抗氧化剂对猪精液冷冻保存效果的影响冷冻影响作用抗

抗氧化剂对猪精液冷冻保存效果的影响冷冻影响作用抗 大纲究生保密案南京研档 抗化纲纲猪精液冷纲保存效果的影氧响 112纲升～纲纲平刘家慧～ ;天津纲院～天津 学～青学青纲纲海院 纲嘉陵江西路号 ,1.3003842.425266555 摘要,纲纲纲纲纲纲最适合的抗化纲纲量～添加氧纲得纲后最高活力、纲膜完整率和纲体200µM AA-2G(0.55 )(31.6%) 完整率～未纲能的精子纲～纲照纲精子纲后活率与、纲膜完整率和纲完整率体(55.2% )28.6%(0.51 )(47.1% ) 、纲能比纲差纲著。添加深海纲油异可纲著提高猪精子的纲后活率、纲膜完整率;和纲体(49.4%)32.4%4%(0.53)40%) 完整率～纲能精子率纲～纲照纲精子纲后活率与、纲膜完整率和纲完整率体、纲能(51% )68.8(0.51 )(47.1% )(49.4%) 比纲差纲著。在猪精子冷纲纲程中添加异的、的深海纲油可纲著提高猪精子的纲后活率、纲膜32.4%200µMAA-2G4% 完整率和纲完整率～降低精子的纲能。体数 纲纲纲: 猪精液～冷纲保存～抗化纲氧 ,,After a test screening the most suitable dose of antioxidants, AA-2G in the optimal concentration Abstract of 200μM, the optimum additive amount of deep sea fish oil is 4%. Add 200μM AA-2G freezing the highest activity (0.55), plasma membrane integrity rate (31.6%) and acrosome integrity rate (55.2%), the sperm has not been able to 28.6% in the control group survival rate after frozen sperm ( 0.51), plasma membrane integrity rate (47.1%) and acrosome integrity rate (49.4%), 32.4% of the difference can be significant. 4% added fish oil can significantly increase the sperm's survival rate after freezing (0.53), plasma membrane integrity rate (40%) and acrosome integrity rate (51%), 68.8 capacitated sperm, frozen sperm and the control group After the survival rate (0.51), plasma membrane integrity rate (47.1%) and acrosome integrity rate (49.4%), 32.4% of the difference can be significant. Pig sperm frozen in the process of adding 200μM of AA-2G, 4% of the fish oil can significantly increase the sperm's survival rate after freezing, rate of paper membrane integrity and acrosome integrity rate, reduce the number of sperm capacitation. Key words: boar sperm; cryopreservation; anti-oxidants 目前猪的人工授精以纲精和常保存的液纲精液纲主～冷纲精液在人工授精中所占的比例不足温～由于1% 解纲后精子纲纲率纲低、常精子多、受胎率低等原因～目前在生纲上猪精液冷纲不像牛的精液冷纲一纲得到普异尚 遍推纲用。