD44的配体,比 如纤维连接蛋白(fibronectin)、I型胶原蛋白(collagen I)、骨桥蛋白(osteopontin)、层粘连蛋白(laminin)等。因此,很有可能肿瘤细胞与转移生态位中某些分子(比如纤维连接蛋白)之间的 相互作用对于肿瘤细胞逃避凋亡非常重要。转移生态位是一个富含各种生长因子和细胞因子的大仓库,其中很多银子,比如VEGFA可以直接调控肿瘤细胞的存活 和生长。 3.4 从微小转移灶到巨大转移灶 肿瘤细胞在转移生态位中少量增殖会形成微小转移灶。随后,随着新生血管的形成,肿瘤细胞得以进一步的增殖、扩张,形成巨大转移灶 (macrometastase),在这一过程里需要激活血管生成开关(angiogenic switch)。最近有人对调控微小转移灶——巨大转移灶转换开关的细胞信号通路和分子信号通路进行了研究,结果发现骨髓来源的内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells,EPC)是其中的关键因素。以前的研究发现,ID1转录因子能参与肿瘤原发灶的血管生成反应,最近又发现,它对于EPC细胞迁移并募集至微小 转移灶处也非常重要。虽然shRNA抑制了ID1蛋白的表达并不能影响肿瘤细胞在肺部开始增殖,但是由于缺乏了EPC细胞的作用,该处血管生成的速度以及 微小转移灶增殖形成巨大转移灶的速度都明显下降。这些EPC细胞在转移灶处的血管内皮细胞中总共占比不到15%,但它们的作用却远远超出了其它内皮细胞。 除了EPC细胞之外,造血细胞和间充质细胞也都能帮助巨大转移灶的形成。肿瘤相关的巨噬细胞通过表达VEGFA和血管生成素 (angiopoietins),也能促进血管形成,加速其他炎症细胞的浸润,促进它们分泌蛋白水解酶,帮助基质重构。 我们对于在休眠期的微小转移灶中启动EPC细胞招募和血管生成开关的信号和EPC细胞招募后促进巨大转移灶形成的分子通路都还不清楚。还需要进行进 一步的研究评价转移生态位在肿瘤休眠期中的作用。休眠肿瘤细胞是否会形成休眠生态位(dormant niche),或者肿瘤细胞是否能调控它们所处生态位的活性状态这些问题还都需要解决。系统性因素,比如组织损伤或组织缺血可能会为生态位的活化提供一个 血管生成刺激信号。 4. 肿瘤转移生态位模型的临床意义 肿瘤转移生态位模型对于晚期肿瘤的临床治疗来说具有如下几点意义。第一,转移前生态位的免疫组织学特征 (immunohistological),比如髓样细胞聚集、成纤维细胞活化、或者间质纤维连接蛋白分泌等都可以被用来更早的判断是否会出现肿瘤转移的 证据。另外,对常见转移位点进行检测可以帮助我们区别表面上没有发生转移,但是已经出现转移前生态位形成证据的那部分患者,尽早采用抗肿瘤转移疗法,比如 使用VEGFR1+髓样细胞抑制剂或LOX、纤维连接蛋白抑制剂等。 第二,肿瘤转移生态位模型认为,越早实施针对转移灶微环境的系统疗法,效果越好,这甚至可以作为对原发灶治疗手段的辅助疗法。如果可以的话,应该尽 早针对转移前生态位形成 过程采取干预手段,尤其是对于乳腺癌这种非常容易转移复发的肿瘤更是需要如此。最后,治疗措施还需要配合肿瘤发展阶段的特性进行调 整,具体的作用阶段及靶标参见图2。 TNFα, tumour necrosis factor-α:肿瘤坏死因子α VEGFR1, vascular endothelial growth factor receptor 1:血管内皮生长因子受体1 图2 肿瘤转移微环境阶段性构成变化示意图。在肿瘤转移的过程中,每一阶段的细胞组成情况和分子组成情况,这些细胞和分子都有可能成为我们未来治疗肿瘤的作用靶点。a:转移前阶段;b:微小转移灶阶段;c:巨大转移灶阶段。 5. 尚待解决的问题 我们前面介绍的模型还存在许多局限,还有很多问题需要解决。在动物模型中,要想检测真正的转移前组织还非常困难,因为肿瘤细胞检测手段 的敏感性和准确性都还达不到这个要求。更大的挑战在于如何证实这些实验数据,并且保证这些源自动物实验的数据能够很好的应用于人体,这就需要获得各种转移 前或微小转移灶等阶段的人体实验标本来进行研究。 大部分针对肿瘤转移的研究都把注意力集中到肺脏,当然也有一些针对肝脏和大脑等器官展开的研究项目。另外,也出现了大量的肿瘤转移体内试验模型,不 过每一种实验方法和手段都有其自身的局限性,在分析这些实验数据时都应该考虑到这些因素。虽然还有一些研究是在原发小鼠肿瘤动物模型中进行的,但是这些动 物模型以及同系基因型小鼠肿瘤细胞系的来源也都非常有限。总之,由于转移生态位的细胞和分子组成情况非常复杂,要想用体外实验弄清楚转移生态位的相关情况 是非常困难的。 还有好几项非常重要的问题需要在此进行进一步的阐述。比如转移生态位模型对于休眠转移肿瘤细胞的意义是什么,是什么因素决定了这些生态位在器官内的 分布,在某些特定部位是否存在早就存在的或者刚刚形成的可诱导的生态位(inducible niche),实验发现,在静脉内注入肿瘤细胞之后,只有极少数的肿瘤细胞能够成功的植入某些位点,这说明的确是有一些预先存在的 (preexisting)生态位,而不是一定需要原发灶肿瘤细胞在体内诱导形成生态位。如果真实情况真的如此,这些生态位是否与生理干细胞生态位 (physiological stem cell niche,详见背景知识2)相关呢,宿主遗传背景的差异是否会影响这些生态位的数量、位置、容纳肿瘤细胞的能力和效率呢,肿瘤转移生态位模型能够广泛适 用于各种类型的肿瘤还是只能适用于少数几种类型的肿瘤呢,各种不同类型的肿瘤对生态位的要求有什么不同吗, 我们只是刚刚开始了解肿瘤转移生态位,这是一个非常复杂的系统,我们在本文中介绍的很多观点还都值得商榷。不过很清楚的是,在真正特异性针对肿瘤转 移微环境的疗法诞生之前,我们还有许多工作需要做。无论如何,本文中介绍的这些前期工作必将帮助我们发现能够作为治疗靶点的分子靶标和细胞靶标。 