去负荷比目鱼肌膜离子通道的变化及其意义

去负荷比目鱼肌膜离子通道的变化及其意义 第四军医大学 硕士学位论文去负荷比目鱼肌膜离子通道的变化及其意义 姓名:冯汉忠 申请学位级别:硕士 专业:航空、航天与航海医学 指导教师:余志斌 20040501 ,(,‟,,,,, 藿簏饿毒鼍 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本,声明所呈交的论文是藐个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了交中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或,,八已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不宴之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签各:互马进日期:趔重;, 保护翅识产概声嚼 本八完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在较攻读学位期问论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本八保证毕业离枝后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内客(含电子版，保密内容除，,)，可以采用影印，缩印或其他夏斛手段保存论文。学校有积允许论文谖查阏和借阋，并在较园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作者签各:,丕醛盛导师签名:金圭亟日期:型里堡鸟 常见缩略词语表,, ,,,, ,,,,,, 体重,,, ;,,,,,,,;,,,,,, ,,,, 横截面积,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,, 二氢吡啶受体,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, 发展张力,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, —,,,, ,,,,, ,,;,,, , 胰岛趾长伸肌，,,(, ,,,,,, 素样生长因子,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,, 最适初长,,,, ,,,,,,,?,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, 丝裂原激活的蛋白激酶,,, ,,,,,, ,,,,, ;,,,, 肌球蛋白重链,,,, ,,;,,,, ,,;,,, ,,,;,,,,,,, , ,,,，, 活化,细胞的核因子,,, ,,,,,,,,,, 硝苯地平,, , ,,,,,,; ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,, 强直收缩第,,秒处 ,,;,,, 的收缩张力,, ,,,,,,， ,,,,,,; ;,,,,,;,,,, 强直收缩最大张力 ,,,,,,,,, ,,,,,,， ,,,,;, ;,,,,,;,,,, 等长收缩最大张力 ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, 静息张力,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,, 雷诺啶受体,, ,,,,,,,—,,,,,, ,,,, ,,大鼠,,, ,,,,,, 比目鱼肌,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, 肌浆网,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,,,,, 达到最大张力的时间,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,, 从最大张力到,,,舒张的 ,澹欤幔 幔簦椋铮?时问～ ～:一』墼墼坠兰罂圭竺些,竺耋皇～～: 硕士学位论文摘要 去负荷比目鱼肌膜离子通道的变化及其意义 ::—～，。