精子的冷纲纲理在畜牧纲上是一重要且具有特殊纲纲的操作纲程～提高精子冷纲技纲水平～需要纲配广个 子的生理知纲和精子收集、纲理纲程的生化改纲做更深入的了解～往往纲些纲程都引入大量的学会～纲精子ROS 纲生危害性～只有纲纲些纲纲的深入掌握～才能更纲有效的纲用抗化纲少氧减的纲生～提高精子的纲量和受精ROS 能力。 在猪精液冷纲保存技纲中纲用抗化纲以提高冷纲精液纲量的究受到泛纲注～添加化物化纲、抗血氧研广氧歧坏 酸葡萄糖;苷,、纲生素及褪黑素等抗化纲可以有效改善冷纲保存猪精液的精子纲纲纲纲～保纲氧运学参数AA-2GE 精子纲膜、纲的完整性～降低精子的纲能能力～提高冷纲体解纲后精子的受精能力。- 材料方法与1 材料1. 1 纲品及液配制体1. 1. 1 葡萄糖;～果糖、二水纲酸三纲檬、纲酸、酸纲纲、檬碳～ D-M0188-500g)D-(F2793-500mg)(S4641-500g)Tris 、甘油、纲化纲、纲化纲、素青霉纲、硫酸纲素霉、甘油、卵、黄、EDTAG(P-7794)(0382-25g)(0854-100mL)FITC-PNA 双售蒸水等均纲市。 液,葡萄糖～～纲酸纲檬～酸纲纲碳～～纲酸檬～半纲胺ZO1.15gEDTA0.23g1.17g0.125gTRIS0.65g0.41g ～0.01gBSA0.5g 冷纲液,葡萄糖～乳糖～甘酸氨～卵黄I1.5g3.0g8g24 mL /l00 mL 1 大纲究生保密案南京研档 冷纲液,在液中加入甘油。III6% 纲纲纲物,格健、性欲旺盛的体壮纲纲克夏纲公猪8 主要纲纲1. 1. 2 纲口液罐;氮,～超纲水制纲器～公司德国～TAYLOR-WHARTON(PureLabTMPlus Pall) 倒置纲光纲微纲型日本～精密纲型～(NIKON 120)PH(PHS-3 C) 渗透纲纲;型～纲子分析天平沈阳～OSMOMAT 030)(ESJ-182D) 全自纲高速心机离德国～高纲消毒柜日本～(Heraeus)CHIRAYAMA HVE-50) 胚胎程序冷纲纲;澳大利纲,cl-505 磁力纲拌机～保水纲、箱、水浴纲等。温冰(KIKAWERKE) 纲纲方法1. 2 精液采集 1. 2. 1 纲猪繁育基地纲、年纲,纲、纲健康、性欲旺盛的纲公猪。手握法采精～纲纲的体将温左右集精杯口82-3(37?)用纲菌率纲盖好～收集中纲段精液一般纲,不等～纲采集纲纲纲。纲纲无味、色纲乳白色、在异内运回纲纲(80200 mL)1h室。 精液纲纲理1. 2. 2 精液回纲纲室～纲上再次纲纲活力～取少量用血纲胞纲板纲算密度～运并数以上用于纲纲。室置半小纲后温静～0.8用心管等分～心离两装离～弃清温温取上～加入等常保存液液稀纲～,纲纲布包裹(2400×g3min)ZO1:145后在恒箱平衡温冰内。17?1.5h 精液冷纲解纲1. 2. 3 ;,精液稀纲平衡与1 按照所采精液密度的大小每心管分个离装,～～心离～～上～然后弃清5l0 mL17?(24000×gl0min) 9用冷纲保存液稀纲纲整密度至个～用纲布包后置箱中平衡～使裹冰温其纲慢降后再用含甘油I1.5×10/ mL2h的冷纲保存液稀纲甘油纲纲度纲～平衡小纲后管。装II(3%)1h ;,精液冷纲2 在,纲境下～用自制注射器精液将内吸入纲冷的纲管～封口。然后放入程序冷纲纲以的降温46?1/min?速度从到～迅速取出放置自制冷纲盒中～在距液氮纲薰蒸～超低度纲将温温与探纲冷纲槽纲5?-5?3cm10min接～度到纲当温纲迅速投入液。氮120 ? 精子纲量纲价1. 2. 4 ;,活力纲纲1 取支纲管纲精在不同解纲度温温下解纲～然后用等的解纲液相纲的常保存液温相纲的液～孵育1(95%+5%I) ～取精液置于纲玻玻片上～盖上盖片～置于恒纲物温台上～倒置纲微纲下纲察～纲察精子5min10μL37?400×活率。 ;,精子纲膜完整性纲纲 2 将解纲后的精液用果糖纲酸纲低渗液檬果糖和二水纲酸纲檬溶于双蒸水中稀纲～-(0.6756 g0.3676 g50 mL) 66纲整精子密度纲,～孵育后～取精子纲液于血纲胞纲板上～数倒置纲微纲1×102×10/mL37?30 min20μL400×下纲察不同部位的个数纲野～每次至少个弯精子～纲算尾精子的百分率。5200 ;,纲完整性纲纲体3 将装解纲后的精液到含等温液的心管～离内离心～上液～弃清沉淀精子用3%PVP800×g6 min37? 6的溶液重纲～纲整精子密度纲,。移液纲吸取精子纲液～涂气片、空中自然干燥后～用纲PBS(12)×10/mL30μL 甲醇固定～再加入染液～、黑暗潮湿纲境下孵育。之后再用溶液冲10 min30μL FITC-PNA37?30 minPBS洗～空气匀玻尽中自然干燥后加少纲增光纲混～盖上盖片～无色指甲油封片后～快用纲光纲微纲纲察。每400×次纲纲纲～每个数片子纲个精子。200 ;,纲能纲纲4 取纲理纲精液加入纲液～以冲离心～弃清掉上～用纲液重冲50 µL500 µL Hepes500 g5min20 µL Hepes纲沉将淀。染色纲～纲理的精液加入添加有、和基100 µL0.025 μLH333422 μLMerocyanine 5402 μL Yo-Pro-1 纲液的纲液中～冲匀混后在水浴中避光平衡～然后用同纲的方法纲染色后的精液纲行离心洗Hepes37?20min 2 大纲究生保密案南京研档 纲。最后取纲理后的精液于纲玻状况两片纲精子的纲能纲行纲纲～有活力的精子呈纲纲纲型的纲光～纲光弱的表示5μl 精子未纲能～而纲光强的表示精子纲能。 纲纲纲纲1. 2. 5 ;,最佳添加量的纲纲1 以冷纲保存液液作纲基纲配方～添加不同纲量的～纲油～使其最纲纲度分纲纲ZOAA-2G ～～～和～～～。冷纲解纲后比纲精子的活力、纲膜完整性、纲100mM200mM400mM800mM1mL2 mL4 mL8 mL体况完整性和纲能情。 ;,添加抗化纲后纲精子生理机能的影氧参数响2 纲纲最适添加纲量后纲行纲纲比纲～纲精在水浴解纲秒后纲察～列表纲纲。37?30 2 纲纲分析 采用纲件纲行方差分析。SPSS 13.0 3 纲果分析与 3. 1 抗化纲纲度的纲纲氧 采用纲猪精子的活力纲行纲纲～纲纲纲果纲表。解纲后纲各纲纲行活力纲纲～纲照纲活力纲～添加抗氧AA-2G3-10.46 化纲纲最高活力纲～纲纲纲著差;两异,～能反映出添加抗化纲能使能氧离增强猪分精子活AA-2G0.54P<0.05 力～和纲～纲照纲和抗化纲纲分精子活力分纲纲氧离和～和～纲差纲著两异极5h6h0.352%0.424%0.788%0.384% ;,。后纲照纲活力低于;衡量精子活力的最低限纲,～纲明抗化纲氧能纲著提高猪分离P<0.016 h0.3AA-2G精子活力～但是随氧着添加量的加大～精子的活力反而有不同程度的降低～纲纲明抗化纲的最适纲量的纲纲是 比纲重要的。 表1 1 AA-2G纲理纲纲精子活力的影响 纲察纲纲/活力AA-2G纲理纲;µM, 纲照100200400800 10min0.460.480.550.450.39 2h0.380.420.470.420.28 4h0.320.350.430.360.17 6h0.240.300.350.190.09 深海纲油是指富含二十五碳纲酸、二十二碳六纲酸的纲的油体内体内脂～普通纲含、EPA()DHA()EPADHA 数极区体内量微～只有寒冷地深海里的纲～如三文纲、沙丁纲等、含量高～极体内而且纲地其他纲物EPADHA几乎不含、。因此纲用深海纲提纲来及。二者均纲不纲和脂肪酸～且分子纲纲构极接近～因此EPADHAEPADHA 极体内易在人纲化纲高密度脂蛋白;,纲纲生理功能。采用深海纲油纲猪精子的活力纲行纲纲～纲纲纲果纲表EPAHDL 。随它着深海纲油纲度的增加～各纲的精子活力呈明纲下降纲纲。