食品微生物检测方法

食品微生物检测方法 类别:操作标准—检验规程 起草人: 日期: 年 月 日 颁发部门:质量技术部 审核人: 日期: 年 月 日 编码:QC-O-032 批准人: 日期: 年 月 日 标题:食品微生物检测方法 分发部门:总经理室、质量技术部～行政部,存档, 生效日期: 年 月 日 总页数:12页 分发号: 变更记载: 变更摘要: 修订号 原批准日期 原生效日期 食品微生物检测方法 范围 本标准规定了食品微生物检测方法 1 菌落总数 1.1 培养基和试剂 ?、营养琼脂培养基:按GB/T4789.28-2003中4.7规定 成分: 蛋白胨 10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15,20克 、蒸馏水 1000ml 制法: 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121?高压灭菌15分钟. 注:此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%. ? 磷酸盐缓冲液:按GB/T4789.28-2003中3.22规定. 成分: 磷酸二氢钾 34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml 、PH7.2 制法: 先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000 ml. 稀释液: 取储存液1.25 ml ,用蒸馏水稀释至1000 ml,或每管10ml,121?高压灭菌15分钟. ? 明胶磷酸盐缓冲液 成分:明胶 2克、磷酸氢二钠 4克、蒸馏水 1000ml、PH6.2 制法:加热溶解,校正PH,121?高压灭菌15分钟. ? 0.85%灭菌生理盐水 ? 75%乙醇 2/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 1.2 设备和材料 ? 冰箱:0~4? ? 恒温培养箱36??1? ? 恒温水浴锅46?1? ? 均质器或灭菌乳钵 ? 架盘药物天平:0~500克，精确至0.5克. ? 菌落计数器. ? 大镜4× ? 灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度) ? 灭菌锥形瓶:500ml ? 灭菌玻璃珠:直径约5mm ? 灭菌培养皿直径约90mm ? 灭菌试管16mm×160mm ? 灭菌刀、剪子、镊子等。 1.3 检验程序( 菌落总数的检验程序见图1) 检样 做成几个适当倍数的稀释液 选取择2个—3个适宜稀释度 各取1ml分别加入灭菌培养皿内 36?1度48?2h 每皿内加入适量营养琼脂 菌落计数 报告 1.4 操作步骤 QC-O-032 食品微生物检测方法 3/12 ? 检样稀释及培养 a. 以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min,10000r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 b. 用1ml的灭菌吸管吸取1:10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。 c. 另取1ml灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml吸管。 d. 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，，选择2,3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。 e. 吸稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46?营养琼脂培养基(可放置46?1?水浴锅保温)注入培养皿约15ml 并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿内作空白对照。 f. 待琼脂凝固后，翻转平板，置36?1?温箱内培养48h?2h. ? 菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 ? 菌落计数的报告 a. 平板菌落数的选择 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落间无明显界线)，若仅有一条链。可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 b. 稀释度的选择 4/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 1. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乖以稀释倍数报告之(见表1中例1)。 2. 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2，则报告其中较小的数字，(见表1中例2及例3)。 3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以箕释倍数报告之(见表1中例4)。 4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释找最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例5)。 5. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1中例6)。 6. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例7)。 c. 菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后在的零数，也可用10的指数来表示(见表1)。 表1稀释度选择及菌落数报告方式 例次 稀释液及菌落数 两稀释液菌落总数 报告方式 -1-2-310 10 10 之比 (cfu/g) (cfu/g(ml)) 1 多不可计 164 20 , 16400 16000 2 多不可计 295 46 ,.6 37750 38000 3 多不可计 271 60 2.2 27100 27000 4 多不可计 多不可计 313 , 313000 310000 5 27 11 5 , 270 270 6 0 0 0 , <1×10 <10 7 多不可计 305 12 , 30500 31000 2 大肠菌群的检测 2.1 大肠菌群的测定 QC-O-032 食品微生物检测方法 5/12 2.1.1 设备和材料 ? 恒温培养箱:36?1?。 ? 冰箱:0,4?。 ? 恒温水浴锅:44.5?0.5?。 ? 架盘药物天平:0,500g,精确至0.5g。 ? 显微镜10×,100×。 ? 均质器或乳钵。 ? 平皿:直径为90mm。 ? 试管16mm× 160mm。 ? 吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。 ? 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 ? 玻璃珠:直径约5mm。 ? 载玻片。 ? 酒精灯。 ? 试管架。 ? 灭菌刀、剪子、镊子 2.1.2 培养基和试剂 ? 