生理学微环境 ?生殖细胞及配子形成;?胚泡植入子宫内壁;?成人体内器官特异性干细胞(如神经干细胞)的维持; 病理学微环境 ?多发性硬化症;?动脉粥样硬化斑块;?类风湿性关节炎; 背景知识2. 与其它生理学及病理学系统之间的相关性 对转移生态位的细胞、分子和功能学表型与非恶性环境中的生理学及病理学生态位进行比较,可以发现很有趣的现象。例如,在生殖生理学中, 为成功受孕,子宫壁应做好准备接受将要到来的受精卵,而受精卵在此之前需要穿过输卵管,来到子宫,这一过程的“迁移性”和“侵入性”都与肿瘤的形成颇为相 似。发育中的胚泡能够成功植入子宫壁,需要胚泡与子宫内膜之间进行全面的信号传递,而这一过程是通过表面整合素(如α5β1)与细胞外基质蛋白(如纤维连 接蛋白)之间的相互作用实现的。在病理学中,对多发性硬化、动脉粥样硬化及类风湿性关节炎中出现的局部炎性斑块(focal inflammatory plaque)进行分析,同样可以发现与原发性肿瘤微环境及转移生态位许多相似之处。例如,参与肿瘤转移过程的细胞及分子的富集现象,例如VLA4+单核 细胞、基质金属蛋白酶、骨桥蛋白以及微血管改变。上述有关肿瘤生态位与病理、生理学现象的类比,可以为我们提供开发肿瘤转移研究新领域的灵感。 原文检索: Bethan Psaila and David Lyden. (2009). The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nature Reviews Cancer, 9:285-293. 筱玥/编译 六、上皮细胞间质细胞转换机制——上皮细胞获得干细胞表型或恶性变的途径 上 皮细胞-间质细胞转换在胚胎发育过程中具有十分重要的地位。现在,越来越多的数据表明该过程在调控正常人体组织和肿瘤组织的细胞可塑性(cellular plasticity)方面也起到了关键作用。通过上皮细胞间质细胞转换过程能够形成多个各不相同的细胞亚群,即形成了肿瘤细胞异质性 (intratumoural heterogeneity)。这些亚群细胞都具有各自的特点,有一些可能分化程度较高,但还有一些则表现出了干细胞的特征。而这些特征又都与肿瘤相关表 型,比如肿瘤转移或致死率等有关,因此,如何针对肿瘤细胞的这种干细胞特征(即可塑性)来设计治疗方案、寻找治疗药物已经成为了临床研究中的一大热点。虽 然还有很多问题需要我们去解决,但这的确是一个非常有希望的发展方向。 细胞从上皮细胞表型转变成间质细胞表型的过程被称作上皮-间质转换 (epithelial–mesenchymal transitions,EMT)而相反的转变过程则称为间质-上皮转换(mesenchymal–epithelial transitions,MET),这些转变过程在胚胎发育(embryonic development)过程中都起到了关键性的作用,不过最近科研人员们又发现他们在肿瘤形成及致病过程中也起到了至关重要的作用。EMT过程是一个非 常复杂的分子过程,上皮可以通过EMT过程“褪去”已分化细胞的特性,比如细胞间的粘附(cell–cell adhesion)现象、细胞极性(polarity)现象、细胞缺乏运动能力等等这些表型,获得间质细胞的特征,比如细胞具备移动能力 (motility)、侵袭能力(invasiveness)、抗凋亡(resistance to apoptosis)能力等。EMT转分化过程(transdifferentiation)最开始是在细胞培养过程中被发现的,不过一直以来学界对该过 程与体内生理过程之间的关系还存在争议。随着科研工作者们对人体肿瘤和实验动物模型的观察越来越深入,他们逐渐发现EMT过程不仅与正常的胚胎发育过程有 关,还与肿瘤发生过程有关。因此,与对胚胎发育过程(详见背景知识框1)的作用相类似,EMT过程和MET过程似乎也都参与了肿瘤发生的过程。尤其是 EMT过程对于肿瘤浸润(invasion)、转移播散(metastatic dissemination)以及对药物或治疗的抗性等性状都有关系,而与EMT过程相对的MET过程则似乎是在肿瘤细胞播散之后形成转移灶的过程当中发 挥作用。 胚胎发育与肿瘤形成之间有一个本质的区别,那就是肿瘤形成过程中基因异常的细胞会逐渐失去对正常生长调控信号的反应性,获得了进化的能力。这种进化 现象是因为大部分赘生性细胞(neoplastic cell)所固有的遗传和表型因子不稳定性所造成的。这种不稳定性还能在肿瘤组织中形成多个细胞亚群,这也是造成肿瘤细胞具有异质性 (heterogeneity)的一个原因。肿瘤细胞还可能会因为它们所处间质微环境(stromal microenvironment)释放的一些信号而造成细胞生物学方面的改变,比如与EMT过程和MET过程有关的一些改变。正如在图1中所示的那样, 在体内多处生长的肿瘤细胞都可能会接触到能够触发EMT过程的信号。更重要的是,在多种临床肿瘤中都发现,EMT过程与患者预后不良有关,这似乎是因为 EMT转换可以赋予原发瘤细胞更大的侵袭能力(aggressive trait)。 自从我们发现了EMT转换过程之后,科研工作者们就开始对该过程背后的分子机制展开了研究,也逐渐取得了一定的成果,最近有几篇非常精彩的综述对 EMT研究领域进行了很好的总结,读者可以查阅这些文献获取更多有关EMT方面的信息。在简略介绍有哪些分子机制能够激活EMT过程之后,在本文中我们会 将重点放到向读者介绍最近一段时间刚刚发现的,那些能够调控EMT过程后续表达过程的调控机制,还将就EMT转换和MET转换在肿瘤异质性中的作用,以及 肿瘤进展和治疗抗性中的作用展开讨论。最后,我们还将对相关的医疗实践进展做一个介绍。 H/E(Spl), hairy and enhancer of split发状分裂相关增强子 WNTR, Wnt receptor:Wnt蛋白受体 图1 参与调控EMT过程的信号通路网络简介。