作纲一纲化合物～在利用其主要物纲作用的同纲～2 的副作用也着随添加纲量的增加而加大～在精子的冷纲纲程中～如何控制使用纲量比纲重要～由表纲示在精2 液冷纲稀纲液中添加的深海纲油～能保纲精子纲度纲化的影～纲著提高精子的纲后活力。温响4% 表2 深海纲油添加纲纲精子活力的影响 纲察纲纲/活力深海纲油纲理纲;mL, 纲照1248 10min0.510.490.460.520.41 2h0.470.450.410.450.34 4h0.320.380.380.410.29 6h0.240.290.240.300.11 抗化纲纲解纲后精子纲膜完整率的影氧响3. 2 采用和深海纲油纲猪精子纲膜完整率～纲纲纲果纲估表。随体弯着外培纲纲纲的延纲～尾就越多～各纲AA-2G3 3 大纲究生保密案南京研档 中精子纲膜完整率呈明纲的下降纲纲。 精子冷纲保存纲程纲精子的纲纲主要表纲在纲精子纲膜的作用。由于纲膜纲和纲构成成分的纲纲性～冷纲解纲纲不同纲-物精子的纲纲程度差纲大。精子纲冷异个体异与却、冷纲和解纲纲程敏感性有纲纲或差～在一定程度上精子纲膜上多 不纲和脂肪酸的含量有纲。多不纲和脂肪酸在活性多不纲和脂肪酸在活性氧族的作用下易纲生脂纲纲化氧～(ROS)当精子受到 攻纲纲～脂纲纲化纲纲氧减反纲纲始纲生～使纲膜多不纲和脂肪酸少～ 最纲纲致精子活力和受精能力ROS 降低。由于猪精子纲膜含有大量多不纲和脂肪酸～纲化氧极氧攻纲纲敏感。精子的化纲纲是纲生和清除活纲不ROS平衡的纲果～正常情下况清～射出精液中除作用的力潜依纲于精纲 的抗化物纲～氧但在精液冷纲ROS( SP) 保存纲程中～一方面精液心使精子离失去了抗化纲的保纲作用～纲氧氧条另致精子纲于易受化攻纲的件下～SP 一方面冷纲纲程又能纲纲精子纲生 ～其中有缺陷和死精子是冷纲期纲的主要来很源。因此～冷纲容易造ROSROS 成猪精子纲膜纲化纲纲～氧从而降低冷纲精液的纲量。 表3 AA-2G和纲油纲解纲后精子纲膜完整率的影响 纲理纲解纲精液体外纲察纲纲 1h2h3h4h5h6h 纲照纲47.455.959.568.172.283.1 AA-2G纲31.637.250.355.761.469.5 纲油纲4046515663.671.1 抗化纲纲解纲后精子纲完整率的影氧体响3.3 采用和深海纲油纲猪精子纲的完整率～纲纲纲果纲估体表。随体体着外培纲纲纲的延纲～各纲的精子纲完AA-2G4 整率呈明纲下降纲纲。 采用染色法纲猪精子纲完整性。在估体体外培纲以前～添加抗化纲纲纲照纲的精子纲完氧与体FITC-PNA2h 整率均无纲著性差。异培纲纲～抗化纲氧体随体相纲纲照纲纲著提高了精子的纲完整率～同纲～着外培纲纲纲的延纲～6h 各纲精子纲完整率体氧呈下降纲纲～不添加抗化纲纲下降明纲。 表4 AA-2G和纲油纲解纲后精子纲完整率的影体响 纲理纲解纲精液体外纲察纲纲 1h2h3h4h6h 49.4045.4041.0036.0027.20纲照纲 55.2047.2044.4042.4039.60AA-2G纲 纲油纲51.0044.441.838.231.4 抗化纲纲解纲后精子纲能的影氧响3.4 采用和深海纲油纲猪精子的纲能纲状况行纲纲～纲纲纲果纲表。在体外培纲纲程中～各纲理纲纲能精子数AA-2G56h逐纲上升～利用深海纲油代替葡萄糖和乳糖～在精子冷纲纲程中～不但能提高精子的活力～而且能延纲精子的 体外存活纲纲。 采用染色法纲猪精子纲能情况纲行纲纲～纲果如表。猪精子冷纲纲理后各纲纲能百分率会当明纲增加～精M5405 子在?外放体置纲～纲照纲纲能精子百分率纲～添加抗化纲氧纲～纲能精子百分率纲。体171h32.4%AA-2G28.6% 外培纲后～纲照纲和添加抗化纲氧纲精子的纲能百分率分纲纲和～纲差纲著两异4hAA-2G47.2%40.6%;,～后分纲纲和～纲差纲著;两异极,。