乳糖胆盐发酵管: 成分:蛋白胨:20g 猪胆盐(或牛、羊胆盐):5g 乳糖:10g 0.04%溴甲酚紫水溶液:25ml 蒸馏水:1000ml PH:7.4 制法:将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水，校正PH，加入指示剂，分装每管10ml，并放 入一个小倒管，115?高压灭菌15min. 注:双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。 ? 伊红美蓝琼脂平板 成分:蛋白胨:10g 乳糖:10g 6/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 磷酸氢二钾:2g 琼脂:17g 2%伊红Y溶液:20 ml 0.65%美蓝溶液:10 ml 蒸馏水:1000ml PH:7.1 制法:将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧瓶内，121?高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷却至50,55?,加入伊红和闰蓝溶液，摇匀，倾注平板。 ? 乳糖发酵管 成分:蛋白胨:20g 乳糖:10g 0.04%溴甲酚紫水溶液:25ml 蒸馏水:1000ml] Ph:7.4 制法:将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正ph，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml、或3ml ,并放入一个小倒管，115?高压灭菌15min。 注1:双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。 注2:30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用,3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。 ? EC肉汤 成分:胰蛋白胨:20g 3号胆盐(或混合胆盐):1.5g 乳糖:5g 磷酸氢二钾:4g 磷酸二氢钾:1.5g 氯化钠:5g 蒸馏水:1000ml 制法:将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121? 高压灭菌15min，最终ph为6.9?0.2. QC-O-032 食品微生物检测方法 7/12 ? 磷酸盐缓冲液 成分:磷酸二氢钾:34g 1mol/l氢氧化钠溶液:175 ml 蒸馏水:825ml PH:7.2 制法:先将磷酸溶解于500ml蒸馏水中，用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后，再用蒸馏水稀释至1000ml.稀释液 取储存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1000ml,分装每瓶100ml或每管10ml，121?;高压灭菌15min。 0.85%灭菌生理盐水 ? 革兰氏染色液 成分:结晶紫:1g 95%乙醇:20ml 1%草酸铵水溶液:80ml 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液法混合 革兰氏碘液 成分:碘:1g 碘化钾:2g 蒸馏水:300ml 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml 沙黄复染液 成分:沙黄:0.25g 95%乙醇;10ml 蒸馏水:90ml 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 染色法: a 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水先。 b 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。 c 滴加95%乙醇脱色，约 30S;或将乙醇滴满整个涂片，立即倾无能为力，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s. 8/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 d 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗 ，待干，镜检。 结果:革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。 注:亦可用 1:10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间公需10s. 2.1.3 操作步骤 2.1.3.1 检样稀释 a 以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1?10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000,10000r/min的速度处理1min，做成1?10的均匀稀释液。 b 用1mL灭菌吸管吸取1?10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1?100的稀释液。 c 另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 d 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。 2.1.3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36?1?温箱内，培养24?2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 2.1.3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36?1?温箱内，培养18,24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 2.1.3.4 证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1,2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36?1?温箱内培养24?2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 2.1.3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。见附录A。 QC-O-032 食品微生物检测方法 9/12 2.1.4 粪大肠菌群(faecal coliform) 2.1.4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC肉汤管内，置44.5?0.2?水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养24?2h，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性;如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36?1?