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碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用及机制的研究(可编辑)

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碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用及机制的研究(可编辑)碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用及机制的研究(可编辑) 碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用 及机制的研究 分类号 密级 国际十进分类号(UDC)第四军医大学学位论文碱性成纤维细胞因子对根尖牙 乳头干细胞 生物学作用及机制研究 (题名和副题名) 吴家媛 (作者姓名) 指导教师姓名 牛忠英 教授倪龙兴 教授 指导教师单位 第四军医大学口腔医院牙体牙髓科 申请学位级别 专业名称 博士 口腔临床医学(口内) 论文提交日期 答辩日期 2011.04 2011.05 论文起止时间 ...
碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用及机制的研究(可编辑)
碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用及机制的研究(可编辑) 碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用 及机制的研究 分类号 密级 国际十进分类号(UDC)第四军医大学学位论文碱性成纤维细胞因子对根尖牙 乳头干细胞 生物学作用及机制研究 (名和副题名) 吴家媛 (作者姓名) 指导教师姓名 牛忠英 教授倪龙兴 教授 指导教师单位 第四军医大学口腔医院牙体牙髓科 申请学位级别 专业名称 博士 口腔临床医学(口内) 论文提交日期 答辩日期 2011.04 2011.05 论文起止时间 2008年 09月至 2011年 04月 学位授予单位 第四军医大学独 独 创 创 性 性 声 声 明 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文 中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过 的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。论文作者签名: 日期: 保 保 护 护 知 知 识 识 产 产 权 权 声 声 明 明本人完全了解第四军 即:研究生在 医大学有关保护知识产权的规定, 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采 用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅, 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中 国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》,同意按 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。 论 文作者签名:导师签名: 日期: 碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞 生物学作用及机制研究研 究 生:吴家媛 学科专业:口腔临床医学(口腔内科学) 所在单位:第四军医大学口腔医院 导 师:牛忠英 教 授(主任医师) 倪龙兴 教 授(主任医师) 辅导教师:何文喜 副教授(副主任医师)资助基金项目:“十一五” 国家科 技支撑课题(2007BAI18B01) 全医药卫生科研基金课题 06MA236军队十一五攻关课08G104 关键词: 根尖牙乳头干细胞;碱性成纤维细胞因子;细胞增殖; 细胞分化;干细胞干性;成骨/成牙本质; MAPKs 信号通路 中国人民解放军第四军医大学 二 O 一一年四月第四军医大学博士学位论文 目 录 缩略语表1 中文摘要3 英文摘要6 言 10 前 文献回顾 14 一、根尖牙乳头干细胞在牙组织工程中的重要作用及其研究现状..14 二、碱性成纤维细胞因子对牙间充质细胞生物学作用研究进展24 正 文 34 第一部分:人根尖牙乳头干细胞的分离、培养、鉴定34 实验一、人根尖牙乳头干细胞分离及培养34 实验二、根尖牙乳头干细胞的初步鉴定.41 第二部分:碱性成纤维细胞因子对SCAP干细胞干性影响的实验研究45 实验一、碱性成纤维细胞因子对SCAP增殖能力的影响..46 实验二、碱性成纤维细胞因子对SCAP体外成骨/成牙本质分化能力的影响 53 实验三、碱性成纤维细胞因子对SCAP 成脂分化能力的影响..64 实验四、碱性成纤维细胞因子对SCAP干细胞基因及STRO-1 表达的影响..69 第三部分:碱性成纤维细胞因子对SCAP作用机制的初步研究78 实验一、碱性成纤维细胞因子对SCAP作用中MAPKs信号通路的研究.78 实验二、MAPKs信号通路在碱性成纤维细胞因子调控SCAP分化过程中的作 用..85 全文总结 92 参考文献 94 附 录. 103 和研究成果. 