图中列举了几条参与EMT过程调控的信号通路,它们的下游效应因子,以及这些信号通路及细胞因子之间的相互作用。 酪氨酸激酶受体(Receptor tyrosine kinases,RTK)、转化生长因子β(TGFβ)、Notch蛋白、内皮素A受体(endothelin A receptor,ETAR)、整联蛋白(integrin)、Wnt蛋白、缺氧以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等这些信号都能通过各种信号通路诱发EMT转换过程发生。在不同的细胞内,这些信号通路的地位(重要性)各 有不同。EMT转换和MET转换都与细胞骨架和细胞外基质,以及细胞间连接方式的改变有关。能诱发EMT转换的信号可以通过蛋白磷酸化机制(比如TGFβ 信号通路导致的PAR6A蛋白磷酸化)破坏紧密连接和桥粒连接。还可以通过抑制某些蛋白的表达水平(比如ZEB1抑制血小板亲和蛋白3)来诱发EMT转 换。细胞外基质的重构也能触发EMT过程,因为很多诱发EMT的因子都能上调细胞外基质蛋白(比如纤维连接蛋白fibronectin和胶原蛋白 collagens)、蛋白酶(比如MMP)以及其他一些重构酶(比如赖氨酸氧化酶lysyl oxidase)的表达水平。缺氧、RAC1B活化以及某些激酶途径(比如Akt激酶途径)的激活也都能够促进线粒体合成活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),包括缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α))、NF-κB、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)等, 使细胞获得多效性(pleiotropic effect)。除了各种信号通路之间的相互作用之外,促进EMT过程的细胞因子(图中紫色圆圈表示转录因子)和miRNA之间也存在着非常复杂的相互调 控作用。 背景小知识速览 上皮细胞和间质细胞之间的转换是上皮细胞获得可塑性以及肿瘤得以进展和出现肿瘤异质性的分子机制之一。 多种信号都能够触发上皮-间质转换(epithelial–mesenchymal transition,EMT)过程,比如生长因子、肿瘤细胞与间质细胞间的相互作用以及缺氧等信号。各种能触发EMT过程的 信号和转录因子构成了一个非常重要的信息网络。 EMT转换能够赋予肿瘤细胞干细胞样的特征,比如能够侵润周围组织,或者对某些治疗措施或药物具有抗性等。 间质-上皮转换(mesenchymal–epithelial transition,MET)过程在将转移的间质肿瘤细胞逆转成为上皮细胞表型的过程中发挥了作用。 最近发现microRNA也是一种EMT过程调控因子,这可能是由于 microRNA可以调控能够诱发EMT过程的转录因子所致。 1. EMT过程活化的机制 有多种细胞外信号能够激活EMT转换过程,胞内的EMT下游信号通路与参与该过程的转录因子共同组成了一个复杂又意义重大的信号网络, 该信号网络包含有多个正反馈回路(图1)。这个复杂的相互作用网络确保了细胞在EMT转换后所获得的间质细胞表型能够稳定的表达。最近有人对乳腺上皮细胞 进行了研究,结果发现持续激活的EMT转换作用可以导致细胞进行性表观改变(epigenetic alteration),最终导致细胞发生永久的可遗传改变,使得细胞外诱导信号消失之后,细胞仍然能将间质细胞表型遗传下去。因此,在某些特定情况下, EMT转换过程能够形成稳定的表型改变,并且将这种表性遗传下去,形成特定的细胞谱系。 1.1 参与EMT过程的信号通路 EMT过程通常都是在上皮细胞中发生的,该过程可以由多种信号诱导触发,其中尤以组成正常组织或肿瘤新生物组织(neoplastic tissue)的间质细胞所释放的信号作用最为突出。转化生长因子β家族(TGFβ)成员是所有能诱导胚胎发育过程里EMT转换过程的细胞因子中最重要, 也是被研究得最透彻的一大类细胞因子,它们可以治疗纤维变性性疾病(fibrotic diseases)和肿瘤性疾病。最近的研究结果还表明,TGFβ在调控乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell)表型的过程中也起到了一定的作用,同时还发现TGFβ对于维持人胚胎干细胞(human embryonic stem cell)多向分化潜能具有关键性作用。后面这样新发现说明TGFβ信号通路可能在所有肿瘤进程中为维持肿瘤细胞的干细胞状态提供了帮助。 TGFβ信号能够通过多个不同的信号机制诱发EMT转换过程,比如通过直接磷酸化SMAD转录因子配体活化受体(ligand-activated receptors of SMAD transcription factor)的途径,以及通过某些能够调控细胞极性和细胞间紧密连接形成过程的胞质蛋白来触发EMT转换过程。比如在乳腺上皮细胞中,TGFβ因子II 型受体就能够直接磷酸化SMAD2蛋白、SMAD3蛋白和细胞极性蛋白(cell polarity protein)PAR6A。PAR6A蛋白硫酸化之后,细胞会丧失垂直方向的极性(apical–basal polarity),同时,相邻上皮细胞间业已形成的紧密连接(tight junctions)也会解体。TGFβ还能影响其它多个EMT触发信号途径的活性,比如Notch、Wnt以及整联蛋白信号通路等。 Wnt信号通路能通过抑制糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase -3β,GSK3β)介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的β连环蛋白(β-catenin)降解等作用来诱发EMT转换。