培养18,24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。 2.1.4.2 结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。 2.3 霉菌和酵母菌 2.3.1 培养基和试剂 ? 灭菌蒸馏水 ? 虎红(孟加拉红)培养基 成分: 蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 磷酸二氢钾 1g 硫酸镁(含7HO) 0.5g 2 琼脂 20g 1/3000虎红溶液 100mL (四氯四碘荧光素) 蒸馏水 1000mL 氯霉素 100mg 制法: 将上述前5种成分加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液。分装后，103.43kPa，20min高压灭菌。另用少量乙醇溶解氯霉素，过滤除菌后，加入培养基中，若无氯霉素，可用链霉素代替，每1000mL培养基加链霉素30mg。 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素 ? 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 成分:马铃薯(去皮切块) 300g 葡萄糖 20g 10/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 制法:将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10,20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121?高压灭菌20min。 2.3.2 仪器 ? 冰箱:0~4? ? 恒温培养箱25?-28? ? 恒温振荡器 ? 显微镜:10×,100× ? 架盘药物天平:0~500克，精确至0.5克. ? 菌落计数器. ? 大镜4× ? 灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度) ? 灭菌具塞锥形瓶:300ml ? 灭菌广口瓶:500ML ? 灭菌培养皿直径约90mm ? 灭菌试管16mm×160mm ? 灭菌刀、金属勺等。 ? 载玻片、盖玻片、 ? 灭菌牛皮纸袋、塑料袋 2.3.3 操作步骤 ? 以无菌操作取检样25克(ML)，放放含有225ML灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30分钟，即为1:10稀释液。 ? 用灭菌吸管吸取1:10稀释液10ML，注入灭菌试管中，另1ML灭菌吸管反复吸取款50次，使霉菌孢子充争散开。 ? 用1ml的灭菌吸管吸取1:10的稀释液注入含有9ml灭菌水的试管内，另取一支取1ML灭菌吸管吹吸五次，此液为1:100的稀释液。 ? 按上述操作顺序做工10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1ML灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择三个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1ML稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做二个平皿，然后将晾置45度左右的培养基注入平皿 QC-O-032 食品微生物检测方法 11/12 中，并转动使之与样液混匀，待琼脂凝固后，倒置于25,28度的温箱中，三天后开始观察，共培养观察五天。 ? 计算方法:通常选择菌落数在10,150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落数平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母菌。稀释度选择及菌落报告方式可参考GB/T4789。2 ? 报告:每克(或亳升)食品所含霉菌和酵母菌数以cfu/g(ml)计。 2.4 沙门氏菌检测方法 2.4.1 前增菌和增菌 以无菌操作取25g(ml)样品，加在装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内。固体产品先用乳钵加灭菌砂磨碎，于36??1?培养4h，移植10ml转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液内，于42?培养18h-24h。同时，另取10ml转种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36??1?培养18h-24h。 2.4.2 分离 取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)，两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36??1?分别培养18h-24h，观察各个平板上生长的菌落，如发现疑似沙门杆菌的送权威质检部门测定。 2.5 志贺氏菌检测方法 2.5.1 增菌 以无菌操作取25g(ml)样品，加在装有225mlGN增菌液的广口瓶内。固体产品先用乳钵加灭菌砂磨碎，于36??1?培养6h-8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2.5.2 分离 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板一个，于36??1?分别培养18h-24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。观察各个平板上生长的菌落，如发现疑似志贺氏菌的送权威质检部门测定。 2.6 金黄色葡萄球菌检验 2.6.1 增菌及分离培养 12/12 食品微生物检测方法 QC-O-032 检样处理:以无菌操作取25g(ml)样品，加在装有225ml灭菌生理盐水。固体产品碾磨或置均质器中制成混悬液。 吸取5ml上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内，于36??1?培养24h。 转种血平板和Baird-Parker平板，36??1?培养24h，挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。 金黄色葡萄球菌形态:本菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5um-1um。如发现疑似金黄色葡萄球菌的送权威质检部门测定。 2.7 溶血性链球菌检验 2.7.1 增菌及分离培养 检样处理:以无菌操作取25g(ml)样品，加在装有225ml灭菌生理盐水。固体产品碾磨或置均质器中制成混悬液。吸取5ml上述混悬液，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板上。于36??1?培养24h。挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，如发现疑似溶血性链球菌的送权威质检部门测定。