～巴 第四军医大学航空航天生理学教研室 硕士研究生: 冯汉忠 导 师: 余志斌教授 航天失重或模拟失重能够引起下肢肌肉特别是抗重力肌发 生废用性萎缩，并使肌肉的收缩力降低，疲劳性增加。随着载人 航天活动的发展，航天飞行时间越来越长，抗重力肌废用性萎缩 引起的强直收缩疲劳性增加，使航天员运动易疲劳的感觉更加明 显，限制了飞行时间和工作效率，在应急逃生时肌肉发生损伤的 可能性增大，且影响返回地面重力环境后的再适应能力。因此， 亟待探明萎缩骨骼肌 强直收缩功能降低的机理。这对长期载人航 天中发展更为有效的对抗措施起促进作用，而且对下肢石膏制 动、长期卧床与外周或中枢神经损伤等病入骨骼肌萎缩的防治与 康复亦具有参考价值。 模拟失重萎缩比目鱼肌(,,,)高频强直收缩的疲劳性增加， 其机理可能涉及肌纤维膜与,管,,，、,，通道、,,—,泵和,型 钙离子通道的功能的改变。萎缩使,,,肌纤维,管内,，更易集 聚(,,，更易耗竭，动作电位由,管向内传导易受到阻滞，从而 使,型钙离子通道功能受抑制。由于,型钙离子通道功能受抑 制，使其,,,,表达上调，以代偿功能的降低。这样，可能使 得萎缩比目鱼肌细胞内钙离子水平升高，细胞内钙离子静息浓度 的增加一方面激活;,,,,,,，增加收缩蛋白的降解，使肌肉萎缩; ‟ 第四军曩:大,明孤士掌位论文另一方面通过激活钙调神经磷酸酶，增加快型,,,基因的表达，使骨骼肌肌球蛋白重链(,,,)发生由慢型向快型的转化。为验证这一设想，本研究采用大、小鼠尾部悬吊模型模拟失重状态，用离体骨骼肌肌条灌流观测收缩功能的变化，并采用,,,—,,,,与,,(,,,技术，观测比目鱼肌,,,异构体的表达。主要研究结果为:,(建立小鼠尾部悬吊模型 仿大鼠尾部悬吊的方法，依小鼠特点，经适当改进，建立可进行为期,周的尾部悬吊小鼠模型。,(尾部悬吊,周小鼠,,,明显萎缩 尾部悬吊,周小鼠,,,重量与体重之比降低了,,(,,?,(,,,(,,,(,,)，且与尾部悬吊,周大鼠比目鱼肌萎缩的程度一致(,,(,,?,(,,,)。尾部悬吊,周小鼠,,,的横截面积亦呈显著降低(,,, ,(,,士,(,, ,,(,,,,(,,士,(,, ,,,，,,,(,,)，但肌肉长度无明显改变。,(尾部悬吊，周小鼠,,,等长收缩时程缩短尾部悬吊，周小鼠,,,等长收缩的静息张力与最大张力(,,)均未发生显著变化;但达到最大张力的时间(,,,)明显缩短，从,,(,,?,(,, ,,缩短到,,(,,?,(,,,,(,,,(,,):从张力峰值到,,,舒张的时间也呈缩短的趋势(,,, ,,(,?,(,,雌,,, ,,(,,?,(,, ,,，,,,(,,)。,(尾部悬吊,周小鼠,,,高频强直收缩疲劳性增加 悬吊,周小鼠,,,强直收缩最大张力(,,)较对照组降低,,，但没有显著差别(,,,(,,)。对照组小鼠,,,的强直收缩张力在第,, ,处衰退到,,(,,?,(,,,，而悬吊,周组则衰退到,,(,,?,(,,,(,,,(,,)，即悬吊,周小鼠比目鱼肌高频强直收缩的疲劳性明显增加。,(尾部悬吊,周小鼠,,,高频强直收缩后恢复时间缩短 在高频刺激引起强直收缩后。以单次等长收缩恢复至强直收缩前的张力所需的时间，在悬吊,周小鼠显著短于对照组(,,, ,,(,,士,(,,,,(,,, , ,,,,士,(,, ,,,,，,,,(,,)。 , 第四军墨:大掣？孤士掌位论文,(高钾溶液灌流下，悬吊,周小鼠,,,高频强直收缩的疲劳性增加 在,, ,,,,,,高钾灌流下，悬吊,周组与对照组的,,之间无显著差别(,,,(,,)，而悬吊组的,,,,,,则呈非常显著性降低(,,,(,,)，即疲劳性增加。,(低钠溶液灌流下，悬吊,周小鼠,,,高频强直收缩的疲劳性降低 在,, ,,,,,,低钠灌流下，对照组比目鱼肌高频强直收缩的,,,,,,呈非常显著的降低(,,,(,,)，而在悬吊组则增高,尸,,(,,)。,(硝苯地平溶液灌流下，悬吊,周小鼠,,,高频强直收缩的疲劳性明显降低 在,, ,,,,,, ,(型钙离子通道阻断剂硝苯地平灌流下，对照组与悬吊,周组高频强直收缩的,,均无显著改变(,,,(, ,)，两组的,,,,,,呈显著性增加(,,,(,,)，且悬吊,周组的, , ,,,,增加较对照组更显著(,,,,(,,)。,(硝苯地平全身给药对大鼠,,,与趾长伸肌质量均未产生影响每天经饮水给予对照和悬吊大鼠,, ,,,,,体重的硝苯地平，分别给药,或,周。