107 致 谢. 108第四军医大学博士学位论文 缩略语表 缩略词 英 文 全 称 中文全称 ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 bFGF basic fibroblast growth factor 碱性成纤维细胞因子 BSP bone sialoprotein 骨涎蛋白 BMP Bone Morphogenetic Protein 骨形成蛋白 DMSO dimethylsulfoxide 二甲基亚砜 DSPP dentin sialophosphoprotein 牙本质涎磷蛋白 ECM extracellular matrix 细胞外基质 ERK extracellular signal-regulated kinase 胞外调节激酶 ES Cell Embryonic stem cells 胚胎干细胞 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 JNK c-jun amino-terminal kinase c-jun 氨基末端激酶 LSCM laser scanning confocal microscope 激光扫描共聚焦显微镜 MAPK miotge-nactivatedportenikniase 丝裂素活化蛋白激酶 MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphe 3-4,5-二甲基噻唑-2-2, nyl tetrazolium bromide 5-二苯基四氮唑溴盐 MSC mesenchymal stem cells 间充质干细胞 OCN osteocalcin 骨钙蛋白-1-第四军医大学博士学位论文 缩略词 英 文 全 称 中文全称 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 peroxisome proliferator activated 过氧化物酶体增殖 PPAR- γ2 receptor- γ2 物激活受体 PVDF polyvinylidene difluoride PVDF 膜 -PCR quantitative reverse transcription 实时定量逆转录多聚酶 qRT polymerase chain reaction 链式反应 p38 p38 kinase p38 激酶 SCAP Stem cells from the apical papilla 根尖牙乳头干细胞 SB203580 4-4-FluoorPhenyl-2-4-methylsulfinyl p38激酶抑制剂 Phenyl-5-4-pridyl-IH-imidazole SDS-PAGE Sodium dodeeylsulafte-polyacyrlmaidegel Smad3特异抑制剂 eleetorPhoersis SP600125 simulated microgravity JNK激酶特异性抑制剂 TBS Tris-buefferd saline Tris缓冲盐溶液 TGF- β transforming growth factor β 转化生长因子 β U0126 1,4-Diarnino-2,3-dieynao-l,4-bis MAPK kinase MEK l/2 o-aminop henylmecrpatobuatdiene 激酶特异性抑制剂-2-第四军医大学博 士学位论文 碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞 生物学作用及机制研究 博 士 研 究 生:吴家媛 导师:牛忠英 教授 倪龙兴 教授 第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科,西安 710032 中文摘要 根尖牙乳头干细胞(Stem cells from the apical papilla,SCAP)是位于 未发育完成恒牙根尖乳头的间充质干细胞mesenchymal stem cells, MSCs。 SCAP是一类具有成牙潜能的干细胞,具有比牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs更强的群体倍增能力、增殖能力、端粒酶活性及成牙本质潜 能。研究发现 SCAP 是根部成牙本质细胞的主要来源,对根部牙本质形成 发挥重要作用。 SCAP 独特的功能和特点决定了其不仅仅是一种研究牙根发 而且是一种很好的牙组织工程种 育时成牙本质细胞分化机制的体外细胞, 子细胞,可用于牙髓牙本质和生物学牙根的再生,具有良好且广阔的临床 应用前景。 牙根的发育形成是由一系列上皮和间充质信号的相互作用调控的。碱 性成纤维细胞因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)是纤维生长因 子 (?broblast growth factors, FGFs)家族的成员之一,在牙组织形态发生中 发 挥重要作用,并有效促进牙根的延长和牙周组织的形成。在小鼠磨牙牙根-3- 第四军医大学博士学位论文 形成的各个阶段,分化的成牙本质细胞均表达 bFGF,提示 bFGF 参与了牙 根形成的信号调控。bFGF 是一种多效性生长因子,参与细胞的增殖,分化 和迁移。同时也是维持人胚胎干(human embryonic stem,hES细胞自我更 新能力的重要因子。