浅谈丝裂霉素C对兔角膜准分子激光切削术后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子β2表达的影响

浅谈丝裂霉素C对兔角膜准分子激光切削术后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子β2达的影响 浅谈丝裂霉素C对兔角膜准分子激光切削术后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子β2表达的影响 作者: 张磊 王强 雷宁玉 任莉 戴慧琴 【摘要】 目的 探讨丝裂霉素C(MMC)对兔角膜准分子激光切削术(PRK)后角膜愈合、角膜上皮下混浊及转化生长因子β2 (TGF β2)表达的影响。方法 24只健康新西兰白兔(48眼)分两组行PRK手 术，术后将浸有0.02% MMC的滤纸片放置在右眼角膜中央切削区(MMC组)，将浸有平衡盐水(BSS)的滤纸片放置在左眼角膜中央切削区(BSS组)2 min后用150 ml BSS冲洗。同时设立正常对照组。观察角膜上皮愈合情况、角膜浅基质层角膜细胞数量和形态变化及角膜上皮下混浊;免疫组化检测正常对照组及手术组(MMC组和BSS组)术后1 d、1周、4周和12周 TGF β2表达情况并作分析。结果 MMC组角膜上皮愈合 时间为(3.0?0.69)d，对照BSS组为(3.0?0.71)d，两组差异无统计学意义(P,0.05);术后MMC组浅基质层内角膜细胞明显减少，两组差异有统计学意义(P,0.05);BSS组角膜上皮下混浊明显重于MMC组，两组差异有统计学意义(P ,0.05);术后各时段BSS组TGF β2表达多于MMC组。结论 MMC不会延长角膜上皮的修复时间，并减轻术后角膜上皮下的混浊;MMC减轻术后角膜上皮下混浊形成可能部分与其调节TGF β2的表达有关。 【关键词】 准分子激光屈光性角膜切削术;丝裂霉素C;角膜上皮下混浊;转化生长因子β2 【Abstract】 Objective To investigate the effect of mitomycin C corneal wound healing，haze and expression of transforming growth factor β2 after photorefractive keratectomy(PRK) in rabbits.Methods Twenty four New Zealand rabbits divided randomly into MMC group and BSS group underwent bilateral 193 nm excimer laser photorefractive keratectomy to correct 6.0 diopter of myopia. After surgery a filter soaked with 0.02%MMC was placed on the central ablation stromal bed in the right eye and BSS in the left eye for 2 minutes then irrigated with 150 ml BSS. The process of epithelialization was observed .Corneal haze was assessed biomicroscopically using Fantes scale. The number of superficial stromal keratocytes was counted and morphologic changes were observed. Expression of TGF β2 was detected and analyzed by immunocytochemical method at 1 d,1 week,4 week and 12 week after surgery.Results Mean epithelialization time was (3.0?0.69)days in the MMC eyes and 3.0?0.71 days in the control BSS eyes(not statistically significant,P,0.05).A remarkable reduction of keratocytes in the superficial stroma after