胞内丰度大量增加的β连环蛋白会转 移进入核内,作为转录因子亚单位诱导大量基因的表达,这些靶基因的表达产物中有很多都是能够诱导EMT转换过程的转录因子。 不过,β连环蛋白自身是不能够诱发EMT过程的。比如在大部分结肠直肠癌(colorectal carcinomas)细胞中,APC基因的失活或β连环蛋白基因的激活都会提高胞内的β连环蛋白水平。不过这些肿瘤细胞并没有表现出间质细胞的特性,这 说明β连环蛋白信号通路虽然在某些细胞中能够起作用,但是还不足以激活能触发EMT过程的转录因子的表达(表1)。 多项研究都发现了人乳腺癌上皮细胞钙粘 蛋白(epithelial cadherin,E- cadherin)的遗传突变失活与表观失活之间的差别,不过在乳腺癌细胞中很难观察到核内β连环蛋白积聚的现象。还有研究发现,Wnt信号通路的活性在 结肠直肠癌细胞中也有所升高,而这是因为几个特异性沉默Wnt蛋白的关键基因,比如SOX17、SFRPs、DKK1等都被抑制的结果。这也从另 进一步表明了Wnt信号通路的重要作用。 一个方面 表1 在肿瘤细胞中与EMT转换相关的基因以及它们和肿瘤临床特征之间的联系 Notch信号通路也在参与胚胎发生和肿瘤形成的 EMT转换过程的调控工作中发挥了作用。Notch信号通路非常复杂,因为该通路中包含了多个受体、配体和下游调控因子。而且令情况更为复杂的是, Notch信号通路活化之后所造成的结果还具有细胞特异性,既有可能是促进肿瘤形成,也有可能会抑制肿瘤形成。Notch信号通路也能诱发EMT过程,它 主要是通过激活NF-κB信号通路或者调控TGFβ信号通路的活性来发挥作用。Hedgehog信号通路也参与了EMT过程和肿瘤转移过程。综上所述,似 乎参与了干细胞功能调控和生态位与干细胞间相互作用(niche–stem cell interaction)调控的信号通路也都在EMT触发过程中起到了一定的作用。这也同时表明,EMT过程与细胞获得并维持干细胞样特征有一定的关系。 大量的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases,RTK)也在和EMT过程相关的胚胎发育过程中起到了重要的作用,比如胚胎分支形态发生过程(branching morphogenesis)和胚胎心脏瓣膜形成过程(cardiac valve formation)等。在某些肿瘤细胞中,这些RTK蛋白中的某一些蛋白发生了突变,表现为组成性激活(constitutively active)。还有一些细胞表面蛋白发生了改变,这也会促进EMT过程的发生。比如在多种肿瘤细胞中,上皮细胞钙粘蛋白的表达都会因为遗传或非遗传的各 种原因而缺失。于是在胞质中往往因为结合了一个上皮细胞钙粘蛋白“尾巴”而受到限制的β连环蛋白获得了“解放”,然后如前文所述,β连环蛋白得以进入核 内,诱导能促进EMT过程的转录因子的表达。因此,RTK蛋白的组成型激活和上皮细胞钙粘蛋白表达抑制这两条途径都会导致细胞获得间质细胞特性,一旦细胞 获得了这种特性,形成了肿瘤细胞,就可以不再需要肿瘤微环境中各种诱发EMT过程信号的刺激而持续保持间质细胞特性了。 1.2 缺氧的作用 缺氧(Hypoxia)也是一种能够诱发EMT过程的生理机制,它也是通过多种机制,比如上调缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF1α)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、SNAI1以及TWIST1等蛋白的表达,激活Notch或NF-κB信号通路,以及诱导DNA低甲基化等作用机制来诱发EMT 过程的。3%的氧含量就能够诱发多种人体肿瘤细胞发生EMT转换,这主要是通过抑制GSK3β的活性,从而限制了β连环蛋白的磷酸化过程和降解过程来发挥 作用的。缺氧细胞会变得更富有侵袭性,胞内的Wnt–β连环蛋白信号通路活性也会增强,因此能够诱发EMT过程的转录因子SNAI1的表达量得以上升。在 另一项研究中发现,Notch信号通路的活化是缺氧诱导EMT过程发生的先决条件。缺氧可能还会激活细胞自我加强的正反馈途径,帮助细胞维持间质细胞状 态。比如,SNAI1蛋白的活化能抑制上皮细胞钙粘蛋白的转录,从而释放出胞质里的β连环蛋白,然后β连环蛋白进入核内,激活并维持EMT诱发转录因子的 表达。 还有一些其它的胞外信号也能触发EMT过程。比如有人对小鼠乳腺上皮细胞研究发现,该细胞能对异位表达的基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3,又名间质溶解素1,stromelysin 1)做出反应,诱发EMT过程。MMP3蛋白是因为RAC1蛋白的剪接变异体RAC1B蛋白介导的活性氧簇(reactive oxygen specie)增多而出现的。 1.3 上皮细胞与基质细胞间的相互作用可以调节EMT和MET过程 正如前文所述,在肿瘤中诱发EMT过程的因子通常都是起源于和肿瘤有关的基质,即形成肿瘤微环境的基质细胞中的各种信号通路。最开始有 一些研究表明,间质细胞与上皮细胞间的相互作用在诱发EMT过程中也起到了一定的作用,它们能够增加肿瘤细胞与基质发生相互作用的表面上多种EMT分子标 志物的表达。这一点已经在多种人体肿瘤细胞核动物肿瘤模型中得以证实。 肿瘤细胞由于受到了所处微环境的影响也会发生MET转换。比如前列腺癌细胞与正常的肝细胞共培养时就会出现上皮细胞钙粘蛋白表达上调的现象,随后细 胞会表现出已分化上皮细胞的特征。这种前列腺肿瘤细胞逆转进入上皮细胞状态的证据还包括一些其他的特征,比如在正常肝细胞与肿瘤细胞间出现了细胞间相互作 用,这也是通过在细胞间形成同型上皮细胞钙粘蛋白桥(homotypical E-cadherin bridges)来完成的。