对成体干细胞,bFGF对不同分化阶段的细胞以及不同 间充质干细胞的生物学效应表现并不相同。文献报道 bFGF对牙髓干细胞的 作用可表现上调或降低 ALP 的活性;促进或抑制其成牙本质细胞分化。 SCAP是根部成牙本质细胞的来源,具有很强的成牙本质细胞分化潜能,而 bFGF 对 SCAP 的生物学作用如何,目前尚未见报道。 本研究采用体外培养的 SCAP为实验模型,研究 bFGF 对 SCAP增殖、 分化等生物学效应,从而明确 bFGF对 SCAP 增殖和分化的调控作用;进而 明确 bFGF对 SCAP干细胞干性(stemness)的影响;明确在 bFGF调控 SCAP 增殖分化中 MAPKs 信号通路是否发挥作用;这将为进一步研究 SCAP的生 物学特性、成牙本质细胞分化机制、牙髓牙本质再生及生物学牙根等组织 工程应用提供实验基础,同时为将来 SCAP 应用于临床治疗提供新的思路 和途径。 根尖牙乳头干细胞的分离、培养、鉴定及多课题所取得的主要结果如下:1. 向分化能力检测 通过酶消化法原代培养根尖牙乳头细胞,利用有限稀释培养法成功分 离出根尖牙乳头干细胞克隆;采用成骨诱导、成脂诱导实验验证了根尖牙 乳头干细胞具备多向分化能力;采用免疫组织化学染色检测了根尖牙乳头 细胞中充质干细胞标志物 STRO-1,波形丝蛋白和 CD24 的表达;流式细胞 仪定量分析了根尖牙乳头干细胞的 STRO-1 阳性表达率。 2.碱性成纤维细胞因子提高根尖牙乳头干细胞干性 以体外培养的 SCAP 为靶细胞,研究了不同浓度 bFGF 对 SCAP 的促增 殖作用:MTT 比色法发现不同浓度 bFGF 可提高 SCAP 的细胞存活率,以 5,10,20ng/ml 浓度促增殖的效果显著;bFGF 可加速 SCAP 细胞周期进程; -4-第四军医大学博士学位论文 bFGF可提高 3,6,12代 SCAP细胞克隆形成率;bFGF 可明显降低 SCAP的 ALP 活性,抑制体外矿化结节形成, bFGF 对体外矿化诱导 1,2,4w 后 的 SCAP 可不同程度降低成牙本质标记基因 DSPP、ALP、OCN 和 BSP mRNA表达; bFGF 抑制 SCAP 细胞向成骨方向分化;而以 bFGF 预培养 1 w 后 SCAP 的成骨能力增加;bFGF 增加成脂诱导 3w SCAP 中 PPAR- γ2 mRNA表达; bFGF 可提高不同培养代数 SCAP中 STRO-1的阳性表达率及 干细胞基因 Nanog, Oct4, Sox2 及 Rex1的 mRNA表达,从而提高 SCAP的 干细胞特性及未分化潜能。 3.碱性成纤维细胞因子对根尖牙乳头干细胞生物学作用机制的初步探讨 bFGF可激活 MAPKs 信号通路,促进 SCAP中 p38、ERK、JNK通路磷 酸化蛋白的表达水平;在应用 p38、 ERK、 JNK通路的抑制剂阻断各通路后, bFGF 下调 SCAP 中 DSPP、ALP、OCN 和 BSP 表达的作用; 可部分逆转 bFGF分别联合 JNK、ERK和 p38通路抑制剂作用后,Nanog、Oct4和 Sox2 以 JNK通路抑制剂(SP600125) 的表达在各实验组呈现了不同程度的下调; 和 ERK 通路抑制剂(U0126)组较为明显。实验结果显示 MAPKs 信号通 路参与了 bFGF 对 SCAP 生物学作用的调控。 综上所述,本研究认为 bFGF 可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖;调控 细胞的分化能力从而增加 SCAP的干细胞干性(stemness)及未分化潜能; MAPKs 信号通路参与了 bFGF 对根尖牙乳头干细胞分化特性的调控。本实 验结果为进一步研究根尖牙乳头干细胞的生物学特性及分化机制提供了研 究基础;为进一步研究 bFGF 对根尖牙乳头干细胞的分化调控机制提供了研 究基础;同时为牙髓牙本质再生及生物学牙根的组织工程研究提供了新的 研究思路。 关键词:根尖牙乳头干细胞;碱性成纤维细胞因子;细胞增殖;细胞分化; 干细胞干性;成骨/成牙本质;MAPKs 通路 -5-第四军医大学博士学位论文 The Biological Effects of bFGF on Human Stem Cells from the Apical Papilla Candidate for doctor: Wu Jiayuan Supervisor: Niu Zhongying and Ni Longxing Department of Endodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China Abstract Introduction Stem cells from the apical papilla SCAP are a population of mesenchymal stem cells MSCs residing in the apical papilla of incompletely developed teeth. SCAP are a distinct source of potent dental stem/progenitor cells and appear to have a greater dentinogenic potential than dental pulp stem cells DPSCs. The distinction between dental pulp and apical papilla is that apical