surgery was observed in MMC group(P,0.05).Corneal haze was more severe in BSS group than in MMC group. Expression of TGF β2 in corneas had increased more in BSS group than in MMC group at all time.Conclusion MMC did not delay epithelialization and could lessen the development of haze after photorefractive keratectomy. The effect of MMC on inhibiting haze induced by PRK maybe mediated through the suppression of TGF β2. 【Key words】 photorefractive keratectomy,mitomycin C,haze,transforming growth factor β2 准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)是一种简单、安全和有效的治疗近视、远视和散光等屈光不正的方法,,，,,。但其 在角膜愈合过程中产生显着的角膜上皮下混浊(haze)和屈光回退，从而限制了该术式的进一步应用,,,。准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomilensis, LASIK)与PRK相比，具有术后反应轻，视力恢复快，屈光状态稳定，无haze，无明显疼痛等优势，成为世界的主流术式,,,。然而，LASIK同样也存在着不可避免的与角膜瓣相关的术后并发症以及继发性圆锥角膜，严重威胁眼的屈光功能和眼的完整性,,,。所以，近年来激光表面切削术重新得到重视，并针对如何利用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)减轻术后haze及屈光回退展开了深入的研究，并取得了理想的成果,,,,,。但MMC如何抑制haze的形成，其机制仍然不明,,,。本研究旨在观察MMC对兔角膜PRK术后角膜愈合和haze产生的影响，并利用免疫组化的方法，通过分析转化生长因子β2(TGF β2)和角膜细胞变化关系，探讨MMC抑制角膜haze可能机制，为在临床中更好的利用MMC提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1. 1.1 实验动物: 选择国际实验动物纯种新西兰大白兔27只(滨州医学院动物实验中心提供)，雌雄不限，体质量2.5,3.0 kg，裂隙灯检查无眼前部病变。 1. 1.2 主要试剂和仪器: MMC 2 mg/支，浙江海正药业股份公司生产;DME培养液(美国Gibco公司);甘油(上海化学试剂二厂);TGF β2多克隆抗体(美国 Promega公司);羊血清、生物素化抗兔IgG 、链霉亲和素 生物素 过氧化酶复合物(美国Maxim Biotech公司);DBA(上海化学试剂二厂);Scan 2017型准分子激光治疗仪(美国雷塞公司)。 1.2 方法 1.2.1 实验分组:24只兔48眼，右眼为MMC治疗组(MMC组)，左眼为平衡盐水(BSS)对照组(BSS组)，另设3只兔6眼为正常对照组。 1.2.2 动物模型的建立:10%水合氯醛3 ml/kg体重腹腔注射麻醉动物，同时0.4%盐酸奥布卡因眼表面麻醉。由专人手术。校正-6.0 D，直径5 mm，深度约为100 μm。术后分别将直径6 mm浸有0.02%MMC及BSS的滤纸放置在右眼或左眼中央切削区2 min，然后立即用150 ml BSS冲洗，涂红霉素眼膏并遮盖双眼，待动物苏醒后去掉遮盖。双眼均给予氧氟沙星点眼，每天1次，直至上皮愈合。 1.2.3 活体裂隙灯显微镜观察:手术组所有兔眼术后1 d、1周、4周、12周检查角膜情况，记录手术组兔眼术后角膜上皮完全愈合时间;记录兔眼术后1周、4周、12周haze程度及分级。 haze分级(fantes分级) 0级: 角膜完全透明;1级: 仅在裂隙灯显微镜下仔细检查方能发现的细微混浊;2级: 在裂隙灯显微镜下较易发现的细微混浊;3级: 中度混浊，通过混浊的角膜看不清虹膜的细节;4级: 重度混浊，角膜混浊遮挡眼内的结构。 1.2.4 标本制作 1.2.4.1 角膜切片标本制作:分别于手术后4 h、1周、4周和12周采集动物角膜，常规包埋切片，备HE染色及免疫组织化学染色。 