还有一个尚未解决的问题就是可扩散因子,尤其是生长因子和前文中提到的细胞因子是否参与了MET的诱导过程。可能还有一种缺省 机制(default mechanism)应该也在EMT转换过程中起到了同样重要的作用,在没有能够促进细胞发生EMT转换并维持间质细胞状态的信号存在的情况下,很多正常 的细胞和新生肿瘤细胞就会在这种缺省机制的作用下回复上皮细胞状态。该理论似乎就可以解释例如在转移肿瘤细胞的生长阶段发挥作用的MET过程。因此,在原 发灶肿瘤细胞缺乏基质来源的EMT刺激信号的情况下,位于正常组织环境中的转移瘤细胞可能会通过MET过程回复上皮细胞状态。 背景知识1:胚胎发育过程中的EMT和MET转换 已经有好几篇非常精彩的综述介绍了有关在胚胎发育过程中出现的上皮-间质细胞转换(epithelial–mesenchymal transition,EMT)和间质-上皮细胞转换 (mesenchymal–epithelial transition,MET)现象。EMT和MET转换在好几个发育进程中都起到了重要的作用。在胚胎发育过程中出现最早的EMT转换是在原肠胚形成期 (gastrulation)时发生的间质细胞(mesenchymal cells)形成和中胚层(mesoderm)形成事件。胎盘(placenta)、前体节(somites)、心脏瓣膜(heart valves)、神经管嵴(neural crest)、泌尿生殖系统(urogenital tract)、继发腭(secondary palate)等组织器官的形成过程以及胚胎多个器官的分支形成过程(branching morphogenesis)中都有EMT和MET转换作用的参与。转化生长因子β(transforming growth factor-β)、Notch、Wnt、酪氨酸激酶受体信号通路等分子间的相互作用也都共同参与了在肿瘤发展进程中发挥作用的EMT和MET转换过程。 在胚胎发育过程中,与EMT作用相同的调控机制能够将上皮细胞转换成可迁移间质细胞,帮助器官的形成。但是在肿瘤发生发展的过程当中,该机制会异常活化, 从而促进了肿瘤的浸润和转移。尽管这些机制当中存在着相似之处,但是在胚胎发育过程中发挥作用的EMT和MET和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的EMT和 MET之间还是存在着一些重要的区别,尤其是在某些肿瘤中,因为体细胞突变情况,所以上述转换过程有可能是一种不可逆的过程。 2. 遗传控制和表观遗传控制 有 好几个基因都参与了EMT的调控功能,研究发现,这些基因在肿瘤细胞中都会因为遗传的或“后天的(表观遗传学)”作用而发生改变(背景知识2)。正如前文 所述, 细胞会通过各种机制稳定的缺失上皮细胞钙粘蛋白。比如编码上皮细胞钙粘蛋白的CDH1基因突变就是遗传性弥漫性胃癌(hereditary diffuse gastric cancer)的病因。而且在CDH1基因发生突变的人群中有一部分罹患乳腺小叶癌(lobular breast carcinomas)的风险也要明显高于常人。这同样是因为,在乳腺小叶癌患者中,CDH1基因经常会出现体细胞性遗传失活(somatic genetic inactivation),但CDH1基因失活也不一定会诱发EMT过程,这和我们前面提到的用RNA沉默方法抑制上皮细胞钙粘蛋白表达的情况有所不 同。 背景知识2:表观调控机制 表观调控机制包括DNA甲基化、染色质或组蛋白修饰、以及非编码RNA调控等方式。每一种机制都在干细胞功能和干细胞分化,以及肿瘤形 成过程中发挥了调控作用。比如DNA甲基化就在抑制基因表达,基因印记和X染色体失活等过程中发挥了重要作用。此外,DNA甲基化还与某些基因的细胞特异 性表达现象有关。 DNA甲基化和基因印记作用发生遗传异常会引起胚胎发育缺陷,增加肿瘤的患病几率。最近的研究还表明,DNA甲基化水平异常和染色质的改变会在细胞发生基 因突变之前就能够促进肿瘤形成。DNA甲基化过程和染色质修饰之间存在着相关性,非编码RNA可能就是联系它们之间的纽带。在最近几年里,我们新发现了好 几种组蛋白修饰方式以及参与组蛋白修饰过程的酶。最近又发现在哺乳动物细胞中,非编码RNA与DNA甲基化和组蛋白修饰也有关,这也已经逐渐成为了非编码 RNA研究领域的一个新的发展方向。 通过这种对应机制的作用,那些所编码的转录因子能够特异性诱导细胞获得干细胞表型的基因会发生低甲基化,从而促进EMT过程发生,在肿瘤细胞里则表 现为促使细胞去分化并增强其转移能力。比如最近有人对干细胞样的CD44+CD24–细胞和来自正常组织或新生乳腺组织的已分化CD24–CD44+细胞 的DNA甲基化情况作了一个全面的分析。该研究发现了几个能诱导EMT过程的转录因子,这些转录因子的编码基因在CD44+CD24–细胞中都表现为低甲 基化水平,因此能够高表达,而在CD24–CD44+细胞中甲基化水平明显增多。在MCF-12A细胞或MDCK细胞中异位表达FOXC1蛋白也能诱导 EMT转换现象出现,这是因为降低了胞内的上皮钙粘蛋白表达水平,增加了波形蛋白(vimentin)的表达,促进了细胞的运动能力和浸润能力。基于这种 基因低甲基化导致EMT的理论,有人对MCF-7乳腺癌细胞给予5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine)进行了实验。5-氮杂胞苷是一种DNA甲基 转移酶(methyltransferase)抑制剂,它能上调与EMT过程相关的促细胞侵袭基因(pro-invasive EMT-associated gene)的表达,增强细胞的侵袭能力和转移能力。这些研究结果提示我们,需要谨慎对待使用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗乳腺癌的这种方法,因为这会增加 肿瘤细胞的播散转移风险。 