papilla is the precursor tissue of the radicular pulp. Recently, SCAP have been shown to possess the ability to regenerate vascularized human dental ulp-like tissues in emptied root canal space and produce new p dentin-like tissue on existing dentinal walls. These pieces of evidence support the hypothesis that SCAP may be the source of primary odontoblasts that are responsible for the formation of root dentin Tooth root formation is mediated through a series of epithelial- mesenchymal interactions regulated by several signaling pathways. Basic -6-第四军医大学博士学位论文 fibroblast growth factor bFGF is a member of FGFs, which plays an important role in morphogenesis and histogenesis of tooth and they effectively promote the tooth root elongation and periodontal tissue formation. More importantly, bFGF was observed in differentiating odontoblasts at the apical end of the tooth and in the furcation zone of the developing root at all the stages suggesting that bFGF may participate in the signaling network associated with root developmentbFGF is known an angiogenic and pleiotropic growth factor involved in the proliferation, differentiation and migration of numerous cell types. It is known bFGF is a critically important factor to maintain self renewal ability of human embryonic stem hES cells in cultures. For adult stem cells, the effects of bFGF on MSCs of different tissue origin are different. bFGF appears to exert differential effects on different cell types and the stage of differentiaton of cells may respond differently to bFGF as well. Some studies, however, have reported that bFGF can up-regulate or down-regulate the ALP activity, promote or supress the differentiation potential of DPSCs. However, the effects of bFGF on SCAP have not yet been reported. Thus, it is important to investigate the effects of bFGF on the biologic functions of SCAP in order to understand its regulatory role in this context The purpose of this study was to examine the effects of bFGF on the behavior of SCAP in terms of cell proliferation, differentiation potential, stemness, and whether MAPK was involved in the differentiation of SCAP by bFGF Main results 1. Isolation of SCAP and characterization of multipotent differentiation ability -7-第四军医大学博士学位论文 Human third molars with developing roots were collected due to orthodontic reasons. Procedures were performed