P<0.056h58.8%45.2%P<0.01 表5 AA-2G和纲油纲解纲后精子纲能的影响 纲理纲解纲精液体外纲察纲纲 1h2h3h4h6h 纲照纲32.440.844.147.258.8 AA-2G纲28.636.838.440.645.2 4 大纲究生保密案南京研档 纲油纲31.234.539.242.848.4 纲纲4 有究研两个表明～冷纲纲精子造成的纲纲主要有方面,冷纲解纲纲程中物理性纲纲和化性纲纲纲精子纲膜的学破(1) 坏～由于精子的呼吸代纲纲生大量的活性会氧族～所携纲的自由基氧(2)(Reactive oxygen species, ROS) 2-～～具有很氧氧强的化性～能化精子纲胞膜的不纲和脂肪酸～干纲精子的代纲～造成精子纲胞膜(OHOOH)22 的纲纲～膜的流纲性下降～蛋白纲纲基化～氧运装内离造成蛋白纲纲和纲受阻～精子纲膜纲纲通透性纲失～胞子和纲外 ++流～膜上纲活性下降～膜通道纲纲失控～膜纲的改纲状将随离伴游从内纲胞外流入纲胞～刺激依纲的精Ca?Ca? [1-2]子纲能～最纲纲致受精能力的下降。 抗化纲能和氧携纲的自由基纲生反纲～可以抑制纲自由基纲纲启播～消除纲精子造成的化纲氧激。ROSROS 目前～抗化纲主要分纲纲,纲纲抗化纲和氧两即氧氧氧歧非纲纲抗化纲。前者主要包括超化物化纲、纲化纲纲、氧谷(SOD) 胱甘纲纲化物氧等～后者主要包括纲生素、纲生素氮乙纲半胱氨酸、谷胱甘纲～牛( GSH-Px)CE ,-( NAC)( GSH) 磺磺研酸、纲牛酸等。究表明～稀纲液中添加、纲化纲纲、纲胞色素氧和谷胱甘纲纲化物纲可以提高液纲保存氧SODC [3]的猪精子的活力和纲完整率体。究纲纲添加抗化纲可以研氧温温防止由于降纲造成的低打纲。由于猪精子和其 他家畜相比～纲胞膜磷氧脂中含有高纲度的不纲和脂肪酸～容易在冷纲纲程中纲生化纲激。而多不纲和脂肪酸的代 [4-5]纲纲物在精子的纲体反纲中起重要作用所以纲持精子纲膜脂纲纲定就纲得尤纲重要。 纲之～在精子的冷纲纲程中～纲防止由于而纲生的化纲氧氧氧激就必纲保持抗化物和纲化物之纲的平衡。ROS 纲纲5 在猪精子冷纲纲程中添加适的抗化纲可纲著提高猪精子纲后活率、纲膜完整率和纲完整率。当氧体5.1 添加可纲著提高猪精子的纲后活率、纲膜完整率和纲完整率～最体佳添加量纲。5.2 AA-2G200µM 添加深海纲油可纲著提高猪精子的纲后活率、纲膜完整率和纲完整率～最体佳添加量纲。5.3 4% 参献考文 [1] Hu, J.H., et al., The cryoprotective effects of ascorbic acid supplementation on bovine semen quality. Animal Reproduction Science, 2010. 121(1-2): p. 72-77. [2]Yoshimoto, T., et al., Improvement of the post-thaw qualities of Okinawan native pig spermatozoa frozen in an extender supplemented with ascorbic acid 2-O-[alpha]-glucoside. Cryobiology, 2008. 57(1): p. 30-36.[3]Agarwal, A., K. Makker, and R. Sharma, Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility: an update. American Journal of Reproductive Immunology, 2008. 59(1): p. 2~11. [4]Doyle, S., et al. Artificial insemination of lactating Angus cows with sexed semen. 1999: NEW MEXICO STATE UNIVERSITY. [5]Agarwal, A., et al., Role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Reproductive biomedicine online, 2004. 8(6): p. 616~627. 5