2.1 转录调控机制 在图1和表1中我们列举了大概6至8种转录因子,它们被证实能够调控胚胎发育过程和肿瘤发生发展过程中的EMT作用。这些转录因子中既 有能够直接抑制上皮钙粘蛋白表达的SNAI1、SLUG(又名SNAI2)、SIP1(又名ZEB2)、E47(又名E2α)等转录抑制因子 (transcriptional repressors),也有TWIST1、FOXC2、FOXC1、GSC、ZEB1等间接对上皮钙粘蛋白表达发挥作用的因子。越来越多的证据表明,这 些转录因子间大量的相互作用使得它们能够形成一个信息网络,来诱导上皮细胞表现出间质细胞的表型并且长期维持这种表型。另外,还有一些转录因子,比如 TWIST1还在抵抗细胞衰老,诱导肿瘤干细胞形成的过程中 起到了关键性的作用。正如前文中所提到的,EMT诱导转录因子同时也能赋予上皮细胞干细胞的表 型,见图1。KIT受体这个在造血系统中对维持造血细胞的干细胞状态起到重要作用的因子也支持了上述理论,因为在小鼠和人体试验中都发现,KIT蛋白能诱 导SNAI2的表达。 2.2 非编码RAN对EMT和肿瘤转移过程的调控作用 我们现在越来越认识到非编码RNA在基因表达调控方面占据了十分重要的地位。最近有好几 -200家族(miR-200a、 个研究都发现,非编码RNA能够激活EMT程 序,这些RNA包括miR miR-200b、 miR-200c、 miR-141、miR-429)和miR-205等。同时还发现ZEB2基因的天然反义转录产物(anti-sense transcript)也具有同样的功能。在所有这些研究中都发现了一个共同点,那就是在所有的EMT调控途径中,上皮钙粘蛋白的表达都会受到抑制。 有两个独立的研究团队运用两种完全不同的方法分别发现了miR-200家族和miR-205在EMT程序中的作用。在其中一项研究中发现,各种不同 肿瘤细胞中的miRNA表达模式都与细胞表现为上皮细胞特征还是间质细胞特征有关,而这又可以通过上皮钙粘蛋白(CDH1基因)和波形蛋白 (vimentin,VIM基因)的mRNA水平来判断。miR-205的表达水平以及miR-200家族成员的表达水平也都会随着波形蛋白mRNA的表 达水平而“反向运动”。后续的研究工作又发现,这些miRNA的靶标包括ZEB1和ZEB2这两种能够诱导EMT过程发生的转录因子,它们都能抑制上皮钙 粘蛋白的表达。后来又在原发性人体卵巢浆液性乳头状癌(primary human serous papillary carcinomas of the ovary)中发现这些miRNA的表达都与CDH1基因呈正相关,与VIM基因呈负相关。 另一项研究发现,在马-达二氏犬肾(Madin–Darby canine kidney,MDCK)细胞中,细胞如果经TGFβ或者酪氨酸磷酸酶PEZ的诱导进入EMT程序之后,miR-205和miR-200家族成员的表达均 有下调。ZEB1和ZEB2仍然是这些miRNA的作用靶标。而且,这些miRNA分子的表达下调足以诱导EMT过程的发生,同时如果异位表达这些 miRNA分子,则能够诱发MET过程。 还有一些科研人员在人结肠癌细胞中利用SNAI1诱导发生的EMT过程发现了另一种调控ZEB2基因mRNA水平的机制。细胞在SNAI1蛋白的诱 导下进入EMT程序之后,ZEB2蛋白的表达会随之增加,因为ZEB2基因的mRNA水平有所提高,但是并没有发现ZEB2基因的转录水平有明显的改变。 Beltran等人结合了好几种手段发现,ZEB2的表达是由一自然反义转录产物所调控的,该转录体能够阻止包含有内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site)的5’非翻译区(untranslated region,UTR)中一大段内含子被剪接。该5’UTR区还含有一段序列,该序列能够抑制核糖体扫描(ribosome scanning),从而降低mRNA的翻译效率,导致上皮细胞中ZEB2蛋白的水平降低。不过在EMT程序激活时,这种反义转录产物的水平会升高,它与 5’UTR结合之后会抑制其剪接,从而保留了内部核糖体进入位点,增强了mRNA的翻译效率,增加了ZEB2蛋白的水平,因此也就降低了胞内上皮钙粘蛋白 的含量。 非编码RNA通过对EMT和MET的调控也参与了肿瘤浸润和转移过程的调控。比如对转移乳腺癌细胞和非转移乳腺癌细胞中候选miRNA的分析表明, miR-10b是与细胞获得间质细胞表型和侵袭转移能力有关的miRNA。随后又有研究人员发现,miR-10b能够被TWIST1蛋白诱导,而胞内 TWIST1蛋白水平升高之后也会抑制HOXD10基因的表达,上调RHOC蛋白的水平,从而增强细胞的侵袭和转移能力。还有一点需要提及的是,在出现转 移灶的患者体内原发肿瘤细胞中miR-10b分子的表达水平会更高一些。 与miR-10b作用相反,有人对MDA-MB-231乳腺癌转移细胞和非转移细胞进行芯片分析之后发现,miR-335可以抑制肿瘤侵袭和转移。 miR-335似乎能够通过影响转录因子SOX4和胞外基质蛋白粘蛋白C(tenascin C)的表达来抑制肿瘤转移。Tavazoie等人还发现了一种miR-335 基因标签(gene signature),该标签由6个基因组成,它们分别是COL1A1、MERTK、PLCB1、PTPRN2、TNC和SOX4基因。这些基因的表达会 受到miR-335的抑制,不过在转移瘤细胞中,它们的表达水平会升高。这种miR-335基因标签还与乳腺癌患者无转移发生生存率较低的现象有关,这也 说明了miR-335在肿瘤转移调控中发挥了一定的作用。在将来,随着发现鉴定非编码RNA技术的进步,以及非编码RNA功能研究手段的丰富,我们必将能 够发现更多的非编码RNA在EMT和MET过程中发挥关键的调控作用。