according to the approval of the institutional review board and the informed consent of the patients. SCAP were isolated, cultured and expanded as previously described. Cells were collected and prepared for limiting dilution procedures to obtain single-colony-derived strains. Growth characteristics and multipotent differentiation of the cell were assessed 2. Biological effects of bFGF on SCAPDifferent concentration of bFGF all increased the proliferation of SCAP. The concentration of 5, 10 20ng/ml were significantly increased SCAP proliferation bFGF proceeded into the G2/S phase of SCAP. The numbers of CFU-F formation of SCAP at passages 3, 6 and 12 were increased with bFGF. In contrast, bFGF reduced the ALP activity and mineral nodule formation. bFGF down-regulated the expression of ALP, BSP, DSPP and OCN especially after SCAP cultured in osteo/dentinogenic medium for 2 week. SCAP pretreated with bFGF for 1 week can increase the ability of calcium deposition. bFGF up-regulated the expression of PPAR- γ2 after 3 weeks of adipogenic inducedRegardless of the passage numbers, bFGF increased the percentage of STRO-1+ cells signi?cantly and increased the expression levels of pluripotent gene Oct4, Nanog, Sox2 and Rex1 expression levels. These results indicated bFGF can increase the stemness of SCAP3. The mechanism of biological effects of bFGF on SCAP differentiation and remain stemness After SCAP treated with bFGF for different time, the phosphorylation of JNK, P38 and ERK were determined by Western blot assay. bFGF can induced phos-JNK, phos-ERK and phos-p38 expression -8-第四军医大学博士学位论文The inhibitors U0126, SP600125 or SB203580 can partly withdraw the suppression of bFGF on the expression of DSPP, BSP and OCN in SCAP, which were cultured in mineralization differentiation media for 1 week. After treated with SP600125,U0126 and SB203580 respectively, SCAP were cultured in standard medium with or without the presence of bFGF for 6 days. The inhibitors only could be partially withdraw the effect of bFGF, Nanog, Oct4 and Sox2 decreased but Rex1 not. ERK and JNKpathway play an important role in the effect of bFGF to SCAP Conclussions In summary, our results suggest that bFGF enhanced the stemness of SCAP evidenced by the increased proliferation, CFU-F forming capacity, and expression of STRO-1, Nanog, Sox2, Oct4 and Rex1, while bFGF