非粮淀粉免蒸煮酒精发酵工艺的基础技术研究

非粮淀粉免蒸煮酒精发酵工艺的基础技术研究 第一章 绪论 第二章 传统酒精发酵工艺研究 2.1 淀粉液化工艺 2.1.1 α-淀粉酶活测定 l)酶活定义lg固体酶在70?，pH=6.0条件下，1min液化可溶性淀粉lmg， 即为1个酶活力单位以U?g-1示。 2)试剂配制 a.碘原液:称取碘11g，碘化钾22g于200mL烧杯中，加少量 蒸馏水溶解，再移入500mL棕色容量瓶中加水定容至刻度。b.稀碘液:取碘原 液1.00mL，碘化钾10g，加水定容至250mL;试剂随配随用。c.2%淀粉液:称 取烘至恒重的可溶性淀粉5g，移入250mL烧杯，用少量蒸馏水调匀，用100mL 沸水冲入250mL烧杯中，再加热煮沸至透明为止，冷却，加水定容至250mL， 配制后在室温保存条件下不超过48h。d.磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(pH=6.0): 称取磷酸氢二钠45.23g、柠檬酸8.57g，用水溶解并定容至1000mL，配好后用 pH计校正。 3)酶活测定 称取酶1~2g，先用少量pH=6.0的磷酸缓冲液溶解，并用玻棒 捣研，将上清液小心倒入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此研磨3~ 4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤， 滤液供测定使用。 取20mL2%的可溶性淀粉和5mL pH= 6.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液，放 于25mm×200mm大试管中，在70?恒温水浴中预热4~5min，然后加稀释好 的酶液0.5mL，立即记录时间。充分摇匀，定时用滴管取出反应液0.5mL，滴于 预先充满比色稀碘液的白磁板空穴内。当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色时，即 为反应终点，并记录时间。 4)酶活计算 (取20 mL 2,的可溶性淀粉和5 mL pH=5(5的磷酸氢二钠(柠檬酸缓冲液，放于25mmx20mm大试管中，在50?恒温水浴中预热10min，然后加稀释好的酶液1(0 mL，立即记录时间，准确反应5 min。立即吸取反应液1.0 mL加 入到5 mL稀碘液中，以稀碘液作空白，在660 nm波长下比色，迅速测定吸光度值，根据吸光度值查表，求得测试酶液的浓度(Ce)，通过计算出样品的酶活力。 酶活计算 X= Ce×n -1-1式中，X——样品的酶活力(U?mL); Ce一测试酶液的浓度(g?mL); n—样品稀释倍数。) 2.1.2 液化反应终点测定 测定液化反应终点(碘反应) 取淀粉液化液数滴，滴加碘液进行检测。 淀粉在α-淀粉酶的作用下，随着水解程度的加深，其碘色反应发生如下变化:蓝?紫?红?浅红?不显色(即碘原色)。 2.1.3 淀粉液化 称取50.0g薯干粉，按料水比1(g):3.0(mL)与水均匀混合于500mL 的三角瓶中，盐酸调节pH到5.5~6.9，加入10U/gα—淀粉酶，0.5g CaCl，于沸2水浴中液化1h(碘液检测反应终点)。 2.2 淀粉糖化工艺 2.2.1 葡萄糖淀粉酶活测定 糖化酶活力定义:1g 干曲在35?、pH4.6条件下，反应1h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖1mg 所需的酶量称为1个酶活单位(U/g)。 2.2.2 糖化反应终点测定 糖化终点测定(无水乙醇检验) 取糖化液数滴，滴入无水乙醇中，看是否生成白色絮状物。若无白色絮状物生成，表明糖化比较彻底。 2.2.3 淀粉糖化 盐酸调节淀粉液化溶液pH到4.0~4.5，自然冷却至 60?后，加入150U/g糖化酶，60?糖化1h(无水乙醇检测反应终点)。 2.3 淀粉糖化液酒精发酵 2.3.1 酵母培养 1) 菌种与培养基 菌种:酿酒酵母(实验室保藏)。 平板保藏及活化培养基(g/L):蛋白胨 20，酵母膏 10，葡萄糖 20，琼脂 20。 种子培养基(g/L):葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 10，自然 pH。