现在,大家都逐渐认识到miRNA与细胞生理的各个方面都有联系,因此我们有理由相 信,miRNA和蛋白质一起,在细胞调控机制中发挥了主要作用。 3. 间质细胞-上皮细胞转换 最近的研究表明,具有与EMT过程相关基因表达标签的原发肿瘤发生转移的可能性会更高,患者的无转移生存时间也更短。不过我们反复观察 的结果却是转移灶肿瘤组织主要是由表现上皮细胞表型的肿瘤细胞组成,即与原发灶肿瘤细胞比较类似,但这种现象与上述EMT会促进肿瘤转移的观点看起来非常 矛盾。如果肿瘤细胞必须经过EMT转换才能播散转移的话,为什么转移灶肿瘤细胞会与原发灶细胞在组织学水平上如此相似呢, 实际上,这并不矛盾,因为在肿瘤细胞经历EMT转换转移到远隔部位之后还会再经历一个MET转换,让转移瘤细胞回复到上皮细胞状态(图2)。有好几 项研究都表明,CDH1基因启动子的DNA甲基化水平会随着肿瘤转移的进程而不断发生变化。在原发乳腺癌细胞中,肿瘤细胞会发生一个短暂的超甲基化,抑制 CDH1基因的表达,增强肿瘤细胞的侵袭性和转移能力,但是肿瘤细胞完成转移之后,上皮钙粘蛋白的表达又会再次增强,这是因为CDH1基因启动子又经历了 一次去甲基化修饰。不幸的是,这些研究都没有对肿瘤细胞进行克隆鉴定。还有一种可能就是原发肿瘤细胞中具有上皮细胞DNA甲基化状态的肿瘤细胞发生了转 移,因此转移灶处的肿瘤细胞也就表现为上皮细胞表型。因此,EMT-MET转换理论还值得进一步的推敲、验证。 图2 在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞在上皮细胞状态与间质细胞状态之间转换过程示意图。在肿瘤原发灶中,EMT过程和MET过程都与肿瘤细胞异质性 (heterogeneity)现象有关,而肿瘤细胞异质性现象正是肿瘤难以治疗以及容易发生转移的一大原因。粒细胞和肿瘤相关成纤维细胞等间质细胞之间 的相互作用可能会触发EMT转换过程,赋予上皮样肿瘤细胞间质细胞或者肿瘤干细胞的表型,从而促进肿瘤细胞的生长和存活。肿瘤干细胞更容易发生转移,也更 容易从循环系统和微小转移灶(micrometastases)中被检出。不过临床可见的巨大转移灶(macroscopic metastases)更主要的是由分化更好的上皮样肿瘤细胞所组成。这是因为在微小转移灶形成之后,又会出现一个MET转换,将EMT转换得来的细胞回 复成 上皮样肿瘤细胞。之所以会出现这种回复过程可能是因为,在转移灶处的局部选择压力使得具有上皮细胞表型的肿瘤细胞更适于生长,或者是因为缺乏EMT诱 导信号的刺激。不过,我们也不能排除,是上皮样肿瘤细胞和间质样肿瘤细胞相互合作促使肿瘤转移发生的。 背景知识3:小非编码RNA 最近发现的一些小非编码RNA属于一大类新型的基因表达调控因子,它们可能是在转录后水平发挥调控作用,可能还参与了表观遗传调控过 程。在最近这几年里,研究发现miRNA和piRNA对于干细胞的功能、细胞分化以及胚胎发育都是必须的。而且,miRNA还具有促进肿瘤形成和抑制肿瘤 形成的作用,miRNA是一段19~25bp长的单链RNA分子,它由Rnase III经过一系列催化作用得来。miRNA会参与形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complexes,miRISC)。一种miRNA分子能与多种mRNA靶标结合,抑制其翻译,甚至促进其降解。在某些情况下,miRNA还能通过某些 未知机制影响基因转录。piRNA在生殖细胞(germ line)里起到了调控转座子移动的作用,它们还可能在体细胞里参与细胞生理过程的调控,不过目前机制还不清楚。 4. EMT和MET的临床重要性 EMT转换过程与肿瘤的两大重要特性有关,这两大特性分别是肿瘤转移以及肿瘤抵抗治疗。 干细胞样特性有关。有两个研究小组都分别这两大特性可能都与EMT转换所导致的肿瘤细胞 发现,在乳腺上皮细胞里能诱导EMT过程的转录因子TWIST1或SNAI1表达之后,通过细胞表面抗原检测、基 因表达谱检测、能否形成mammosphere的检测以及异体移植后能否形成导管等检测方法发现,干细胞样细胞的数量都会明显增多,使用TGFβ也能得到 同样的结果。其中一个研究小组分别对从正常人体乳腺组织和原发乳腺癌组织中分离出的CD44+CD24–细胞进行了与EMT过程有关基因表达情况的分析, 结果发现能够诱发EMT转换的转录因子,比如TWIST1、 FOXC2、 SNAI1、 ZEB2 (又名SIP1)、TWIST2等,以及波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin)在CD44+CD24– 干细胞样肿瘤细胞中的表达水平要比在分化程度更高的CD44+CD24–上皮样肿瘤细胞中高的多。这些实验结果加上以前的研究成果一起表明,在CD44+ CD24–乳腺癌肿瘤细胞中与肿瘤浸润、转移和血管生成相关的基因都有上调,同时细胞的侵袭和转移能力也增强了。同时,研究还发现,播散到循环系统和骨髓 中的乳腺癌细胞中表现为CD44+CD24–抗原表型的细胞数量也明显增多。 大量出现的CD44+CD24– 干细胞样肿瘤细胞以及与EMT过程相关的基因大量表达这些现象都与基底细胞样乳腺癌有关(basal-like subtype of human breast cancer)。对479例乳腺癌样品进行免疫组化分析后发现与EMT过程有关的蛋白,比如波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin)、神经钙粘蛋白(neural cadherin,N-cadherin)、SPARC蛋白、层粘连蛋白(laminin)以及成束蛋白(fascin)等都会大量表达,而上皮钙粘蛋白 的表达量相比其他类型的乳腺癌细胞则会下降。这些肿瘤因为容易发生转移,所以预后都比较差。另一个研究小组分析了117例原发侵袭性乳腺癌样品中能诱发 EMT转换的转录因子FOXC2的表达情况,结果发现该因子与基底细胞样乳腺癌关系密切。