suppressed ALPase activity, calci?ed nodule formation and osteo/dentinogenic differentiation. MAPKs pathway take part in the effects of bFGF on the biologic functions of SCAP. Therefore, in this system, bFGF appears to function as a factor to maintain SCAP stemness, by enhancing self-renewal ability and preventing cell differentiation. This will facilitate the long-term usage of these cells for various tissue regeneration applications including pulp/dentin regeneration, bioroot formation and even for neural tissue regeneration Key words:Stem cells from the apical papilla, Basic fibroblast growth factor, cell differentiation, cell proliferation, stemness, osteo/dentinogenesis, MAPKs signaling pathway-9-第四军医大学博士学 位论文 前 言 牙本质将牙髓与外界有害刺激隔离,一旦牙本质的完整性受到破坏, 牙髓受到感染,常需将牙髓去除,昀终可能会导致牙齿丧失;牙根在发育 过程中牙髓受到感染或损伤通常会导致牙根发育停滞,根尖孔不闭合,或 根长过短,传统的处理方法是根尖诱导成形术,然而据文献报道这样的治 而不是牙本质的再生,并不能增加根管的 疗通常只在根尖形成了钙化桥, [1, 2] 。因此牙髓治疗学以及未发育完成恒牙的根尖诱导成形的终 内径和长度 [3] 极目标是牙髓-牙本质复合体再生 ,这同时也是牙组织工程的理想目标。 许多学者进行了尝试,他们将牙组织来源的干细胞接种至生物材料在体内 [4] 体外尽管也观察到了类似牙髓的组织形成,但并没有形成牙本质 。将人 牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs)接种至牙本质的表面, [5] 也只是观察到了少量不连贯的牙本质样矿化物质的形成 。 根尖牙乳头位于发育中的恒牙根尖的软组织中,根尖牙乳头干细胞 stem cells from the apical papilla,SCAP存在于牙髓和根尖乳头之间的 细胞 [6] 丰富区 。作为一种独特的干细胞,SCAP来源于发展中的组织,具有早期 干细胞或前体细胞的特性。研究发现SCAP具有比DPSCs更强的群体倍增 [6, 7] 率,增殖率,端粒酶活性以及细胞迁移率 。同其他来源的间充质干细胞 [7] 一样, SCAP具有成骨、成脂、成牙本质,成神经等多向分化的潜能 。 SCAP 与牙髓细胞本质的区别是其为根部牙髓的前体组织,是根部成牙本质细胞 的来源,负责根部牙本质的形成,具有使牙根继续形成的潜能。研究认为 SCAP在牙根发育中发挥重要作用:移去正在发育中小型猪磨牙单个牙根的 [8] ,数月后发现该根停止了发育而其他牙根正常发育 。一些临 根尖牙乳头 床报道发现,在牙髓严重感染甚至坏死崩解伴根尖周感染的年轻恒牙病例 -10-第四军医大学博士学位论文 , , [9 10 11] 中,去除了牙髓组织及控制了炎症后牙根依然能够继续发育 。学者 们推测维持牙根继续发育的干细胞来源于根尖牙乳头,SCAP在根尖感染的 状态下仍保持活力,去除感染后,SCAP继续分化增殖,完成牙根的继续发 [8] 育 。在组织工程应用中,将SCAP接种到类牙根形状的HA/TCP支架中,在 支架的外部由包含 PDLSCs 的明胶海绵包裹,将其植入拔除了下切牙后的 [7] 小型猪牙槽窝,形成的生物学牙根可支持人工牙冠并在口腔内行使功能 。 [3] Huang等 将SCAP和DPSCs分别与支架复合接种至一端以MTA封闭的人牙 根管内,植入裸鼠皮下,3个月后根管内充满了伴有血管的牙髓样组织, SCAP组根管内牙本质壁和MTA表面可见厚度均匀一致的新生牙本质样组 织,而DPSC组中仅形成了少量不连续的牙本质样组织。研究结果提示SCAP 是一种很好的牙组织工程种子细胞,不仅可以用于研究成牙本质细胞分化 机制及牙根形成发育机制,也可用于牙髓牙本质再生及生物学牙根再生的 研究,具有广阔及良好的临床应用前景。 众所周知牙的发育是上皮间充质相互作用结果,被一系列细胞信号所调 [12] 控,这些信号包括FGF,SHH以及Wnt等 。bFGF是FGF超家族中的一员, 是在细胞生长、分化、凋亡和机体多种组织和器官形态发生中起重要调控 作用的细胞因子,不仅可诱导来自中胚层和神经外胚层细胞的有丝分裂, 还参与胚胎生长发育、器官形成、肿瘤发生及转移、血管新生、神经营养, [13] 组织损伤修复等 。在牙齿发育过程中,组织学和细胞学研究证实,bFGF [14] 及其受体在牙髓细胞、成牙本质细胞,成纤维细胞和SCAP内均有表达 , 提示bFGF能够调节牙齿的发生和成熟, 参与了牙齿发育调控,在牙齿的形 [15] 态及组织发生中发挥重要的作用,可促进牙根的延长和牙周组织的形成 。 