(葡萄糖分开灭菌后再加入) 2)种子活化 接一环生长良好的斜面酵母至50 mL/250 mL 的培养基中，30?，100 r/min，于摇床上活化 24 h。 3) 种子培养基的摇瓶培养法 将活化后的种子液以10 %的接种量接入到 50 mL/250 mL 的种子培养基中，30 ?，100 r/min，于摇床上培养12 h。 2.3.2 酒精发酵 盐酸调节pH到4.8~5.0，加入0.5,尿素，其它营养因子，(高压灭菌)。待糖化醪液冷却至30?，加入10,酵母种子液和塞上发酵栓于30?静置发酵72h，取液体测量酒精的体积分数和糖含量。 第三章 球磨机械活化对酒精发酵的影响 3.1 球磨处理对淀粉颗粒性质的影响 3.1.1 淀粉颗粒表面形貌观察 将处理后淀粉样品置于105?烘箱中干燥4一sh，在红外灯下用导电胶将样品固定在样品台上，然后喷金，将处理后的样品保存于干燥器中。将待测样品置于扫描电子显微镜中观察，拍摄具有代表性的淀粉颗粒形貌(张本山，2005)。 为进一步研究辐照对淀粉内部分子结构的影响，将处理后的淀粉用水浸泡后再进行扫描电镜观察。具体操作过程:称取10g处理后的淀粉，加入到90mL蒸馏水中，室温下浸泡1h后离心收集沉淀物，室温晾干后按上述步骤进行颗粒形 貌分析。 3.1.2 晶体特性测定和晶度计算 3.1.3 淀粉颗粒偏光性的测定 3.2 球磨处理对淀粉微观结构的影响 3.2.1 分子聚合度的影响 称取淀粉样品20mg加入0.5mL无水乙醇润湿样品，加入2mol/mL的KOH溶液1mL，使样品充分溶解。加入10mL去离子水，用0.1mol/mL的HCl溶液将pH值调至6.0,7.0，加水定容至50mL。取10mL于100mL容量瓶，加入80mL去离子水和2mL I-KI溶液(I 2mg/mL和KI 20mg/mL)，定容至100mL，立即混匀。用紫外分22 光光度计扫描，波长450,800nm。 采用紫外-可见分光光度计进行扫描波长范围为450~80 0 nm，测定最大吸收峰;淀粉是不同分子质量同系的混合物，所以表示时用平均聚合度(DP)。根据 [i]Banks公式?: 10.01025,，0.001558 ? ,maxDP 3.2.2 分子基团的影响 (1)红外光谱分析法 称取约0.008g淀粉样品，与0.8g光谱纯KBr研磨均匀，105? 烘干后压制成透明的薄片，放入样品架上，置于红外光谱仪内全波段扫描，电脑自动绘制红外光谱图。 (2)核磁共振分析法 称取约0.01g淀粉样品，溶于DO (重水) 中，置于核磁共振仪，得到相应2 113的氢谱 (HNMR) 和碳谱 (CNMR)。 (3)基团含量 羟基含量测定采用羟胺法 (高嘉安，2001) 测定羟基含量。 1)羟胺试剂的配制 将25.00g盐酸羟胺 (分析纯) 溶于蒸馏水中，加入0.5mol/L NaoH溶液100mL，加蒸馏水稀释到500mL。此溶液不稳定，过2天应重新配制。 2)测定步骤 称取过60目筛的淀粉样品5.000g (绝干) ，放入烧杯中，加100mL蒸馏水煮沸，使淀粉完全糊化。冷却至40?，调pH至3.2，无损地移入500mL带玻璃塞三角瓶中，精确加入60mL羟胺试剂，加塞，在40?水浴中保持4 h。用 0.1000mol/LHCI溶液快速滴定到 pH3.2，记录消耗的体积(mL)数。称取同样质量的原淀粉进行空白滴定。根据下式计算羟基含量: 羧基含量测定 参照国际标准ISO11214 (1996) 测定羧基含量。称取约5.00g样品，加入25mL 0.lmol/L HCI溶液，搅拌20min后用多孔漏斗过滤，经蒸馏水洗至无氯离子的淀粉转至500mL烧杯中，加300mL蒸馏水，在沸水浴中加热煮沸20min，趁热以酚酞作为指示剂，用0.05mol/L Na0H标准溶液进行滴定至酚酞终点，记下消耗的体积V。用原淀粉作空白试样，不需抽滤和洗涤，经糊化后用碱滴定，l 消耗的体积为V。根据下式计算羧基含量: 2 3.2.3 直链分子含量的影响 (1)试剂及仪器: 2 mol/L HCl, 100 mL: 16.716 mL ,37% 浓HCl; 无水乙醇; 0.1 mol/L HCl, 100 mL: 5 mL 2 mol/L HCl; 0.1 mol/L NaOH, 100 mL: 0.4 g NaOH; 0.5 mol/L NaOH, 100 mL: 2 g NaOH; I-KI(碘试剂)，100 mL:2 g KI溶于水中后，加0.2 g I。