结合这些实验结果以及双重免疫组化检测(dual immunohistochemical analysis)结果证明,基底细胞样乳腺癌细胞就是CD44+CD24–肿瘤细胞。 EMT转换机制对于肿瘤抵抗临床治疗也具有十分重要的作用。在经过标准化疗之后的肿瘤“残余”灶中,剩余的肿瘤细胞大部分都是干细胞样肿瘤细胞。比 如给予乳腺癌患者新辅助疗法 (neoadjuvant therapy)和标准的蒽环霉素及紫杉烷化疗(anthracycline–taxane chemotherapy)之后,在活检组织中可以发现,表达有与EMT过程相关基因的CD44+CD24–细胞的数量明显增多。但是对ERBB2+的乳 腺癌患者用表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)和ERBB2双重抑制剂拉帕替尼泊(lapatinib)治疗之后则不会出现这种情况。对于某些肿瘤而言,比如肺癌和结肠 癌,细胞经历EMT转换之后,对于EGFR激酶抑制剂的敏感性会降低,这可能是因为细胞活化了EGFR激酶的下游因子PI3K和Akt,从而不再需要 EGFR激酶信号通路的作用。 EMT转换作用和肿瘤细胞随即表现出来的肿瘤干细胞特征也都与肿瘤细胞的抗凋亡机制相关。对EpH-4和NMUMG鼠乳腺上皮使用TGFβ诱导 EMT作用之后,这些上皮细胞都对紫外线诱导的凋亡机制产生了抵抗作用。同样,在乳腺癌细胞中,下调let-7 miRNA的表达水平能够增强肿瘤细胞的转移能力,同时也能使肿瘤细胞对治疗产生抵抗。这都是因为肿瘤细胞获得了干细胞特征,该细胞的基因表达谱也会变成 与EMT过程相关的基因表达模式。将肿瘤上皮细胞和间质成纤维细胞共培养,或者将肿瘤上皮细胞置于缺氧的环境之中也能使它们对治疗产生抵抗,这也有可能是 因为细胞发生了EMT转换。 5. 结论 越来越多的证据表明,EMT和MET转换在肿瘤细胞可塑性(cellular plasticity)调控机制中起到了非常关键的作用。同时,它们对于肿瘤、转移复发和肿瘤细胞的治疗耐受现象也负有重要责任。EMT和MET程序的作 用以及相关的调控因子对于某些肿瘤,尤其是神经外胚层肿瘤(neuroectodermal neoplasias)、间质肿瘤(mesenchymal neoplasias)和造血系统肿瘤(haematopoietic neoplasias)的作用还需要做进一步的研究。由于EMT转换而带来的种种结果在临床上都具有非常重要的意义,因此,抑制EMT转换过程就成为了一 个相当有前景的治疗方案。不过由于调控EMT过程的信号通路网络太过复杂,加上还存在一个可以逆转EMT转换结果的MET转换机制,这使得情况变得更为错 综复杂。另外,哪一些肿瘤细胞应该被治疗,应该在肿瘤发展的哪个阶段给予治疗,对于这些问题我们还都一无所知。最近的研究显示,肿瘤细胞在肿瘤发展早期就 已经开始全身性播散(systemic dissemination),那么在临床诊断出患有肿瘤之后再给予EMT抑制治疗就已经太晚了。不过如果肿瘤转移是接续式的(即一个转移灶再播散、转移 形成下一个转移灶),那么使用EMT抑制疗法应该可以抑制后续的肿瘤转移现象发生。 我们现在还不清楚,在抑制EMT过程时抑制哪个(些)信号途径才能获得最佳的治疗效果,同时对身体的毒副作用达到最低。EMT程序与正常干细胞程序 之间的相似性使得EMT抑制疗法的毒副作用成为了一大障碍。同时,EMT程序与MET程序的可逆特点也让我们对EMT抑制疗法的疗效表示怀疑。另外还有一 个关键问题就是,因为肿瘤出现转移往往需要数年,甚至是数十年的时间(比如乳腺癌),那么我们该如何在出现肿瘤转移之前就能够判断出EMT抑制疗法是否有 效呢, 我们上面提及的种种问题都表明,尽管我们经过了大量的努力,发现了EMT和MET背后的一些分子机制,也证明了它们对于临床肿瘤患者的重要意义,但 是要根据EMT和MET机制开发出有效的抗癌疗法,我们还有一些重要的基本问题需要解决。不过我们相信,随着科研人员们的不懈努力,这些问题一定会在不久 的将来被逐一解决。 小词典 基因印记:高等动物的基因组为两倍体,受精卵从双亲中各继承了一套基因组。每一个常染色体均为双拷贝,父源和母源常染色体基因都能有均 等的机会表达或受到抑制,这是孟德尔遗传定律的基本要素。上世纪90年代开始,发现了不符合这个定律的遗传现象。某些基因呈 单等位基因表达,即父源与母源 的基因拷贝不能同时表达,并且,父源或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制,特异性地抑制另一母源或父源染色体等位基因表达。例如:胰岛素样生长因子 2基因(insulin-like growth factor 2, IGF2)只表达源自父亲的等位基因,母源等位基因被抑制。相反的例子,胰岛素样生长因子2受体基因(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R)为源自父亲的等位基因不表达,只表达母源等位基因。这种现象可能是在父母受精卵形成过程中,特异性地对源自父亲或源自母亲的等位基因做一印记 使其只表达父源或母源等位基因。这种现象被称作基因印记。基因印记的机制现在还不完全了解,从到目前为止的研究成果看,与DNA的甲基化、染色质构造的改 变、DNA复制时机的变化、和非编码RNA的调节作用有关。 原文检索: Kornelia Polyak and Robert A. Weinberg. (2009) Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews , 9:265-273. Cancer YORK/编译
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