对照与用药,周或,周对照组间，,,,与趾长伸肌的质量均无显著差别。悬吊,或,周组与悬吊并用药组间，,,,与趾长伸肌的质量也无显著差别(,,,(,,)。,,(硝苯地平在转录水平抑制，，型,,,的表达，并抑制悬吊大鼠,,,慢型,,,向快型异构体的转化,,(,,,结果显示对照大鼠比目鱼肌仅可检测到,,, ，与，，, ,,,,的表达，萎缩比目鱼肌出现,,, ，，,与，，, ,,,,的表达。硝苯地平可抑制对照大鼠比目鱼肌,,, ，，, ,,,,的表达，并可部分抑制萎缩比目鱼肌,,, ，向,,, ，，,的转换，还可抑制,,, ，，,与，，, ,,,,的表达。,,,(,,,,结果表明，大鼠口服硝苯地平,与,周，可明显抑制对照大鼠比目鱼肌中,,, ，，,的蛋白表达水平，并能抑制悬吊大鼠,,,由，型向，，,型的转化。 上述结果表明:尾部悬吊,周小鼠与悬吊,周大鼠,,,萎 , 第四军医大掌硕士掌位论文缩程度相一致。萎缩,,,疲劳性的增加可能与肌纤维膜上,，通道的改变有关，,,，变化对疲劳性的影响不明显。推测,,,高频强直收缩时，肌纤维,管内易发生,，积聚，使疲劳性增加，萎缩,,,则通过对,,—,,交换的抑制、,,，，,,,,,,,酶活性增强与,—,,,，通道易于变构，代偿其疲劳性的增加。硝苯地平变构,一型钙离子通道引起的细胞内钙离子浓度增加，并未参与对,,,质量的调节，但抑制萎缩,,,的,,,异构体由慢型向快型的转化。 总之，本研究初步提示，萎缩,,,肌纤维膜,，通道的改变，是引起其强直收缩疲劳性增加的主要因素，代偿性的引起,—,,”通道易于变构，进而调节,,,异构体的表达。关键词: 模拟失重，大鼠，小鼠，比目鱼肌，等长收缩，高频强直收缩，疲劳性，硝苯地平，钾离子通道，钠离子通道，钙离子通道，肌球蛋白重链 第四军医大掣蝎蕊士掌位论文 ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ，,, ,,,,,,,, ，, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,，, ,,,,,，,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,:,,,, ,,,—,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,(,, ,,,—,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,,,,, ,,‟,, ,,,,,,，,(,(,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,, ,,,,,,,，,, ,,,,;, ;,,,,,;,,,, ,,,;,,,,，,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,(,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,;, ,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,，,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,, ,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,;, 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,,,,, ;,,,, ,, 一、前 言 (一)研究意义 航天失重或模拟失重能够引起骨骼肌，特别是抗重力肌发生废用性萎缩变化，使肌肉的收缩力降低，疲劳性增加。随着载人航天活动的发展，航天飞行时间越来越长，抗重力肌废用性萎缩呈现的高频强直收缩疲劳性增加，使航天员运动易疲劳的感觉更加明显，严重限制了飞行时间和降低了工作效率，航天员应付紧急情况时肌肉发生损伤的可能性增大，也影响返回地面后对重力环境的再适应能力。因此，必须尽快探明骨骼肌强直收缩功能降低的机理，以制定更为有效的对抗措施。目前发现失重或模拟失重条件下，骨骼肌高频强直收缩的疲劳性增加与其蛋白含量降低在出现时间上不同步，可见收缩蛋白的降低可能并不是疲劳性增加的直接原因。