2 2 标准品:直链淀粉、支链淀粉标准品购于Fluka公司。 仪器:pH计;分光光度计;分析天平; (2)步骤: 标准曲线的绘制:取50 mg支链淀粉标准样品，加入50 ml容量瓶中，加入1 mL无水乙醇润湿，再加10 mL 0.1M NaOH，沸水浴振荡加热10 min溶解淀粉，用蒸馏水定容摇匀。用同样方法配制直链淀粉标准溶液。精确吸取标准溶液于50 mL容量瓶中，按表所示比例混合: 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 直链淀粉/mL 0 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 支链淀粉/mL 2.5 2.3 2.2 2.1 2 1.9 1.8 0 直链淀粉含量/% 0 8 12 16 20 24 28 100 向各容量瓶加20 mL蒸馏水，用0.1M HCL调pH值为3.0。再加入0.5 mL I-KI2(碘试剂)，定容摇匀，静置10 min，在620 nm下，测吸光度(以蒸馏水作参比溶液)，绘制标准曲线。 样品测定:准确称取样品100 mg, 加1 mL无水乙醇，润湿振荡，再加10 mL 0.5 M NaOH，沸水浴加热溶解10 min，冷却后用蒸馏水定容摇匀得样品液。吸取2.5 mL样品液于50 mL容量瓶中，加20 mL 蒸馏水后用0.1 M HCl调pH值为3.0，加0.5 mL I-KI，定容摇匀，静置10 min。在620 nm下，测吸光度。并用标准曲2 线计算直链淀粉含量。 3.3球磨处理对淀粉理化性质的影响 3.3.1 颜色的影响 3.3.2 溶解度和膨胀度的影响 精确称取淀粉1.0000g(干基，记做m)于l00mL容量瓶中，在25?和40? 水浴锅中预热，再加入50mL对应温度的蒸馏水，快速振荡混匀并持续 30min。 然后用流水快速冷却至室温，立即以3000r/min离心20 min。小心将上清液倒出， 取上清液水浴蒸干，于105?烘干至恒重后称重，即得到被溶解的淀粉量，计算 出其溶解度。由离心管中膨胀淀粉的重量计算其膨胀度，溶解度和膨胀度计算公 式如下: 3.3.3 酸度的影响 称取6.0g样品，放入400mL烧杯中，加入194mL蒸馏水，搅拌使样品分散， 并把烧杯置于沸水浴中，搅拌淀粉乳直至糊化在冷水浴中立即冷却到室温(大约 25?)，在淀粉糊中插入已标定好的电极，待读数稳定后，记录pH值至0.1个pH 单位(张燕萍，2001)。 3.3.4 总糖、还原糖含量的影响 1)称1g处理后淀粉样品，加蒸馏水15mL，再加6mol/L盐酸，沸水浴加热30min后，加碱中和，定容至100mL，离心，取上清液用DNS法测总糖(董晓燕，2003)。 2)取处理后淀粉溶液/水解液，8000r/min下离心15min，取上清液，利用生物传感分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。 3.3.5 糊化特性的影响 采用粘度计进行快速测定，用TCW软件分析。根据中华人民共和国粮食行业标准(2002)#操作#，淀粉样品含水量为14%时，样品量为3.00g，蒸馏水25.00mL。具体加温过程如下:50?下保持1min，以12?/min的速度上升到95?(3.75min);95?下保持2.5min;以12?/min下降到50?(3.75min);50?下保持 2min。搅拌器初始10s内转速为960r/min，之后维持在160r/min 3.3.6 热力学特性的测定 用差示量热扫描法测量不同淀粉的热特性。具体方法:用样品铝盒称取约 4.0mg样品，按质量比为1:2的比例加入去离子水，密封后放置平衡4h，以空盒作为参比，30?加热扫描至100?，扫描速率为5?/min，样品室氮气流量为30mL/min。(赵凯，2004) 3.4 球磨处理淀粉的液化、糖化工艺 3.5 球磨处理淀粉酒精发酵 第四章 等离子体对酒精发酵的影响 3.1 等离子体处理对淀粉微观结构的影响 3.2 等离子体处理对淀粉理化性质的影响 3.3 等离子体处理淀粉的液化、糖化工艺 3.4 等离子体处理淀粉酒精发酵 第五章 球磨、等离子体复合技术对酒精发酵的影响 第六章 发酵过程耗能与经济性分析