在牙囊顶端分化的成牙本质细胞中以及在牙根发育所有阶段的分叉区域中 [16] 均可观察到bFGF,提示bFGF 参与了牙根发育的信号网络 。牙发生发育 [17] 各阶段如果bFGF的表达发生变化,可引起牙发育异常 。bFGF在鼠上下颌 [18] 磨牙牙根发育阶段的大部分细胞中均有表达 。 bFGF也是牙体硬组织、-11- 第四军医大学博士学位论文 牙髓及牙周组织发育及损伤修复的重要细胞因子。人牙本质基质和牙髓成 纤维细胞中包含bFGF,在细菌,化学和机械刺激等条件下,bFGF可从人牙 本质基质和牙髓组织中释放,参与创伤愈合和牙本质牙髓复合体的修复 [18,19,20] 。[14] 作为一种多效因子, bFGF参与了大部分细胞的增殖,分化和迁移 。 对于成体干细胞,bFGF 对不同来源的MSC 显示出不同的生物学作用。细 胞的不同来源,细胞的分化状态、细胞生长条件及有无其他生长因子的存 ,均会影响bFGF对靶细胞的生物学作用。文献报道bFGF 增强人 在等条件 [21,22,23] 的增殖和促进其成骨及成软骨方向分化 ,并维持MSC的多向分 MSC [24,25] 化潜能 。 bFGF可强烈诱导未发育完成的成年鼠切牙牙髓细胞的DSP [25] 及BSP的mRNAs表达 。 bFGF也可降低人牙髓细胞的ALP 活性,抑制其 [26] 成骨分化 。 bFGF在促进抑制鼠脂肪来源的基质细胞增殖的同时抑制其 [27] 成骨分化,维持其成骨分化的潜能 。然而,一些文献报道bFGF 可促进 [28] 人牙髓干细胞ALP活性,并呈时间依赖性 。bFGF还可增强细胞的矿化能 [29] 力以及上调成牙本质细胞标记基因的表达 。bFGF还被认为是组织再生的 [30] 有效因子。 bFGF 是培养的神经细胞前体的有效分裂原 ,是维持胚胎干 [ 31 ] 细胞自我更新能力的重要因子 。通常认为 bFGF是以激动 Ras-Raf-MEK-MAPK-c-myc信号途径参与调控细胞增殖的, bFGF结合FGFR [32] 后激活ERK, p38 MAPK通路调节成骨细胞中相关成骨基因的表达 。而关 于bFGF维持干细胞未分化特性及保持分化潜能的机制目前还不是很清楚。 [33 ] Ahn 等报道JNK信号通路参与了FGF2 维持hMSCs的分化潜能作用 。 等推论bFGF 控制兔MSCs干细胞特性是由于FGF, Wnt和TGF- β 信Wang 号 通路中存在交互网络,bFGF通过直接或间接影响TGF- β或其他的通路,调 [34] 控兔MSCs自我更新 。 bFGF对SCAP的生物学作用是怎样的?对SCAP生 长和分化的调控作用中,MAPKs通路是否也参与其中?目前国内外尚无报 道。 -12-第四军医大学博士学位论文本课题旨在:研究体外培养环境中 bFGF 对 SCAP 的生物学作用;明 确 bFGF是否具有调控 SCAP分化及维持 SCAP 的 stemness的生物学作用; 初步探讨 MAPKs信号通路是否在 bFGF调控 SCAP增殖分化中否发挥作用。 为 SCAP的生物学特性研究及成牙本质细胞分化机制的研究提供研究基础, 同时为牙髓、牙本质再生及生物学牙根的组织工程研究提供研究基础和思 路;此外,也会对研究 bFGF 与其他牙源性干细胞的生物学作用有所启示。 -13-第四军医大学博士学位论文 文献回顾 一、根尖牙乳头干细胞在牙组织工程中的重要作 用及其研究现状 依据组织的来源不同,牙源性间充质干细胞包括牙髓干细胞postnatal [35] dental pulp stem cells, DPSCs ,乳牙牙髓干细胞stem cells from exfoliated [36] deciduous teeth ,SHED ,牙周膜干细胞periodontal ligament stem cells, [37] [38] 牙囊细胞dental follicle precursor cells,DFPCs 。牙源性间 DLSCs , 充质干细胞与其他来源的间充质干细胞Mesenchymal stem cells,MSCs一 ,具有多向分化潜能,牙源性间充质干细胞的发现为牙髓修复,牙齿再生 样 [7] 以及生物学牙根工程提供了无限可能。2006年,Sonoyama等 从未发育完 全人牙根尖乳头中分离出来了另一种间充质干细胞,并命名为根尖牙乳头 干细胞stem cells from the apical papilla,SCAP,这种干细胞显示出了 不同 于DPSC的生物学特性,研究发现SCAP是根部成牙本质细胞的来源,在根 部牙本质的形成过程中发挥重大作用,对组织工程的发展具有深远意义。 1、根尖牙乳头干细胞及其特征1.1 根尖牙乳头干细胞的提出 各种因素引起的牙髓及根尖周炎症会造成年轻恒牙牙根发育的终止, 常规治疗手段是进行根尖诱导术,然而许多临床资料表明,仅仅对患牙进 行保守治疗而没有实施常规根尖诱导术的情况下牙根仍然会继续发育,甚 至达到根尖形成,这种形成的牙根会伴随牙根的延长和管腔的缩窄,即达 [2,11,12] 到了真正意义上的牙根形成 。这提示在没有发育完全的牙根端组织中-14- 第四军医大学博士学位论文 可能存在一种新的间充质干细胞,这种干细胞的生物学功能与牙根形成密 [7] 切相关。2006年,Sonoyama 等研究发现,借助在根尖牙乳突状组织和牙 髓之间的一层松散结构,根尖牙乳头能够容易地从根尖分离或剥脱(图1 A,C);组织学研究发现根尖牙乳头组织中整体包含的血管及细胞成分相对 牙髓组织少,在根尖牙髓组织和根尖牙乳头组织中间有一个非常明显细胞 富集区(图1 B)。 