1.2.4.2 HE染色:在300倍光学显微镜下，对手数组和对照组选取角膜中央手术区仅靠上皮下1/4基质，测定基质浅层成纤维细胞数量。每份标本取3张切片，每张切片取5个测定区，计算平均值，结果以x?s表示。 1.2.4.3 免疫组织化学染色步骤: 将标本常规脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化酶活性，正常山羊血清封闭。加一抗为1?400稀释的TGF β2单抗50 μl。加二抗: 取出切片后，室温放置20 min，0.1 mol/L PBS洗5 min，共3次，加二抗50 μl，室温孵育10 min，0.1 mol/L PBS洗5 min共3次。加链霉素抗生物蛋白 过氧化酶溶液，滴加三抗，室温孵育10 min，0.1 mol/L PBS洗5 min，共3次。DBA显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。阴性对照采用PBS代替一抗。免疫组织化学染色结果判定: 以胞质出现棕黄色染色为阳性。 1.3 统计方法 应用SPSS13.0统计软件处理。秩和检验计算haze程度比较、角膜上皮愈合时间，t检验用于免疫组化分析。 2 结果 2.1 裂隙灯显微镜观察 2. 1.1 角膜上皮愈合情况:两组角膜愈合时间相似，见表1。MMC组平均愈合时间为(3.0?0.69)d(范围2,4 d)，对照BSS组为(3.0?0.71)d(范围2,4 d)，两组差异无统计学意义(P,0.05)。表1 各组角膜上皮愈合时间分布 2. 1.2 haze情况:两组均于术后1周左右出现haze，至4周时达到高峰，以后逐渐减退。术后4周与术后1周、12周进行组内比较，差异有统计学意义;两组术后各时间段内haze分级分布比较，除1周时两组haze程度差异无统计学差异外(P,0.05)，其余时间段差异均有统计学意义。见表2。表2 Haze等级分布表 2. 1.3 光镜检查基质角膜细胞数量 正常对照组角膜浅层1/4基质细胞数目为(89.3?8.6)个。术后1 d，MMC组和BSS组浅层角膜细胞较正常对照组均下降，且MMC组下降较BSS组明显，两组差异具有统计学意义(P,0.05);术后1周，MMC组和BSS组浅层角膜基质细胞均较术后1 d时增多，但仍低于正常对照组，MMC组角膜基质细胞数量低于BSS组，两组差异具有统计学意义(P,0.05);术后4周，BSS组角膜基质细胞数目继续增多，并超过正常对照组，两组差异具有统计学意义(P,0.05)，MMC组增长不明显，仍低于正常对照组，与BSS组的差异具有统计学意义(P,0.05);术后12周，MMC组角膜基质细胞数目轻度增多，仍低于正常对照组，BSS组角膜基质细胞数目减少，基本与正常对照相 等，MMC组与BSS组差异仍具有统计学意义(P,0.05)，见表3。表3 BSS组、MMC组术后不同时间角膜前1/4 基质内平均细胞数量对比 2. 1.4 免疫组化结果 免疫组化染色发现正常对照组角膜上皮及基质内角膜细胞均有极少量TGF β2表达;术后4 h，BSS组、MMC组均见TGF β2表达增多;术后1周，BSS组、MMC组均见TGF β2表达较术后4 h增多，BSS组表达较MMC组表达强烈;术后4周，BSS组TGF β2无明显变化，MMC组表达较1周时轻度降低;术后12周，BSS组TGF β2同术后4周，MMC组TGF β2表达再次降低，见图1。 3 讨论 虽然LASIK目前仍为角膜屈光手术的主流术式,,,，但由于角膜瓣所引起的并发症以及继发性圆锥角膜严重威胁眼的屈光功能和眼的完整性，以及不能应用于较薄的角膜,10,，使得角膜表面切削术得到再次重视。PRK是准分子激光角膜表面切削术的一种，是一种简单、安全和有效的治疗近视、远视和散光等屈光不正的方法,,，,,，但其最大的劣势在于产生haze和屈光回退，在治疗高度近视患者时更加明显,11,。已有研究表明在PRK术中应用MMC可以有效预防haze的发生,6,8,。 MMC是一种化疗药物，利用其可以调控瘢痕形成的作用，已广泛应用于青光眼滤过手术、翼状胬肉切除以及结膜、角膜上皮瘤的治疗,,,，,,,。其药理作用为通过抑制胸‎‎苷酸合成酶及与DNA双链交叉联结来阻碍DNA复制及RNA和胶原蛋白的合成，还可使DNA解聚。所以，可以抑制角膜上皮细胞、基质细胞、内 皮细胞、结膜细胞以及Tenon囊纤维细胞的增殖,,,,。 由于MMC具有细胞毒性，可以抑制角膜上皮细胞的增殖，有可能对PRK术后上皮的修复造成影响。