而动作电位在,管内的传导阻滞是引起高频强直收缩疲劳的重要因素，动作电位在,管内的传导则受膜 离子通道特性的影响，因此本研究重点观测萎缩骨骼肌膜离子通道特性变化对强直收缩功能的影响。若能阐明这一问，对长期载人航天活动中制定新一代对抗措施可能具有参考作用，而且在下肢石膏制动、长期卧床、外周或中枢神经损伤、长期使用肾上腺皮质激素、败血症和肿瘤等病人骨骼肌萎缩的防治与康复中，亦具有一定的应用价值。 (二)国内外研究现状 对航天失重或模拟失重引起下肢骨骼肌特别是抗重力肌单次收缩功能降低的现象已基本阐明。目前，我室高放研究了尾部悬吊模拟失重下，大鼠萎缩骨骼肌强直收缩疲劳性的动态变化。发现随着尾部悬吊时间的延长，大鼠比目鱼肌(,,,)高频强直收缩最大张力逐渐降低，其强直收缩的疲劳性亦逐渐增加，引起完全强直收缩的刺激频率向较高频率转化。 第四军医大掌司,士掌位论文 骨骼肌高频强鸯收缩的疲劳性与,管膜动作电位传导阻滞相关，而,管内,，、,,，和,型,,,，通道的功能状态直接影响动作电位受阻滞的程度与兴奋一收缩偶联。因此，失重和模拟失重下，骨骼肌疲劳性增加，可能与,管内,，、,,，和,,,，的通道性质的改变有密切关系。 一、骨骼肌高频强直收缩的疲劳性与,管膜离子通道特性之间的联系 骨骼肌强直收缩的类型，根据给予刺激形式的不同，可分为两种:高频强直收缩(,,,,,,,,？,,,;, ,,,,,,; ;,,,,,;,,,,)和间断性强直收缩(,,,,,,,,,,,, ,,,,,,; ;,,,,,;,,,,)„,。,…,„,,“，。„,„,, ,,引。间断强直收缩疲劳是在体情况下经常发生的疲劳形式，而高频强直的疲劳类型在机体正常情况下不常见，但作为一种疲劳模式，对研究骨骼肌疲劳的分子机制还是有帮助的。在持续高频刺激下，骨骼肌收缩力通常在,, ,内迅速下降，并在此过程中动作电位的峰值降低、时程延长、在每次新的动作电位到达前，膜去极化到一,, ,,左右，动作电位在,管内的传播受阻。 以往的研究表明，动作电位在,管内的传导阻滞是引起高频强直收缩疲劳的重要因素。高频刺激时，,管系统局部会出现,，的堆积和,,，减少，进而阻滞动作电位在,管内由外向细胞中心部位传导，使电压依赖性的,型钙离子通道的激活降低，导致肌浆网雷诺定受体(,,,,,,,,, ,,;,,,,,，,,,)释放钙离子减少，最终导致强直收缩张力下降„”。,„。小,,,“，。…?, ,,?。刺激频率越高，越容易在,管内形成,，的堆积和,,，耗竭，越容易导致强直收缩张力的下降。 高频刺激引起的动作电位在,管的传播减弱，主要取决于以下几个因素:,)刺激频率:,),管膜上钠和钾离子通道的密度;,),管膜中,,,,,,，泵的密度与活性;,),管系统的容量;,)在细胞膜表面上,管展开的表面积。,管内离子浓度的改变可引 , , 第四军医大掌硕士掌位。沦‟丈起高频刺激时收缩力降低。第一，,，累积可阻滞膜的去极化和使,,，通道失活，最终导致强直收缩力降低;,,,,研究细胞外液中,，很小量的增加就可导致强直收缩力降低，,,。，,,,钔。第二，,,，减少会降低动作电位的峰值，若降低很明显，则会减少肌浆网中的,,”的释放。,,,,,,,,,等研究指出细胞外液中,,，减少，强直收缩力会出现很快的下降„,…川, ,，。„,, ,,,,,。此外，,,,,,,,,,,等的研究表明，在持续高频刺激时，肌纤维,管系统中央部,,”浓度比纤维边缘低，因而推测纤维中心部位,,,，释放减少【,。…,„,。“?。„,,,,,,,。当刺激频率降低后数秒内，这种;,,，分布的差别即消失，同时张力增加。因此，动作电位在,管内的传导阻滞是引起高频强直收缩疲劳的重要因素。 二、失重，模拟失重下萎缩比目鱼肌的高频强直收缩疲劳性增加与离子通道的改变 骨骼肌萎缩后，从肌纤维表面到中心部位的距离减小，,管的长度可能变短，这有利于,管内离子与细胞外液进行交换，应该使肌肉疲劳性降低。而萎缩,,,在高频强直收缩时的疲劳性反而明显增加，我们推测机制可能主要涉及,,，和,，通道的特性以及,管中,,，(,，泵的活性。因此，尾部悬吊使,,,萎缩，可能影响其细胞膜上,,，和,，通道和,,”通道的特性，从而导致其高频强直收缩的疲劳性增加。已有的萎缩骨骼肌离子通道的研究报道，大鼠废用性萎缩的比目鱼肌细胞钠电流密度明显增 ,,，。„,, ,,加，并同时伴有,,，通道,(亚基表达的增加〔,,,,,“, .