根尖牙乳头(人第三磨牙)的解剖示意图 图1 [6] 摘至 Sonoyama等 ,2008) ( 作者进一步研究发现人牙根尖孔外部的乳头状组织对间充质干细胞表 面分子STRO-1染色呈阳性,推测该区域可能存在干细胞或前体细胞。为了 证实这种假定的细胞,作者从成年人的第三磨牙根末端分离根尖牙乳头, 采用酶消化法从该组织中分离出细胞,这种细胞在低密度下培养时,能够 像其他间充质干细胞一样形成贴壁生长的克隆原细胞聚集,并具有成脂和 成骨等多向分化潜能。作者将这种细胞与HA/TCP结合植入免疫耐受小鼠皮 下,在HA/TCP表面可形成典型的牙本质样结构,这种新生的牙本质样结构 -15-第四军医大学博士学位论文 DSP染色阳性,作者将这种细胞命名为根尖牙乳头干细胞(SCAP)。对于 这样的一种在组织上与牙髓关系密切,且与 DPSC 具有相似的生物学特性 的细胞,多数学者均质疑其是否与DPSC为同一种干细胞?为此,Sonoyama [7] 等 通过了大量组织学、免疫组织化学、细胞学以及细胞分析等手段证实了 SCAP是不同于DSPCs的独立的成体干细胞,并提示其成牙本质分化能力较 DPSC更为强大。1.2 SCAP 的表面分子标记如表1所示,对第一代SCAP的检测发现近似 20%-30%的SCAP细胞 [17] STRO-1表达阳性,而DPSCs 的阳性表达率为5%-10% 。SCAP表达ALP, CD24, CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD166,其中CD24仅在 SCAP中表达,而在 DPSCs和骨髓基质干细胞Bone marrow? derived mesenchymal stem cells, BMMSCs中均不表达。对SCAP成骨诱导分化过程时, 另外, SCAP还表达高水平的 CD24的表达量可随着碱性磷酸酶的升高而下调; 凋亡抑制基因(survivin)和端粒酶逆转录酶 human telomerase reverse [8] transcriptase, hTERT 。相比BMMSCs, SHED和PDLSCs, SCAP表达的成骨、 成牙本质细胞标记以及生长因子受体的情况和DPSCs更为相似。尽管SCAP在 体外扩增时可以像DPSCs一样表达许多与牙本质发生相关的分子标记, 但研 究表明:SCAP所表达的牙本质涎蛋白dentin sialophosphoprotein, DSP, 胞外 磷酸糖蛋白基质matrix extracellular phosphorglycoprotein, MEPE, 转移生长因 子 β受体IITGF β-RII, 成纤维细胞因子受体3FGFR3, 血管内皮生长因子受 体1Flt-1, 成纤维细胞因子受体1FGFR1和MUC18等因子的水平低于DPSCs [8] 。 研究发现,SCAP在未受神经分化诱导状态下,可表达神经细胞分子标 记BIII tubulin,神经元烯醇化酶neuron-specific enolase, NSE,3-循环核苷 酸-3磷酸二酯酶glial markers 2’, 3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase, [7] CNPase和微管相关蛋白microtubule-associated protein,MAP2 ,而这些-16-第四军医大学博士学位论文 标记在未经神经分化诱导的DPSCs中不表达。在经神经分化诱导后,SCAP 还可表达微管相关蛋白 microtubule-associated protein, MAP2, 谷氨酸脱 羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD, NeuNNeuronal nuclear antigen, 神 经微丝Mneurofilament M, NFM和神经胶质标记2′glial markers 2 ′等神经 分子标记。 表 1SCAP 和 DPSC 生物学特性比较 PropertiesSCAP DPSCs 表面分子标记 CD29, 73,90,105,106,146, 166++CD24, β ? tubulin +-ALP, DSP, MEPE ++ +++TGF βR ? +/-+Survivin ,Htert ++ +bFGF ++ ++FGFR3 ++++Flt-1+/- +Flg,MUC18 ++ +++Nestin ++STRO-1表达阳性率18% 5% ~10%增殖能力BrdU吸收率 +++ 细胞迁移能力 +++ 端粒酶活性+++ 多向分化能力 成骨/成牙本质 ++生肌 ++软骨 ++成脂 ++ 神经 ++ 异位体内形成 牙髓牙本质复合体 ++ + 成牙本质样细胞+ + +- 表示阴性,+++,++及+代表高中低等级 1.3 SCAP的特征 目前,定义干细胞有2个:细胞具有自我更新能力和生成祖细胞昀 终分化为专能细胞。群体倍增数是代表干细胞自我更新能力的一个重要特-17-第四军医大学博士学位论文[17] 性。经研究发现SCAP的群体倍增能力较强,其群体倍增数达到了80 。另 [8] 外,Sonoyama 收集了同一个人的牙髓和未发育完成根尖牙乳头,将其在 结果表明,SCAP具有非常高的溴脱氧尿苷 严格一致的条件下培养并比较, bromodeoxyuridine,BrdU 吸收率;划痕测定细胞
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