本研究结果表明，与BSS组相比，MMC组的角膜上皮修复没有延迟，与有关报道一致,,,,。所以MMC对于角膜上皮的生长是安全的。 已有研究表明在PRK术中应用MMC可以有效预防haze的发生,,,,,。Tae im等,,,,在实验中观察到，术后早期，MMC组和对照组表现出相同程度的轻度haze，6周以后，对照组出现明显的haze，而MMC组haze仍旧较轻，12周对照组的haze情况仍较严重，而MMC组haze几乎消失。此结果与本研究基本一致。本研究中，术后1周MMC组和BSS组haze程度基本一致，差异无统计学意义;术后4周，BSS组haze明显加重，MMC组haze轻度加重，差异具有统计学意义;12周时 BSS组haze仍然较重，MMC组haze已经减轻，差异具有统计学意义。在另一项研究中，Tae im等,,,,利用紫外线照射PRK后角膜基质床的方法探索MMC对haze的抑制作用。紫外线可以穿透整个角膜，加重角膜基质的损害，延长角膜愈合的时间以及引发更严重的haze。结果发现，MMC可以很好的抑制haze的形成，同对照组相比，效果相当明显。总之，在PRK术中应用MMC确实可以有效预防haze的形成。 但MMC如何抑制haze的形成，其机制仍然不明,,,。随着角膜上皮的刮除，角膜细胞的调亡启动了角膜修复的过程,,,,。凋亡细胞激活周围的角膜细胞，使其增殖，填充到前基质层，在这个过程中，激活的角膜细胞可以转化为成纤维细胞和成肌纤维细胞,,,,。而成肌纤维细胞是影响角膜透明性的主要决定因素，也就是haze的影响因素。有研究表明MMC通过诱导角膜细胞凋亡减少PRK术后角膜细胞的数量来减轻haze和瘢痕的形成,,,,。本研究表明，MMC组确实减 少了PRK术后角膜细胞的数量，与BSS组相比，12周时仍少于正常。Tae im等,,,,在实验中同样观察到角膜细胞数量的显着减少。通过DAP染色，Tae im等发现PRK术后2周，MMC组出现严重的细胞凋亡，但随着时间延长，凋亡细胞逐渐减少，12周时反而低于对照组。Marcelo等,,,,也有相似的结论。这是由于MMC不但诱导角膜细胞凋亡，同时也诱导激活的角膜细胞凋亡引起。 已有研究表明，成肌纤维细胞的出现，是导致haze和屈光回退的主要因素,, ,，,,,。而TGF β2是促使角膜细胞分化为成肌纤维细胞的主要因素,,,,。成肌纤维细胞表达α 激动蛋白(α SMA)，可以将其进行化学标记，来证明成肌纤维细胞的存在。Tae im,,,,用此方法在研究PRK后角膜成肌纤维细胞的表达中发现，术后3周，所有手术后角膜均出现α SMA阳性细胞，未用MMC的对照组出现最多，全部位于上皮下和浅基质层中。术后12周，对照组角膜后部基质中也出现α SMA阳性细胞，而MMC组角膜后部基质没有出现，对照组α SMA阳性细胞远远多于MMC组，且α SMA阳性细胞数目与haze的严重程度成正相关。Sonal等,,,,在利用RT PCR研究PRK术后多种因子在角膜基质中的表达时发现，TGF β2的mRNA的变化最大。正常角膜仅有少量的TGF β2mRNA表达，但在术后21 d，TGF β2 mRNA表达比基线数量增加300倍，此后有所下降，但在90 d时，表达仍然高于基线水平。TGF β2受体mRNA表达情况与TGF β2 mRNA表达相似。说明TGF β2在PRK术后角膜的修复过程中发挥着重要作用。以上研究结果也验证了本研究TGF β2免疫组化的发现。通过染色结果很清楚的看到，BSS组中TGF β2在术后1周大量表达，较MMC组表达强烈;术后‎‎4周，BSS组TGF β2无明显变化，MMC组表达较1周时轻度降低;术后12周，BSS组TGF β2同术后4周，MMC组TGF β2表达再次降低。与TGF β2 mRNA的变化相一致。所以MMC抑制haze的机制之一可能为: MMC抑制了TGF β2的表达，继而减少了角膜细胞转化为肌成纤维细胞的可能，使肌成纤维细胞数目降低，从而haze减轻。 但MMC怎样抑制了TGF β2的表达，是诱导角膜细胞凋亡引起，还是其他途径，需要进一步研究。MMC的毒性作用，如导致角膜内皮细胞的凋亡，过高的浓度和作用时间会使培养的人角膜细胞死亡等,,,,已有报道，所以怎样选择合适浓度的MMC以及作用的时长是我们需要考虑的问题。并且还需要进一步研究MMC对角膜的生物作用，理解其全部机制，有助于选择更佳的手段预防haze的产生，使准分子激光表面切削术成为完美的术式。 【参考文献】 ,,, Netto MV, Wilson SE. 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